檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境壓力耐受能力及抗生素敏感性的影響

康慎敏，劉志遠(yuǎn)，孟宇杰，程曉萌，涂俊宏，溫啓吾，郭 都，石 超*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種周生鞭毛、無芽孢、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的革蘭氏陰性條件致病菌，屬腸桿菌科[1]。它能夠從自然界不同的環(huán)境中被分離出來，包括土壤、奶粉工廠、奶酪、肉類、蔬菜等[2]。嬰幼兒配方奶粉是阪崎克羅諾腸桿菌感染新生兒最常見的載體[3]，阪崎克羅諾腸桿菌感染新生兒后易引起壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥和腦膜炎等疾病，致死率達(dá)33%～80%[4]。感染后的幸存兒童易出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括癲癇、腦膿腫、腦積水和發(fā)育遲緩等[5]。

阪崎克羅諾腸桿菌在嬰幼兒乳粉污染及傳播的途徑中，需要經(jīng)歷干燥（干燥貯存環(huán)節(jié)）和高溫環(huán)境（復(fù)原沖調(diào)環(huán)節(jié)）。研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌具有極強(qiáng)的耐干燥能力，它能夠在干燥的嬰幼兒乳粉中存活2.5 a及以上[6]。同時(shí)，阪崎克羅諾腸桿菌還具有良好的溫度適應(yīng)能力，能在一定的時(shí)間范圍內(nèi)耐受60 ℃處理[7]。這使得其能夠經(jīng)受乳粉的沖調(diào)高溫并進(jìn)入人體從而增大感染風(fēng)險(xiǎn)。在進(jìn)入人體后，胃酸和腸道膽鹽是阪崎克羅諾腸桿菌必須應(yīng)對的兩大生存壓力介質(zhì)。有研究表明阪崎克羅諾腸桿菌能在pH 3.2～4.5的環(huán)境中生長[8-9]，并且與成年人相比，嬰幼兒的胃酸pH值較高，這使得阪崎克羅諾腸桿菌更容易耐受嬰幼兒胃酸從而進(jìn)入腸道。腸道中的膽鹽能夠通過破壞細(xì)胞膜中的磷脂結(jié)構(gòu)、降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白等多種方式發(fā)揮其對細(xì)菌的抑殺作用[10]，而阪崎克羅諾腸桿菌能夠在腸道中存活并引發(fā)感染，說明其對膽鹽具有一定的耐受能力。

近年來，部分研究者將目光投向于使用植物源活性物質(zhì)控制食源性致病菌。檸檬醛是檸檬草油的主要活性成分，存在于多種植物的葉子和果實(shí)中[11]，具有廣譜抗菌作用，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局評價(jià)為公認(rèn)安全的食品成分（GRAS 182.60）而應(yīng)用于多種食品。本研究團(tuán)隊(duì)前期已報(bào)道檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的生長及毒力因子具有良好的抑制作用[12]，但其對阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境耐受能力的影響鮮有研究。

本研究以檸檬醛為研究對象，以阪崎克羅諾腸桿菌為作用主體，首先采用液體稀釋法測定檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度；隨后分別探究亞抑制濃度的檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌干燥、滲透壓、熱、酸和膽鹽耐受能力的影響；同時(shí)利用E-test?法檢測檸檬醛作用后阪崎克羅諾腸桿菌對抗生素氨芐西林與頭孢西丁敏感性的變化；最后，通過實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）探究檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌相關(guān)耐受基因轉(zhuǎn)錄的影響。旨在探究檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境壓力耐受能力和抗生素敏感性的影響及可能的機(jī)理，為檸檬醛應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工過程中用以預(yù)防和控制阪崎克羅諾腸桿菌提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544、ATCC 12868購于美國模式菌株收集中心；分離菌29由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全與天然產(chǎn)物功能實(shí)驗(yàn)室分離自市售嬰幼兒奶粉。

