香青蘭總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化及TGF-β1/Smad通路的影響

信盼 ，王新春 ，，黃川生 ，郭新紅 ，袁勇 ，曹文疆 *

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的重要原因。AS發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜，其具體致病機(jī)理尚不清楚。眾多研究表明，炎性反應(yīng)是AS病理形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]，作為AS的基本特征和始動因子，炎性反應(yīng)可以啟動斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，通過不同途經(jīng)影響斑塊的穩(wěn)定性，從而參與AS的形成與發(fā)展[3]。因此，降低炎性因子的表達(dá)是治療AS的一種重要手段。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一種具有多種生物學(xué)的功能細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和遷移，刺激多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)的合成和分泌，并參與細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解。研究表明，TGF-β/Smad信號通路在心腦血管疾病中扮演著重要角色，尤其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

香青蘭（Dracocephalum moldovicaL.），為唇形科一年生草本植物[6]，是新疆地產(chǎn)植物藥，在臨床主要用于治療心絞痛、高血壓、動脈粥樣硬化及心肌缺血等疾病。香青蘭中主要含有黃酮類、揮發(fā)油、萜類、氨基酸、微量元素及多肽等化學(xué)成分，且黃酮類化合物是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮（Dracocephalum moldavicaL.total flavones，TFDM）可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)和抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖和遷移，從而延緩AS的病理進(jìn)程[9-11]。而對于其抗AS的具體作用機(jī)制研究較少。因此，本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)載脂蛋白E基因敲除小鼠建立AS模型，在此基礎(chǔ)上探討香青蘭總黃酮干預(yù)治療AS的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠40只及8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠8只，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物及試劑

香青蘭總黃酮（新疆自治區(qū)藥物研究所，批號20131109），辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號 M042689），膽固醇（Solarbio，批號 1012E111），小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號AK0017OCT19004），小鼠白介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號AK0017OCT19006），小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白 1（MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號AK0017OCT19003）及小鼠白介素 6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號AK0017OCT19005）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，RIPA組織細(xì)胞裂解液（Solarbio，批號 20150319）；5×蛋白上樣緩沖液（Solarbio，批號 P01411/60237），磷酸酶抑制劑混合物（Solarbio，批號 P1260），HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（北京中杉金橋，批號 131879）；HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠（北京中杉金橋，批號131224），TGF-β1小鼠單克隆抗體（abcam，批號GR212859-1），Smad2/3兔單克隆抗體（abcam，批號GR266690-2），p-Smad2/3兔多克隆抗體（abcam，批號GR52460-10），GAPDH多克隆抗體（武漢三鷹，批號10494-1-AP），ECL 超敏發(fā)光試劑盒（Thermo，批號RJ238588）。

1.3 儀器

DB-09型石蠟包埋機(jī)（湖北德立森科技有限公司），RM2245半自動石蠟切片機(jī)（Leica公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），Sunrise酶標(biāo)儀（TECAN公司），EPS300電泳儀（Tanon公司），EC3 600凝膠成像儀(美國UVP公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

將40只SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為5組，每組8只：即模型組（Model，給予相應(yīng)生理鹽水）、香青蘭總黃酮低劑量組（TFDM-L，21 mg/kg/d）、香青蘭總黃酮中劑量組（TFDM-M，42 mg/kg/d）、香青蘭總黃酮高劑量組（TFDM-H，84 mg/kg/d） 和辛伐他汀組（Simvastatin，3.5 mg/kg/d）。8只相同基因背景和周齡的雄性C57BL/6J健康小鼠作為正常對照組（Normal）。

1.4.2 模型建立及取材

正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)，模型組、辛伐他汀組和TFDM各給藥組以高脂飼料（0.75%膽固醇、15%豬油、84.25%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)，并每日灌胃相應(yīng)劑量的藥物；所有動物自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境維持光照時間 12 h/d，溫度（25±2）℃，濕度 45%～65%。連續(xù)灌胃干預(yù)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，各組小鼠禁食不禁水12 h，眼球取血，3000 r/min離心10 min，取血清，-20℃保存待用。分離小鼠主動脈根部1 cm固定于4%多聚甲醛中，其余置于-80℃保存待用。

