不同條件對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成的影響

郝旭昇，張曉榮，郭都，鄭占文，孫怡，夏效東，石超

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii，C.sakazakii）是一種無芽孢、桿狀、兼性厭氧、周生鞭毛的革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科克羅諾菌屬[1]。阪崎克羅諾腸桿菌是近年來備受關(guān)注的一種食源性條件致病菌，它能導(dǎo)致新生兒及免疫力低下的成人患有可致命的菌血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎，致死率高達(dá)50%[2,3]。據(jù)報道，阪崎克羅諾腸桿菌常從土壤、奶粉、肉類、奶酪、谷物、巧克力工廠和奶粉加工廠等樣品及環(huán)境中分離得到[4,5]，嬰幼兒配方乳粉及其相關(guān)生產(chǎn)設(shè)備被認(rèn)為是阪崎克羅諾腸桿菌傳播、污染的主要途徑[6]。

生物被膜是指在細(xì)菌與接觸表面或細(xì)菌本身之間相互作用下，菌體通過增殖、分泌胞外基質(zhì)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的聚集體[7]。生物被膜導(dǎo)致更多致病菌的粘附并造成交叉污染，中國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)顯示，27%的食品污染是由食品生產(chǎn)、加工、儲存設(shè)備表面的生物被膜所造成[8]。除此之外，生物被膜為致病菌提供了物理屏障，保護(hù)其免受消毒劑、熱等環(huán)境壓力的損傷和機(jī)體免疫殺傷[9]，這使得病原菌致病能力增強(qiáng)，人體感染風(fēng)險增大。研究顯示，阪崎腸桿菌可在多種材料表面粘附并形成生物被膜[10]，這使得阪崎克羅諾桿菌易于定植在嬰幼兒食品加工設(shè)備、嬰幼兒食品包裝器具、食用器皿、攪拌工具的表面，這增大了它感染嬰幼兒的風(fēng)險[11]。

食源性致病菌在加工接觸面形成生物被膜是一個動態(tài)演變過程[12]，在該過程中諸多因素均會對菌體粘附和生物被膜產(chǎn)生重要影響。許多研究表明，細(xì)菌得失電子的能力、表面疏水性能、菌體的聚集性和泳動能力與細(xì)菌的粘附和生物被膜的形成相關(guān)[13]。除菌體自身特性外，生長溫度、營養(yǎng)基質(zhì)、pH值、NaCl濃度、接觸面的材質(zhì)類型等因素也會影響細(xì)菌的粘附和生物被膜形成過程[11,14]。探明影響菌體粘附及生物被膜形成的因素及規(guī)律對理解菌體生物被膜的形成過程和控制生物被膜具有重要的意義。

目前關(guān)于阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的研究主要集中在評價病原菌生物被膜的形成能力，但對不同條件（生長溫度、培養(yǎng)基質(zhì)、接觸材料）對菌體生物被膜的形成及對消毒劑的抗性的影響缺乏探討?；谀壳按嬖诘膯栴}，本研究以阪崎克羅諾腸桿菌為研究對象，以12 ℃、25 ℃和37 ℃為生長溫度，以胰蛋白胨大豆肉湯和嬰幼兒乳粉肉湯為培養(yǎng)基質(zhì)，以不銹鋼、玻璃、硅膠三種材料為接觸材料，探究以上不同條件對菌體粘附和生物被膜形成的影響；同時，借助場發(fā)射掃描電鏡觀測阪崎克羅諾腸桿菌在不同培養(yǎng)溫度和材料表面形成生物被膜的空間結(jié)構(gòu)；最后，分析不同條件對菌體耐受三種季胺類消毒劑的影響。本研究旨在發(fā)現(xiàn)生長溫度、培養(yǎng)基質(zhì)和接觸材料對阪崎克羅諾腸桿菌菌體粘附及生物被膜形成的影響規(guī)律，為阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與化學(xué)試劑

阪崎克羅諾腸桿菌（C. sakazakii）ATCC 29004購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