檸檬醛（色譜純，純度≥99.2%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）北京陸橋技術(shù)有限公司；山梨醇（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸 四川西隴化工有限公司；膽鹽 美國Sigma公司；E-test?氨芐西林試紙條帶、頭孢西丁試紙條帶 意大利Liofilchem公司；其他所用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B細(xì)菌生化培養(yǎng)箱 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Smart SpecTMplus分光光度計(jì)、GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；MK-200-1干式恒溫器杭州奧盛儀器有限公司；TH2-312臺式恒溫振蕩器上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于-80 ℃的阪崎克羅諾腸桿菌采用劃線法在TSA平板上活化，挑取單菌落接種于30 mL的TSB肉湯中，將其置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8 h（130 r/min）后離心（5 000×g，10 min，4 ℃）。用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體沉淀，洗滌2 次后調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.5（約108CFU/mL）。

1.3.2 亞抑制濃度的測定

亞抑制濃度指低于最小抑菌濃度且對微生物生長無明顯抑制作用的抑菌劑濃度。檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度采用液體稀釋法測定[13]，按照1.3.1節(jié)方法活化菌體，調(diào)整菌液OD600nm為0.1后加入百孔蜂窩板中，加入檸檬醛使其終質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/L和0 μg/L（對照組）。將樣品置于微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀中37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔1 h檢測600 nm波長下的光密度。以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，菌懸液OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，分析確定檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度。

1.3.3 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌干燥耐受能力的影響

按照1.3.1節(jié)方法分別制備ATCC 29544、ATCC 12868和分離菌29的菌懸液，調(diào)整菌懸液OD600nm為0.5，3 種菌懸液等量混勻后稀釋10 倍制成混合菌懸液。在檸檬醛質(zhì)量濃度為31.250 μg/L和15.625 μg/L的TSB中培養(yǎng)混合菌液10 h后離心（5 000×g，5 min，4 ℃），用PBS清洗菌體2 次，制備亞抑制濃度檸檬醛處理后的菌體。對照組為在不添加檸檬醛的TSB中培養(yǎng)的菌體。

檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌干燥耐受能力的影響測定參照Al-Nabulsi等[14]的方法進(jìn)行。使用PBS調(diào)整菌懸液的OD600nm為1.5，吸取50 μL菌懸液并均勻加于培養(yǎng)皿底部，40 ℃烘干2 h后轉(zhuǎn)移至干燥器中（25 ℃），分別干燥0、12、24、48、72、96、120、144 h取出樣品，使用0.2%緩沖蛋白胨水收集菌體，稀釋涂布于TSA培養(yǎng)基（每組3 個(gè)平行），37 ℃培養(yǎng)24 h后記錄細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為細(xì)菌存活率（N/N0），其中N表示在25 ℃干燥不同時(shí)間后菌體數(shù)量，N0表示在25 ℃干燥處理前的起始菌體數(shù)量。

1.3.4 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌滲透壓耐受能力的影響

參照Fakruddin等[8]的方法進(jìn)行。按照前述1.3.3節(jié)方法制備亞抑制濃度檸檬醛處理后的菌體，調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.5。吸取100 μL菌懸液加入10 mL含有山梨醇（75 g/100 mL）的TSB肉湯中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、6、12、24、36 h將樣品稀釋涂布于TSA培養(yǎng)基（每組3 個(gè)平行）培養(yǎng)24 h后記錄細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為細(xì)菌存活率（N/N0），其中N表示菌株耐受滲透壓不同時(shí)間后菌體數(shù)量，N0表示菌株未耐受滲透壓的起始菌體數(shù)量。

1.3.5 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌熱耐受能力的影響

參照Shi Chao等[15]的方法進(jìn)行。按照1.3.3節(jié)方法制備亞抑制濃度檸檬醛處理后的菌體（OD600nm=0.5）。吸取100 μL菌懸液加入10 mL TSB肉湯中，置于干式恒溫加熱器中，探究檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌熱（50、55、60 ℃）耐受能力的影響。其中，50 ℃熱處理0、20、40、80、100 min，55 ℃熱處理0、10、20、40、60、90 min，60 ℃熱處理0、5、10、20、30、40 min后，將樣品稀釋涂布于TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后記錄細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為細(xì)菌存活率（N/N0），其中N表示菌株耐受熱不同時(shí)間后的菌體數(shù)量，N0表示菌株未耐受熱的起始菌體數(shù)量。

