缺鐵孕鼠子代肝臟EPO及EPOR的mRNA表達(dá)及意義

邱智楓 ，桑璐 ，李佳斯 ，王維 ，劉穩(wěn) ，馬雅靜 *

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2北京懷柔醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 101400；3漣水縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 淮安223400；4石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 石河子 832000）

缺鐵被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)最流行的微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥之一，是全世界最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題。鐵缺乏癥是指機(jī)體對(duì)鐵的需求與供給失衡，導(dǎo)致體內(nèi)儲(chǔ)存鐵耗盡，而紅細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏，最終發(fā)生缺鐵性貧血。全球估計(jì)有3200萬(wàn)孕婦和2.73億5歲以下兒童處于貧血狀態(tài)，造成嚴(yán)重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究表明，圍產(chǎn)期死亡率和不良出生結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加與婦女在懷孕期間患缺鐵性貧血有關(guān)，25%的子代出生后發(fā)育遲緩可歸因于胎兒生長(zhǎng)受限，而母親孕期貧血是導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限和早產(chǎn)的主要因素[2]。在懷孕期間，胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層必須將母體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒循環(huán)中以滿(mǎn)足胎兒生長(zhǎng)和發(fā)育的鐵要求。孕期缺鐵，胎兒未能從母體中獲取足夠的鐵，使得嬰兒出生后發(fā)生營(yíng)養(yǎng)性缺鐵性貧血及低出生體重、生長(zhǎng)發(fā)育受限。

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種分子量為34kDa，在胎兒時(shí)期由肝臟合成，成年后由腎皮質(zhì)小管周?chē)衫w維細(xì)胞合成分泌的糖蛋白[3]，是具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物紅系祖細(xì)胞存活、增值、分化的主要激素。在缺鐵導(dǎo)致機(jī)體低氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子可上調(diào)、活化EPO，EPO通過(guò)骨髓紅系祖細(xì)胞上的表面受體 EPOR（erythropoietin receptor，EPOR）介導(dǎo)活性，促進(jìn)紅細(xì)胞生成，從而發(fā)揮其造血功能，有效緩解貧血。哺乳動(dòng)物體內(nèi)80%的鐵參與EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的過(guò)程。

國(guó)內(nèi)外較少研究EPO及EPOR在缺鐵大鼠子代組織中的表達(dá)情況，因此，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺鐵性孕鼠新生子代肝臟中EPO及EPOR的基因表達(dá)，觀察缺鐵性貧血對(duì)大鼠子代鼠肝臟中EPO及受體EPOR的mRNA表達(dá)水平的影響，并探討其變化意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

從新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2013-0001]購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)Wistar雌性大鼠36只及雄性大鼠18只，體重為60±5 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將36只雌性大鼠分為2組，實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠18只，對(duì)照組雌性大鼠18只。造模干預(yù)成功后取其后代仔鼠肝臟組織，置于凍存管中，保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（廣東邁瑞，型號(hào)BC6800）及配套的試劑；鐵染色試劑盒（上海太陽(yáng)）；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（北京天根）；核糖核酸提取液Trizol（美國(guó) Life）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本 TaKaRa，RR037A）；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒（德國(guó)QIAGEN）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（中國(guó)泰普，型號(hào)TIB-8000）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

將36只雌性Wistar大鼠與18只雄性Wistar大鼠置于室溫控制在18-25℃，相對(duì)濕度為40%～60%的動(dòng)物室中飼養(yǎng)，并保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜、干凈、通風(fēng)干燥。雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，在每個(gè)不銹鋼鼠籠中放置3只大鼠。自由采食普通飼料和去離子水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將36只雌性大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，18只/組。實(shí)驗(yàn)組飼喂不添加鐵元素配制的飼料，對(duì)照組飼喂添加鐵元素的飼料，喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)缺鐵性貧血。具體配制方法參考呼延武[4]等配方。

4周后將雌雄大鼠以2∶1合籠，通過(guò)觀察陰栓，確認(rèn)受孕后雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)。母鼠繼續(xù)飼養(yǎng)對(duì)應(yīng)的飼料至分娩。