二甲基亞砜（色譜純）、玻璃珠（直徑為425-600μm）、苯扎氯銨、雙十烷基二甲基氯化銨、吐溫80、皂素、無水硫代硫酸鈉、L-組氨酸、卵磷脂購于美國sigma試劑公司；丙酮、戊二醛購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)菌生化培養(yǎng)箱 SPX-250B，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；離心機(jī)5804R，德國Eppendorf公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800，日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與菌懸液制備

菌株活化與菌懸液制備參考石超等[15]的方法，將菌體使用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS，pH=7.2）清洗并懸浮，調(diào)整菌懸液中菌體濃度約為108CFU/mL。最后將菌懸液稀釋10000倍，使菌體濃度為104CFU/mL備用。

1.3.2 不同營養(yǎng)基質(zhì)及溫度下穩(wěn)定期菌體的制備

試驗參照 Kim等[11]的方法制備穩(wěn)定期菌體。首先將嬰幼兒配方乳粉與蒸餾水以 1：10（m/V）的比例混合，加熱到50至60 ℃下溶解，121 ℃下高壓滅菌15 min后制備為嬰幼兒乳粉肉湯（Infant formula broth，IFB）。隨后分別取一定量 1.3.1中制備的菌懸液接種于其百倍體積的TSB或IFB中，置于12 ℃、25 ℃及37 ℃下培養(yǎng)，在37 ℃下于TSB和IFB中均培養(yǎng)1 d，25 ℃下于TSB和IFB中各培養(yǎng)2 d，12 ℃下于TSB培養(yǎng)6 d，IFB培養(yǎng)8 d，使各處理組下菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期（菌懸液濃度約為109CFU/mL）。

1.3.3 阪崎克羅諾腸桿菌的粘附定量檢測

試驗前須對三種接觸材料進(jìn)行清洗，具體程序如下：將不銹鋼（食品級304不銹鋼，50 mm×20 mm，4號光潔面）、玻璃（鋼化高溫高壓玻璃，50 mm×20 mm）、硅膠（醫(yī)用食品級）置于丙酮溶液中超聲10 min，使用無菌水漂洗后再用無水乙醇浸泡，隨后取出樣品用蒸餾水再次洗滌，高壓蒸汽滅菌15 min后備用。取1.3.2中菌懸液30 mL于載有不銹鋼，玻璃，硅膠的離心管中至恰好浸沒接觸材料上端，將其于12 ℃、25 ℃及37 ℃下恒溫靜置，分別于1、2、4、8、12和24 h規(guī)定時間內(nèi)取樣，依次用400 mL無菌水漂洗15 s，200 mL無菌水漂洗5 s，隨后將樣品放入含有3 g玻璃珠及30 mL PBS的離心管中，充分渦旋5 min以使粘附菌體脫落。取渦旋后上清液，使用PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋，后將其涂布于TSA平板上，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后計算菌體數(shù)量，結(jié)果以log CFU/cm2表示。

1.3.4 阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成的定量檢測

將1.3.2中制備的菌懸液離心（4000 r/min，15 min，4 ℃）后，去上清，使用PBS洗滌菌體沉淀三次，隨后使用一定量PBS懸浮菌體，并調(diào)整菌體濃度為107CFU/mL。將不銹鋼、玻璃、硅膠置于含有30 mL菌懸液的離心管中，于4 ℃下靜置24 h，隨后取出樣品分別使用400 mL無菌水漂洗15 s、200 mL無菌水漂洗5 s，將洗滌后的樣品放入含有30 mL TSB或IFB的離心管中，于12 ℃、25 ℃及37 ℃下恒溫靜置培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8和10 d規(guī)定時間內(nèi)取樣，再次使用前述方法清洗樣品，將不銹鋼，玻璃，硅膠三種生物被膜形成材料放入含有3 g玻璃珠和30 mL PBS的離心管中，充分渦旋5 min以使粘附菌體脫落。吸取渦旋后的上清液，使用PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂布，將TSA平板置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，計算菌體數(shù)量，結(jié)果以log CFU/cm2表示。