1.4.3 病理形態(tài)學(xué)檢查

主動脈固定完全后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。行蘇木素-伊紅（HE）染色，切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，酸酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后經(jīng)中性樹脂封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察主動脈病理形態(tài)的變化。Image-Pro Plus 6.0測算主動脈斑塊和管腔面積。

1.4.4 血清 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 水平測定

檢測各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的水平，具體操作按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 主動脈 TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3 蛋白表達(dá)的測定

取小鼠主動脈，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織蛋白并測定所提蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)上樣緩沖液處理后進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，再電印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉或BSA室溫封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜（GAPDH、TGF-β1、p-Smad2/3和 Smad2/3的稀釋比例分別為 1∶5000、1∶1000、1∶500、1∶1000），洗膜3次，加二抗室溫孵育1h，洗膜3次，最后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件對條帶進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果如圖1所示，正常組小鼠主動脈內(nèi)膜完整，無明顯平滑肌細(xì)胞增生，管腔未明顯狹窄，無AS斑塊形成。與正常組相比，模型組主動脈內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增生，斑塊面積較大，脂質(zhì)核心大，纖維帽薄，管壁彌漫性增厚并呈現(xiàn)向管腔發(fā)展的占位性病變，導(dǎo)致管腔明顯狹窄。與模型組相比，TFDM各劑量組和辛伐他汀組可見平滑肌細(xì)胞增生，斑塊面積較小，脂質(zhì)核心小，纖維帽厚，血管內(nèi)膜局部增厚，管腔狹窄程度較輕，病變較局限。說明TFDM可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性。

圖1 小鼠主動脈組織病理學(xué)檢查（HE染色×40）Fig.1 Histopathologic examination aorta in mice（HE×40）

2.2 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的影響

由表1可知：各組小鼠主動脈管腔面積無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組相比，TFDM各劑量組及辛伐他汀組斑塊面積與管腔面積比值明顯降低，且具有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），說明 TFDM 可明顯減少動脈粥樣硬化斑塊面積。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的比較 X± STab.1 Comparison of aortic atherosclerotic plaque area and lumen area of ApoE-/- mice in different groups X± S

2.3 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠多種炎癥因子表達(dá)的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 濃度顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TFDM低、中、高劑量組和辛伐他汀組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1濃度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

說明TFDM可抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性變化。

圖2 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠多種炎癥因子表達(dá)的影響Fig.2 Effects of TFDM on the expression of various inflammatory factors in ApoE-/-mice

2.4 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常組相比，模型組主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及 Smad2/3的蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TFDM 低、中、高劑量組和辛伐他汀組主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3的蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。

說明TFFDM可抑制ApoE-/-小鼠主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性變化。

圖3 各組小鼠主動脈TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of TGF-β1，p-Smad2/3 and Smad2/3 proteins in the aorta of mice in each group

3 討論

AS是一種與眾多心腦血管疾病危險因素相關(guān)的慢性炎癥性疾病，常常累及多個臟器，其病變特征是血管內(nèi)壁有脂質(zhì)斑塊生成，導(dǎo)致管腔內(nèi)變窄和變硬，進(jìn)而影響組織供血。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠建立AS模型，藥物持續(xù)干預(yù)12周，結(jié)果顯示，相比于模型組TFDM各劑量組小鼠主動脈斑塊面積較小，脂質(zhì)核心小，纖維帽厚，血管內(nèi)膜局部增厚，管腔狹窄程度較輕，斑塊面積與管腔面積比值顯著降低。表明TFDM可通過抑制AS斑塊的形成從而延緩AS進(jìn)程。