1.3.2 大鼠造模期間血常規(guī)測(cè)定

內(nèi)眥靜脈采血1～2 mL，全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)全血中的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、紅細(xì)胞比容(hematocrit，HCT)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width，RDW)等血液學(xué)參數(shù)。

1.3.3 新生仔鼠形態(tài)觀察

比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組孕鼠所生每窩仔鼠的個(gè)數(shù)和外觀，包括體型、毛發(fā)、色澤、行動(dòng)力等。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)子代組織EPO、EPOR含量

取新生仔鼠肝臟組織，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，用1 mLTrizol提取液提取50-100 mg組織中RNA。根據(jù)日本TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

檢測(cè)基因EPO的引物序列參數(shù)：上游5‘-CCAGAGCAGGAGAGACTGAGAGA-3’，下游 5‘-CGTCCTTGACTACATAGCGAGTTC-3’，產(chǎn)物大小 101 bp；

EPOR基因的引物序列參數(shù)：上游5‘-CACCTACCTGGTATTGGATGAATG-3’，下游 5‘-ATCCATAGTCGCAGGGTCTACAC-3’，產(chǎn)物大小 97bp；

內(nèi)參基因GAPDH的引物序列參數(shù)：上游5‘-CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3’，下游 5‘-GCCAAATCCGTTCACACCG-3’，產(chǎn)物大小 101 bp。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性 5 s，60℃退火延伸 10 s，40個(gè)循環(huán)。

根據(jù)相對(duì)定量分析公式2-△△Ct計(jì)算樣本對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，若兩組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）血液參數(shù)比較：

造模前，實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠和對(duì)照組雌性大鼠的血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)（HB、HCT、MCV、MCH、RDW）沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表 1）。

表1 造模前兩組雌性大鼠血液學(xué)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of hematological parameters of female rats before modeling

實(shí)驗(yàn)組經(jīng)造模后，實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠出現(xiàn)缺鐵引起的缺鐵性貧血，與對(duì)照組相比，其血常規(guī)中的HB、HCT、MCV、MCH等指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降，并明顯低于對(duì)照組（P＜ 0.001），RDW則升高（P＜0.001）（表 2）。

表2 造模后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血液學(xué)參數(shù)比較Tab.2 Comparison of hematological parameters between experimental group and control group after modeling

（2）新生仔鼠形態(tài)觀察（圖1）

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組仔鼠外觀比較Fig.1 Comparison of the appearance of newborn rats between the experimental group and control group

實(shí)驗(yàn)組孕鼠所生仔鼠窩仔數(shù)少，且仔鼠的體型較小，四肢和軀干皮膚蒼白，動(dòng)作遲緩，新生仔鼠出現(xiàn)缺鐵性貧血癥狀。與實(shí)驗(yàn)組相比，而對(duì)照組大鼠的仔鼠活胎數(shù)和存活數(shù)量較多，存活的仔鼠體型也較大，皮膚和四肢較紅潤(rùn)（表3、圖1）。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每窩仔鼠數(shù)量比較Tab.3 Comparison of the number of littermates in the experimental group and control group

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EPO、EPOR

如圖2和表4示，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組新生仔鼠肝臟EPO mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而兩組仔鼠肝臟組織EPOR mRNA表達(dá)沒(méi)有差異（P＞0.05）。

表4 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟中EPO、EPOR表達(dá)水平Tab.4 Detection of the level of EPO and EPOR expressions in neonatal pups liver by real-time quantitative PCR

圖2 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟中EPO、EPOR表達(dá)Fig.2 Detection of the EPO and EPOR expressions in neonatal pups liver by real-time quantitative PCR

3 討論

鐵是人體必須的營(yíng)養(yǎng)素，鐵和卟啉合成血紅素，參與血紅蛋白的合成，還在正常細(xì)胞功能的各方面中都發(fā)揮著重要作用，包括參與線(xiàn)粒體的電子傳遞，調(diào)節(jié)很多細(xì)胞周期調(diào)控分子。鐵的耗竭會(huì)導(dǎo)致DNA合成障礙，細(xì)胞周期從G1期進(jìn)人S期阻滯，細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。