1.3.5 場發(fā)射掃描電鏡觀察生物被膜微觀結(jié)構(gòu)

參照石超等[15]和王虎虎[16]的方法，利用場發(fā)射掃描電鏡觀察生物被膜微觀結(jié)構(gòu)，并略有修改。菌懸液制備參照1.3.2，使用PBS洗滌菌體并調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL。將菌懸液加入分別載有不銹鋼、玻璃、硅膠的離心管中，于4 ℃下恒溫靜置24 h，使用蒸餾水兩次漂洗后將樣品放入含有 TSB的離心管中，在12 ℃，25 ℃及37 ℃下培養(yǎng)48 h。規(guī)定時間下取樣漂洗，經(jīng) 2.5%戊二醛溶液 4 ℃固定過夜后，使用無菌水和PBS依次洗滌，隨后使用1%（V/V）鋨酸將菌體再次固定 5 h，利用不同濃度梯度（30%、50%、70%、80%、90%和100%）的乙醇進(jìn)行洗脫，每次處理時間為10 min。最后將處理后的樣品鍍金，使用場發(fā)射掃描電鏡（4000×）觀察 12 ℃、25 ℃和37 ℃下不銹鋼、玻璃、硅膠表面細(xì)菌生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 細(xì)菌生物被膜對消毒劑抗性的測定

細(xì)菌生物被膜對消毒劑抗性的測定參照Abdallah等[17]的方法，并略作修改。首先，菌液制備同1.3.2，取上述菌液離心（4000 r/min，15 min，4 ℃）后，去上清，使用PBS洗滌菌體沉淀三次后，使用一定量PBS懸浮菌體，并調(diào)整菌體濃度約107CFU/mL。取上述菌懸液于分別載有不銹鋼、玻璃、硅膠的離心管中，4 ℃下靜置24 h，使用無菌水漂洗樣品兩次。隨后將其放入含有30 mL TSB的離心管中，分別于12 ℃、25 ℃及37 ℃下恒溫培養(yǎng)，48 h后取出樣品，使用蒸餾水漂洗兩次，分別浸沒于三種消毒劑液體（30 mL）中15 min（消毒劑產(chǎn)品見表1），隨后取出樣品浸沒于中和液（L-組氨酸1 g/L，皂素30 g/L，卵磷脂30 g/L，TSB 30 g/L，吐溫80 30 g/L，無水硫代硫酸鈉5 g/L）中以終止消毒劑作用。將樣品置于裝有3 g玻璃珠，30 mL PBS的離心管中充分渦旋，吸取菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂布，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，于24 h后取樣計算菌體數(shù)量，結(jié)果以logCFU/cm2表示。

表1 消毒劑產(chǎn)品的種類和特性Table 1 Type and characteristic of disinfectant products

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），同時使用SPSS軟件（version 20.0，Inc.，Chicago，IL）進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用Ducan's ANOVA進(jìn)行結(jié)果間顯著性檢驗，p≤0.05為顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長溫度、培養(yǎng)基質(zhì)和接觸材料對阪崎克羅諾腸桿菌粘附的影響

阪崎克羅諾腸桿菌在12 ℃、25 ℃及37 ℃條件在三種材料表面粘附的定量檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度對菌體粘附有顯著影響。在TSB和IFB兩種培養(yǎng)基質(zhì)中，12 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌粘附菌量均明顯低于25 ℃及37 ℃。12 ℃下菌體在TSB中1 h粘附菌量約4.5 log CFU/cm2，在IFB中1 h粘附菌量約為3.2 log CFU/cm2，而在25 ℃和37 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌的粘附能力接近，起始粘附菌量約5.0 log CFU/cm2。

同時，根據(jù)圖1我們發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌的粘附菌量受培養(yǎng)基質(zhì)影響。在 12 ℃條件下，菌體在TSB中的粘附菌量在檢測的24 h內(nèi)高于其在IFB中的粘附菌量。