AS發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，存在多種學(xué)說，炎癥學(xué)說是AS發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說。炎性反應(yīng)貫穿于AS的形成和發(fā)展，通過啟動斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，而影響斑塊的穩(wěn)定性[3]。因此降低炎性因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)是防治AS的重要思路與方向。IL-1β是致AS的重要炎性細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，相關(guān)研究表明，IL-1β可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞粘附，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶合成，增加血管通透性等[12-14]。IL-6主要由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及內(nèi)分泌組織等釋放，能夠放大急性炎癥反應(yīng)、促使機(jī)體產(chǎn)生慢性炎癥，并處于中心地位。在AS進(jìn)程中，IL-6可通過誘導(dǎo)血小板源性生長因子，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。MCP-1是AS形成和發(fā)展過程中十分重要的趨化因子，隨AS病變程度的加重而升高，是冠心病的獨(dú)立危險因素之一[15]。MCP-1可通過介導(dǎo)單核細(xì)胞向血管損傷部位不斷聚集，再侵入內(nèi)皮進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞，從而啟動及促進(jìn)AS的進(jìn)程。其對平滑肌細(xì)胞也有趨化增殖作用，并可誘導(dǎo)組織因子表達(dá)，促進(jìn)局部血栓形成。因此，阻斷MCP-1作用也是抑制早期血管炎癥反應(yīng)和穩(wěn)定斑塊的重要手段。此外，TNF-α被證實(shí)存在于動脈粥樣樣硬化斑塊中，在AS和炎癥中發(fā)揮作用，并且可以加重脂質(zhì)代謝紊亂[16]。TNF-α可刺激自身及IL-1、IL-6、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，發(fā)揮促炎作用。在AS的進(jìn)程中，TNF-α通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和平滑肌增殖，激活血小板黏附和聚集功能，從而增加血栓形成的風(fēng)險[17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，相比于模型組，TFDM各劑量組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達(dá)水平均顯著降低。表明TFDM可能通過抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1的表達(dá)，從而抑制平滑肌細(xì)胞增殖，減輕局部炎癥反應(yīng)，延緩AS病理進(jìn)程。

TGF-β作為一種多功能的細(xì)胞因子，對AS進(jìn)程中動脈內(nèi)皮的損傷，血管平滑肌的遷移，動脈壁脂質(zhì)聚集，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和炎性細(xì)胞的浸潤等關(guān)鍵步驟均有調(diào)節(jié)作用。在TGF-β家族中，TGF-β1功能最多，活性最強(qiáng)，分布最廣，Smad蛋白家族是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要分子，介導(dǎo)信號從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路參與多種心血管相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，因此成為臨床及科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。據(jù)報道，在生理狀態(tài)下Smad3表達(dá)水平較低，TGF-β可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生。而在炎癥或者損傷后，Smad3水平上調(diào)，TGF-β則促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生[19]。從而發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路對血管平滑肌細(xì)胞可能具有雙向調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組主動脈中TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平顯著高于正常組，而與模型組相比，TFDM各劑量組TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平明顯降低。表明TFDM可能通過抑制TGF-β1及下游蛋白Smad2/3，P-Smad2/3的表達(dá)，阻止核轉(zhuǎn)位，從而干預(yù)TGF-β1/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制平滑肌細(xì)胞的增生和遷移。

綜上所述，香青蘭總黃酮可能通過抑制炎癥反應(yīng)和干預(yù)TGFβ1/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減輕炎癥反應(yīng)，增加斑塊的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。本研究為探究香青蘭總黃酮抗AS作用及其機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。TGF-β具有多種生物學(xué)功能，其網(wǎng)絡(luò)式分子信號通路復(fù)雜又龐大，因此，TGFβ/Smad信號在科研及臨床領(lǐng)域仍有著廣泛的研究空間，并在防治心血管疾病方面有著良好的應(yīng)用前景。