妊娠期貧血是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，特別是在亞洲，調(diào)查顯示，全球孕婦貧血患病率為41.8%，超過(guò)5600萬(wàn)婦女受到妊娠期貧血的影響，貧血母親所生的嬰兒即使在出生時(shí)并不貧血，他們出現(xiàn)日后貧血的風(fēng)險(xiǎn)依然較高，中、重度貧血的母親甚至?xí)斐商簩m內(nèi)發(fā)育受限、宮內(nèi)窘迫和早產(chǎn)，這可能是由于胎盤(pán)供氧、供血不足導(dǎo)致的[6]。

胎兒鐵的儲(chǔ)備量依賴(lài)于母體鐵儲(chǔ)備，而且嬰兒期和幼兒期對(duì)鐵的需求量是最大的，但是嬰幼兒時(shí)期的飲食往往缺乏鐵質(zhì)，導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)生缺鐵性貧血。本研究成功制備缺鐵性貧血模型，并檢測(cè)EPO及EPOR在缺鐵子代肝臟組織中表達(dá)變化，以探討其在缺鐵新生子代造血方面中的意義。

（1）低鐵對(duì)血液學(xué)參數(shù)及大鼠生殖機(jī)能的影響。

體內(nèi)的鐵供應(yīng)不足、吸收過(guò)少或消耗過(guò)多時(shí)，可引起鐵缺乏，而鐵缺乏到了一定的程度，機(jī)體無(wú)法正常生產(chǎn)紅細(xì)胞從而出現(xiàn)貧血時(shí)，即導(dǎo)致缺鐵性貧血，缺鐵性貧血屬于小細(xì)胞低色素性貧血，會(huì)表現(xiàn)出紅細(xì)胞分布寬度增高，而血紅蛋白、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度均減低的表現(xiàn)[7]。

大鼠血紅蛋白參數(shù)為 148（120～175）g/L，我們通過(guò)低鐵飼料干預(yù)，制造大鼠鐵缺乏模型，實(shí)驗(yàn)組Hb低于大鼠Hb參考值范圍下限，且明顯低于對(duì)照組（P＜ 0.001）。HCT、MCV、MCH 等指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降，而RDW升高，大鼠缺鐵性貧血模型制備成功。孕婦缺鐵性貧血可導(dǎo)致早產(chǎn)兒增加、胎兒低出生體重，小兒會(huì)生長(zhǎng)發(fā)育障礙，智力發(fā)育障礙[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組孕鼠所生仔鼠數(shù)量少，且仔鼠體型小，四肢和軀干皮膚蒼白，動(dòng)作遲緩，出現(xiàn)缺鐵性貧血癥狀，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

（2）EPO在缺鐵仔鼠肝臟中的表達(dá)及其作用。EPO是在機(jī)體缺鐵導(dǎo)致缺氧時(shí)，胎兒時(shí)期由肝臟產(chǎn)生，成人時(shí)期由腎臟產(chǎn)生的，在血漿中循環(huán)并與紅系祖細(xì)胞上大量表達(dá)的EPO受體結(jié)合，從而促進(jìn)紅細(xì)胞前體的存活、增殖和終末分化，導(dǎo)致紅細(xì)胞增加，血液的攜氧能力增強(qiáng)，增加組織氧張力，從而完成反饋調(diào)節(jié)，抑制EPO的進(jìn)一步表達(dá)。

蔣斕[9]研究中，低鐵仔鼠肝臟EPO表達(dá)呈增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而本研究中缺鐵仔鼠肝臟EPO水平顯著升高（P＜0.01），可能與母鼠缺鐵程度有關(guān)，本研究低鐵干預(yù)時(shí)間較早，由于母鼠貧血程度較嚴(yán)重，血液中攜氧能力下降，子宮肌層缺血、缺氧，氧氣供應(yīng)中斷或貧血低氧條件下，未能滿(mǎn)足胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的要求，造成宮內(nèi)缺氧。