圖1 阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29004在不銹鋼、玻璃、硅膠表面的粘附菌量Fig.1 The cell number of C. sakazakii ATCC 29004 attached to the surface of stainless steel, glass and silicone

在25 ℃條件下，菌體在TSB中在三種材料表面的粘附菌量在24 h時相近，約5.2 log CFU/cm2。菌體在IFB中的粘附菌量在三種材料表面存在差異，其中在不銹鋼和硅膠表面的粘附菌量約為 6.0 log CFU/cm2，在玻璃表面的粘附菌量約為 5.3 log CFU/cm2。在 37 ℃條件下，菌體在不銹鋼和硅膠材料表面在IFB中的粘附菌量均大于在TSB中的粘附菌量。此外，材料表面對于菌體粘附也有一定的影響。由圖1c和1f可知，菌體在37 ℃條件下的TSB、IFB中，硅膠表面粘附菌量最大，玻璃的粘附菌量最小。在25 ℃ IFB中（圖1d），阪崎克羅諾腸桿菌也表現(xiàn)出在玻璃表面的粘附能力最弱。在其他條件下，菌體在三種材料表面的粘附菌量無明顯差異。綜上所述，阪崎克羅諾腸桿菌在37 ℃條件下的IFB中，硅膠表面的粘附菌量最大。

2.2 生長溫度、培養(yǎng)基質(zhì)和接觸材料對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成的影響

阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成定量檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，溫度對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的形成有顯著影響。與25 ℃和37 ℃相比，阪崎克羅諾腸桿菌在12 ℃下的初始粘附菌量最少，且該溫度下生物被膜形成最為緩慢，8d后生物被膜形成量趨于穩(wěn)定。在25 ℃的TSB和IFB中，菌體在三種材料表面的生物被膜形成量在0～2 d快速增加，隨后趨于穩(wěn)定。37 ℃條件下不同介質(zhì)、不同材料中阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成量均在第2 d達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢。對比2 d內(nèi)生物被膜形成量，菌體在25 ℃的TSB中的生物被膜形成能力最強(qiáng)。

同時，由圖2可知，阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的形成受培養(yǎng)基質(zhì)影響。在本研究檢測的3個溫度條件下，阪崎克羅諾腸桿菌在TSB中生物被膜形成能力強(qiáng)于IFB。此外，除在37 ℃的IFB中，菌體在10 d的成膜量在玻璃表面最小，其他條件下，菌體在三種表面的生物被膜形成量無穩(wěn)定的變化趨勢，最終表現(xiàn)出各材料表面生物被膜在第10 d的形成量幾乎相同。

圖2 阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29004在不銹鋼、玻璃、硅膠表面生物被膜的形成量Fig.2 The cell number of biofilm formed by C. sakazakii ATCC 29004 on the surface of stainless steel, glass and silicone

2.3 生長溫度和接觸材料對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

試驗利用場發(fā)射掃描電鏡觀察阪崎克羅諾腸桿菌在不銹鋼、玻璃、硅膠表面生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29004生物被膜的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of biofilm formed by C. sakazakii ATCC 29004

由圖3a、3b和3c可知，12 ℃時阪崎克羅諾腸桿菌的生物被膜為單層結(jié)構(gòu)，此時尚無細(xì)菌聚集體形成，胞外基質(zhì)較少，生物被膜稀疏呈現(xiàn)薄層，視野中只有少量菌體粘連。此外，在三種表面下生物被膜微觀結(jié)構(gòu)有較為明顯差別，不銹鋼表面菌體最為密集（圖3-A1），而玻璃和硅膠表面菌體較為分散。