1.3.6 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌酸耐受能力的影響

參照Amalaradjou等[16]的方法進(jìn)行。使用HCl溶液調(diào)整TSB肉湯的pH 3.3，吸取100 μL的1.3.3節(jié)中菌懸液（OD600nm=0.5）加入10 mL酸化的TSB肉湯中，將樣品置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于0、10、20、40、60 min將樣品涂布于TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)后記錄細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為細(xì)菌存活率（N/N0），其中N表示菌株耐受酸不同時(shí)間后的菌體數(shù)量，N0表示菌株未耐受酸的起始菌體數(shù)量。

1.3.7 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌膽鹽耐受能力的影響

吸取100 μL的1.3.3節(jié)中菌懸液（OD600nm=0.5）加入10 mL含有2%膽鹽[17]的TSB肉湯中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于0、2、4、6、8、12 h時(shí)取出樣品，將樣品稀釋涂布于TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后記錄細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為lg（N/N0），N表示菌株耐受膽鹽不同時(shí)間后的菌體數(shù)量，N0表示菌株未耐受膽鹽的起始菌體數(shù)量。

1.3.8 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌氨芐西林和頭孢西丁耐受能力的影響

參照Zanini等[18]選用的E-test?方法進(jìn)行測定，并作一定修改。按照1.3.3節(jié)方法制備亞抑制濃度檸檬醛處理后的菌體，使用TSB重懸浮并將菌體稀釋1 倍，將菌液均勻涂抹在TSA平板上，待菌液干燥后放置抗生素試紙條，氨芐西林和頭孢西丁的質(zhì)量濃度為0.016～256 μg/mL。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？股匾志εc試紙條相交處的刻度值即為氨芐西林和頭孢西丁對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度。

1.3.9 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌耐受基因轉(zhuǎn)錄的影響

參照韓淇安等[19]的方法進(jìn)行。按照1.3.1節(jié)方法活化阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544，加入檸檬醛使其質(zhì)量濃度為31.250、15.625 μg/L和0 μg/L，置于37 ℃搖床培養(yǎng)10 h（130 r/min）。將菌懸液離心（13 400×g，2 min，4 ℃）后棄去上清液，使用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取總RNA。使用超微量核酸分析儀測定RNA的純度、濃度，當(dāng)A260nm/A280nm在1.8～2.1之間時(shí)說明提取得到的RNA純度較高，無蛋白質(zhì)、化學(xué)大分子殘留，此時(shí)將總RNA濃度調(diào)成一致。隨后，使用Takara PrimeScriptTMRT reage nt Kit（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并保存于-20 ℃。

以ESA-04030a為內(nèi)參基因，選取與阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境耐受能力相關(guān)的10 個(gè)功能基因（表1）作為目標(biāo)，利用SYBR Green I染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，選擇兩步法PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法分析目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)RT-PCR所用的引物信息Table 1 Information about primers used for real-time RT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以 ±s表示（n=3），使用SPSS軟件（version 19.0，SPSS，Inc.，Chicago，IL）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法檢驗(yàn)結(jié)果間的顯著性，P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度

由圖1可知，檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制效果呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。當(dāng)檸檬醛質(zhì)量濃度高于500 μg/L時(shí)，阪崎克羅諾腸桿菌不能在TSB中生長；當(dāng)檸檬醛質(zhì)量濃度低于31.25 μg/L時(shí)，檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌生長無明顯抑制作用。因此，本研究選擇31.25 μg/L和15.625 μg/L為檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。

圖1 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響Fig. 1 Effects of citral on growth curve of C. sakazakii

2.2 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌干燥耐受能力的影響

圖2 檸檬醛處理對阪崎克羅諾腸桿菌干燥耐受能力的影響Fig. 2 Effects of citral on desiccation tolerance of C. sakazakii