缺氧時(shí)EPO不能通過(guò)胎盤(pán)，胎兒體內(nèi)EPO主要由肝臟合成，因?yàn)榧铀傺t蛋白合成需要增加鐵量，胎兒鐵優(yōu)先從胎兒組織庫(kù)轉(zhuǎn)移到紅細(xì)胞產(chǎn)生中，以增加紅細(xì)胞的數(shù)量，從而增加攜氧能力[10]，這可能是本研究中新生仔鼠肝臟EPO表達(dá)升高的原因。

曾報(bào)道EPO在造血系統(tǒng)以外的功能，包括脂肪堆積和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的代謝調(diào)節(jié)。Dey等[11]曾報(bào)道，高劑量的EPO在增加紅細(xì)胞壓積的同時(shí)，還減輕小鼠體重、脂肪堆積，減少食物攝入量并增加能量消耗，而在非造血組織中敲除EPOR后，小鼠變得肥胖并且能量消耗下降。他們還認(rèn)為EPO可以通過(guò)控制基底細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)垂體前葉的ACTH分泌，增加下丘腦POMC，減少食物攝入量和脂肪量積累，從而減輕體重，這表明EPO在下丘腦-垂體軸上的作用可以維持全身代謝穩(wěn)態(tài)。

另外，慢性缺氧會(huì)導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)下降，國(guó)外研究了小鼠高海拔和低海拔狀態(tài)下，主要營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、EPOR和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在合胞體微絨毛和基底膜部分的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)孕婦血液合胞體微絨毛中EPO濃度和EPOR密度都增加了，但是在高海拔導(dǎo)致的慢性缺氧孕婦中，合胞體微絨毛中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的密度降低了，因此，慢性缺氧可能通過(guò)減少氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到胎兒來(lái)減少胎兒生長(zhǎng)[12]。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組仔鼠的個(gè)體較小，體重較輕，可能與升高的EPO調(diào)節(jié)下丘腦垂體軸以及代謝有關(guān)。

（3）EPOR在低鐵仔鼠肝臟的表達(dá)。

EPOR作為同型二聚體存在于紅細(xì)胞祖細(xì)胞表面，在與EPO結(jié)合時(shí)，受體發(fā)生構(gòu)象變化，使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域緊密貼合，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)，進(jìn)行交叉磷酸化，從而發(fā)揮造血作用[13]。EPO受體在紅系祖細(xì)胞之外廣泛表達(dá)，在腦、心臟和腎臟中發(fā)揮非造血作用。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟EPOR mRNA的表達(dá)情況，證實(shí)了EPOR也表達(dá)于新生仔鼠肝臟中，這是國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道的。

張志敏[14]等發(fā)現(xiàn)，制造宮內(nèi)窘迫母鼠模型，其新生大鼠在生后腦組織EPO和EPOR在2h內(nèi)迅速增加，而且EPOR可持續(xù)高表達(dá)數(shù)天。而本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠缺鐵后其新生仔鼠肝臟EPOR表達(dá)未見(jiàn)增加，這是由于缺血缺氧后，各部位組織中EPOR的表達(dá)水平可能存在一定程度的差異，隨著妊娠期進(jìn)展，胎兒肝臟EPOR基因表達(dá)水平逐步降低[15]。

機(jī)體內(nèi)哪些細(xì)胞表達(dá)EPOR，以及EPOR是否隨著發(fā)育而變化，尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

（1）母親孕期缺鐵性貧血容易導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限，缺血缺氧，并且胎兒在出生后出現(xiàn)缺鐵癥狀，表現(xiàn)為皮膚蒼白，體重較輕，行動(dòng)遲緩。

（2）缺鐵子代新生兒體重減輕可能與胎兒肝臟升高的EPO調(diào)控下丘腦激素釋放，減少脂肪堆積和增加能量消耗有關(guān)。

（3）EPO的代償性升高可釋放到血液從而發(fā)揮其造血功能，有效緩解貧血。

（4）本研究證實(shí)了新生仔鼠肝臟內(nèi)存在EPOR，而在缺鐵導(dǎo)致缺氧的新生兒個(gè)體中，EPO的作用主要與EPO的數(shù)量的增加有關(guān)，而受體EPOR并未發(fā)生顯著改變。