由圖3d、3e和3f可知，25 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌在三種接觸材料表面均能形成成熟的生物被膜，呈現(xiàn)出明顯的三維空間結(jié)構(gòu)，且多個小型聚集體通過菌體連接形成大型細(xì)菌聚集體，菌體以多層堆疊形式聚集在一起。同時，成熟生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)在三種表面有明顯的差別：硅膠表面的生物被膜極其致密，菌體“簇?fù)怼毙纬扇S空間結(jié)構(gòu)（圖3f）；不銹鋼表面生物被膜較為致密，菌膜層較厚，菌體以堆疊式形成三維空間結(jié)構(gòu)（圖 3d）；玻璃表面生物被膜則較為稀疏，胞外基質(zhì)較少，菌膜層較薄，仍有較多的細(xì)菌以單層、散體的形式存在（圖3e）。

由圖3g、3h和3i可知，37 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌在三種表面以平鋪堆疊式形成三維結(jié)構(gòu)。硅膠和玻璃表面生物被膜較為致密，胞外基質(zhì)較多，其中硅膠表面生物被膜的空間結(jié)構(gòu)更加明顯（圖3i）。

2.4 生長溫度和接觸材料對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜對消毒劑抗性的影響

阪崎克羅諾腸桿菌的生物被膜對三種市售消毒劑的抵抗能力檢測結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜對消毒劑的抵抗能力受菌體生長溫度和接觸表面類型的影響，且與消毒劑類型有關(guān)。不銹鋼、玻璃表面阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜對三種消毒劑的抵抗能力隨生物被膜形成溫度升高而增強(qiáng)，而硅膠表面生物被膜對消毒劑的抵抗能力表現(xiàn)出25 ℃最強(qiáng)，37 ℃次之，12 ℃最差。

三種消毒劑對阪崎腸桿菌生物被膜的殺菌作用表現(xiàn)有異，但隨溫度升高呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。由表 2可知，消毒劑產(chǎn)品1處理效果最差，其作用15 min后檢出殘余菌量最高達(dá) 54.7%；在三種消毒劑中產(chǎn)品 3表現(xiàn)出最強(qiáng)的殺菌作用，處理15 min后最大活菌量僅為5.1%。消毒劑產(chǎn)品3對阪崎腸桿菌生物被膜的去除能力強(qiáng)于產(chǎn)品1和產(chǎn)品2，說明雙十烷基二甲基氯化銨和苯扎氯銨對生物被膜的清除具有結(jié)合作用。

表2 生長溫度對阪崎腸桿菌生物膜抗消毒劑產(chǎn)品的影響Table 2 Effect of growth temperature on the resistance of C.sakazakii biofilms to disinfectant products

3 討論

本研究選取實驗室培養(yǎng)介質(zhì) TSB和復(fù)原嬰幼兒乳粉肉湯I(xiàn)FB為菌體培養(yǎng)基質(zhì)，以37 ℃（阪崎克羅諾腸桿菌適宜生長的溫度）、25 ℃（室溫）和12 ℃（歐洲議會和理事會于 2004年制定的食品衛(wèi)生規(guī)則條例中食品工業(yè)操作環(huán)境溫度）為菌體培養(yǎng)溫度，以乳粉加工設(shè)備、奶瓶、嬰幼兒鼻飼管等器具常用的三種材料（不銹鋼、玻璃和硅膠）為本研究接觸材料，探究不同因素對阪崎克羅諾腸桿菌菌體粘附和生物被膜形成的影響。