由圖2可知，檸檬醛能顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌的干燥耐受能力。未經(jīng)檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌（對照組）在耐受干燥12 h后存活率與0 h無明顯差異，亞抑制濃度檸檬醛處理菌體在耐受干燥12 h后存活率明顯下降，且與對照組相比，隨著干燥作用時(shí)間延長，經(jīng)檸檬醛作用的菌體存活率下降較快。干燥處理144 h后，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L和15.625 μg/L檸檬醛處理的阪崎克羅諾腸桿菌存活率分別約為對照組的16%和46%。

2.3 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌滲透壓耐受能力的影響

表2 檸檬醛處理對阪崎克羅諾腸桿菌滲透壓耐受性的影響Table 2 Effects of citral on osmotic pressure tolerance of C. sakazakii

由表2可知，未經(jīng)檸檬醛作用的樣品（對照組）經(jīng)75 g/100 mL的山梨醇處理6 h后細(xì)菌存活率為25.53%，經(jīng)31.250 μg/L和15.625 μg/L檸檬醛處理后阪崎克羅諾腸桿菌存活率僅為對照組的34%和59%。75 g/100 mL山梨醇作用24 h后，亞抑制濃度檸檬醛處理菌體存活率低于對照組（P＜0.01）。高滲透壓處理36 h后，亞抑制濃度檸檬醛處理菌體存活率與對照組無顯著差異（P＞0.05）。在75 g/100 mL的山梨醇處理下，檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌耐受滲透壓的能力有明顯的抑制效果，且隨著檸檬醛質(zhì)量濃度的升高，其對阪崎克羅諾腸桿菌滲透壓耐受能力的抑制作用越顯著。

2.4 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌熱耐受能力的影響

圖3 不同溫度條件下檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌熱耐受能力的影響Fig. 3 Effects of citral on heat tolerance of C. sakazakii

由圖3A可知，加熱處理使菌體存活率顯著下降。與未經(jīng)檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌（對照組）相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛處理的菌體在50 ℃處理40 min后存活率顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)50 ℃處理100 min后，經(jīng)檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌的細(xì)菌存活率與對照組相比均存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖3B可知，未經(jīng)檸檬醛作用的菌體（對照組）在55 ℃加熱60 min后細(xì)菌存活率為0.11%，90 min時(shí)的細(xì)菌存活率與60 min間無顯著性差異（P＞0.05）。加熱90 min后，經(jīng)質(zhì)量濃度為15.625 μg/L檸檬醛作用的菌體存活率明顯低于對照組，約為對照組的14%，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛作用的菌體與對照組相比多下降了2 個(gè)數(shù)量級。

圖3C顯示，未經(jīng)檸檬醛作用和亞抑制濃度檸檬醛處理的菌體經(jīng)60 ℃加熱0～5 min內(nèi)細(xì)菌存活率無顯著差異（P＞0.05）。加熱10 min時(shí)，3 組阪崎克羅諾腸桿菌的存活率之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。加熱40 min時(shí)，對照組菌體存活率約為經(jīng)15.625 μg/L檸檬醛作用的菌體存活率的10 倍，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛作用的菌體與對照組相比多下降了4 個(gè)數(shù)量級。

2.5 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌酸耐受能力的影響

圖4 檸檬醛處理對阪崎克羅諾腸桿菌酸耐受能力的影響Fig. 4 Effects of citral on acid tolerance of C. sakazakii

由圖4可知，在酸化的TSB（pH 3.3）中培養(yǎng)60 min后，未經(jīng)檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌（對照組）細(xì)菌存活率下降為16.22%，與經(jīng)檸檬醛質(zhì)量濃度為15.625 μg/L作用的菌體存活率呈極顯著差異（P＜0.01）。而經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛作用的菌體存活率與未經(jīng)酸處理前相比菌體存活率下降3 個(gè)數(shù)量級。結(jié)果表明，檸檬醛能降低阪崎克羅諾腸桿菌對酸的耐受能力，且隨著檸檬醛質(zhì)量濃度的升高，對菌體酸耐受能力的抑制作用增強(qiáng)。