為深入探究不同培養(yǎng)條件對菌體的粘附能力的影響，本研究使用經(jīng)過不同條件（TSB、IFB；12 ℃、25 ℃、37 ℃）培養(yǎng)后的阪崎克羅諾腸桿菌進(jìn)行粘附實驗，這使得菌體后續(xù)粘附過程環(huán)境與前期培養(yǎng)條件一致，從而能夠完整反映培養(yǎng)條件對菌體粘附的影響。本研究使用進(jìn)入穩(wěn)定期初期的菌體（菌懸液濃度約為109CFU/mL）進(jìn)行粘附試驗，以避免經(jīng)過不同條件培養(yǎng)后的菌體數(shù)量及生理狀態(tài)的差異從而進(jìn)行更加準(zhǔn)確的比較。結(jié)果表明12 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌粘附菌量低于25 ℃及37 ℃的粘附菌量，且12 ℃下生物被膜形成量也明顯低于25 ℃及37 ℃，其中，菌體在25 ℃的TSB介質(zhì)中的成膜量高于其在37 ℃的成膜量。類似的，Han等[18]發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌在15～37 ℃的生物被膜形成量高于 4～10 ℃，并且菌體在不銹鋼表面的成膜量在30 ℃最高，研究證明當(dāng)培養(yǎng)溫度從4 ℃升高至30 ℃時，菌體胞外蛋白酶活力增強(qiáng)，與生物被膜相關(guān)的群體感應(yīng)信號分子AI-2產(chǎn)量增高，但在37 ℃時酶活力減弱，AI-2產(chǎn)量降低。Speranza等[19]檢測了沙門氏菌在20、30和40 ℃在蛋白胨水（1.0～2.5 g/L）中生物被膜的形成能力，結(jié)果表明，溫度對沙門氏菌生物被膜形成能力影響較大，菌體在30 ℃的成膜量高于40 ℃，20 ℃的成膜量最低。研究者推測是由于菌毛和纖維素是沙門氏菌形成生物被膜的重要基質(zhì)組分，agfD啟動子受到環(huán)境的影響因而影響菌毛形成，菌毛合成的溫度是 28 ℃使得菌體在 30 ℃成膜量最高。Bonsaglia等[14]檢測了單增李斯特菌在腦心浸液肉湯中不銹鋼表面的成膜能力，結(jié)果表明，在研究檢測的三個溫度（4 ℃、20 ℃和35 ℃）中，當(dāng)溫度為25 ℃時菌體粘附能力最強(qiáng)。研究者認(rèn)為是菌體鞭毛的合成影響了單增李斯特菌的菌體粘附。37 ℃條件下MogR抑制鞭毛相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，因此菌體無鞭毛，且不能運動，但在30 ℃條件時，MogR被抑制從而使鞭毛基因轉(zhuǎn)錄。鞭毛在生物被膜形成的過程中具有重要的作用，其能夠促進(jìn)菌體的粘附和生物被膜的成熟。研究結(jié)果表明，纖維素和鞭毛有助于阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的形成，但是菌毛與其生物被膜形成沒有相關(guān)性[20]。此外，阪崎克羅諾腸桿菌胞外聚合物能夠維持生物被膜的三維結(jié)構(gòu)和生命周期，研究表明，在0～30 ℃范圍內(nèi)，阪崎克羅諾腸桿菌在27 ℃時胞外多糖合成量最大。

由本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌在37 ℃條件下，在兩種培養(yǎng)基質(zhì)中均出現(xiàn)了在培養(yǎng)的第二天生物被膜形成量最大，隨后生物被膜量逐步減少（圖2-C1和圖2-C2）。本研究結(jié)果與Bonsaglia等[14]研究結(jié)果相似，單增李斯特菌在35 ℃環(huán)境培養(yǎng)48 h后，生物被膜量降低。Jo等[21]發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾腸桿菌分離在硅膠、聚碳酸酯、不銹鋼材料表面形成的生物被膜在24 h達(dá)到最大值，在隨后檢測的144 h內(nèi)生物被膜量逐步降低。以上結(jié)果可能是由于在培養(yǎng)一定時間后，生物被膜的形成進(jìn)入了主動分散階段。隨著生物被膜的成熟，生物被膜結(jié)構(gòu)愈發(fā)復(fù)雜和龐大，但這使得營養(yǎng)物質(zhì)難以進(jìn)入到生物被膜內(nèi)部，致使生物被膜從內(nèi)部開始消散，同時外部的部分細(xì)菌聚集體或者單個菌體也開始從生物被膜上脫落、散播，脫落后的菌體成為浮游菌體后開始新一輪的生物被膜形成過程[22]。

食品加工接觸面材質(zhì)類型也是影響菌體粘附數(shù)量和生物被膜形成的關(guān)鍵因素之一，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌在25 ℃環(huán)境的IFB中，37 ℃的TSB和IFB中，其在玻璃表面粘附菌量最低，硅膠表面粘附菌量最高，但在其他條件，三種材料表面粘附菌量沒有明顯差異（圖2）。玻璃、不銹鋼材料具有親水性而硅膠材料具有疏水性，菌體在不同材料表面的粘附與材料的表面特性有關(guān)。我們的研究結(jié)果與Kim等[11]研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)四株阪崎腸桿菌菌株在硅膠表面的粘附菌體高于在不銹鋼表面的粘附菌體。De Oliveira等[23]研究結(jié)果表明沙門氏菌在不銹鋼和玻璃表面的生物被膜形成量低于在 PVC材料表面的生物被膜量。但也有研究表明菌體在親水材料表面生物被膜的形成量高于疏水材料[14,24]。

本研究結(jié)果表明，菌體在TSB中生物被膜的形成量高于在IFB中（圖2）。TSB中的主要營養(yǎng)成分包括胰酪蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖以及磷酸鹽，用來制備IFB的嬰兒配方乳粉含脫脂牛奶、玉米糖漿、乳糖、大豆油、濃縮乳清蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)。已有研究表明，NaCl和葡萄糖可以促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成[25]。同時，我們推測，在TSB和IFB兩種介質(zhì)中生物被膜形成量的不同也歸因于培養(yǎng)基質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)、pH值和溶液黏度等，TSB相比IFB更利于阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜的形成。

本研究結(jié)果表明，阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜對消毒劑的抵抗能力與菌體培養(yǎng)溫度有關(guān)，相較于12 ℃，25 ℃和37 ℃條件下形成的生物被膜對消毒劑的抗性更強(qiáng)（表2），Abdallah等[17]研究結(jié)果表明，隨培養(yǎng)溫度升高，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌形成的生物被膜對季胺類消毒劑的耐受能力增強(qiáng)。根據(jù)本文中場發(fā)射掃描電鏡觀測結(jié)果，我們猜測生物被膜對消毒劑的抵抗能力取決于生物被膜的厚度和緊密度，25 ℃和37 ℃條件下形成的生物被膜較12 ℃時更加立體且致密，從而增強(qiáng)了生物被膜對消毒劑的抵抗能力。并且，由圖2可知，37 ℃條件下菌體在生物被膜形成第二天時，三種材料表面生物被膜量基本一致，但經(jīng)過消毒劑處理后，三種材料表面生物被膜量產(chǎn)生了差異。這說明，生物被膜對消毒劑的抵抗能力也與接觸材料相關(guān)，除此之外，消毒劑的種類也與生物被膜對消毒劑的抵抗能力有關(guān)。

4 結(jié)論

阪崎克羅諾腸桿菌對非生物表面的粘附和生物被膜的形成受生長溫度、培養(yǎng)基質(zhì)和表面材料的影響。12 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌粘附和生物被膜形成能力最弱，25 ℃和37 ℃生物被膜形成周期較快，菌體在TSB中生物被膜形成量高于其在IFB中；場發(fā)射掃描電鏡觀測生物被膜微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，生長溫度和表面類型對菌體生物被膜的結(jié)構(gòu)有顯著影響，25 ℃和37 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌均能形成成熟的生物被膜，具有立體且致密的結(jié)構(gòu)，12 ℃時菌體生物被膜為單層結(jié)構(gòu)；生物被膜對消毒劑的抗性受培養(yǎng)溫度、表面類型和消毒劑種類的影響，12 ℃阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜對消毒劑的抵抗能力最弱，不銹鋼、玻璃表面的生物被膜對消毒劑的抗性隨溫度升高而增強(qiáng)，硅膠表面生物被膜在 25 ℃下對消毒劑的抗性最強(qiáng)。本研究為理解阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成因素提供實驗依據(jù)，有望為更新、制定嬰幼兒配方乳粉加工、流通環(huán)節(jié)微生物安全標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為乳粉加工、沖調(diào)等器具材料的選擇提供理論依據(jù)。