2.6 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌膽鹽耐受能力的影響

圖5 檸檬醛處理對阪崎克羅諾腸桿菌膽鹽耐受能力的影響Fig. 5 Effects of citral on bile salt tolerance of C. sakazakii

由圖5可知，未經(jīng)檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌（對照組）經(jīng)膽鹽處理4 h后細(xì)菌數(shù)量上升約0.25（lg（N/N0）），而經(jīng)15.625 μg/L檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌的上升值約為對照組增加菌量的33%，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌幾乎未上升。經(jīng)膽鹽處理12 h和24 h時(shí)，質(zhì)量濃度為31.250 μg/L和15.625 μg/L檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌存活率上升值與對照組相比極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，檸檬醛能降低阪崎克羅諾腸桿菌在膽鹽中的生長數(shù)量，且隨著檸檬醛質(zhì)量濃度的升高作用增強(qiáng)。

2.7 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌氨芐西林和頭孢西丁耐受能力的影響

圖6 氨芐西林對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌圈（A）和檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌氨芐西林耐受能力的影響（B）Fig. 6 Inhibition zone of ampicillin against C. sakazakii (A) and effect of citral on ampicillin resistance of C. sakazakii (B)

由圖6可知，氨芐西林對未經(jīng)檸檬醛處理（對照組）及經(jīng)15.625、31.25 μg/L和62.5 μg/L檸檬醛處理菌體的最小抑菌濃度分別為1.5、1.5、1.0、0.7 μg/mL，其中，經(jīng)31.25 μg/L和62.5 μg/L檸檬醛作用菌體的最小抑菌濃度與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。

圖7 頭孢西丁對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌圈（A）和檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌頭孢西丁耐受能力的影響（B）Fig. 7 Inhibition zone of cefoxitin against C. sakazakii (A) and effect of citral on cefoxitin resistance of C. sakazakii (B)

由圖7可知，頭孢西丁對未經(jīng)檸檬醛處理（對照組）的阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度為6.0 μg/mL，經(jīng)檸檬醛質(zhì)量濃度為15.625 μg/L作用的菌體和對照組相比，頭孢西丁對菌體的最小抑菌濃度無顯著差異（P＞0.05）。頭孢西丁對31.25 μg/L和62.5 μg/L檸檬醛作用菌體的最小抑菌濃度分別降低為4.1 μg/mL和2.9 μg/mL，與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。本研究結(jié)果表明，檸檬醛增強(qiáng)了阪崎克羅諾腸桿菌對抗生素氨芐西林和頭孢西丁的敏感性，且隨檸檬醛質(zhì)量濃度升高，作用效果增強(qiáng)。

2.8 檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌相關(guān)耐受基因轉(zhuǎn)錄的影響

圖8 檸檬醛處理對阪崎克羅諾腸桿菌相關(guān)耐受基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig. 8 Effects of citral on expression of genes associated with environment stress tolerance in C. sakazakii

由圖8可知，檸檬醛可顯著影響阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并且作用效果呈現(xiàn)濃度依賴性。其中，與阪崎克羅諾腸桿菌耐酸性相關(guān)的基因fur、phoP/phoQ在檸檬醛質(zhì)量濃度為31.250 μg/L分別下調(diào)了1.80、1.65 倍和2.44 倍。耐熱指示基因mfla-1165在檸檬醛質(zhì)量濃度為15.625、31.250 μg/L時(shí)分別下調(diào)了1.63 倍和3.63 倍。ompR、ompC和osmY是與阪崎克羅諾腸桿菌滲透壓、干燥和膽鹽耐受性相關(guān)的基因，檸檬醛作用時(shí)三者的表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，在31.250 μg/L檸檬醛作用下分別下調(diào)了3.64、2.13 倍和1.63 倍，在15.625 μg/L檸檬醛作用下分別下調(diào)了3.12、1.11 倍和1.17 倍。

3 討 論

阪崎克羅諾腸桿菌對多種不良環(huán)境有著良好的環(huán)境耐受能力，嬰幼兒奶粉中的阪崎克羅諾腸桿菌在生產(chǎn)加工、貯存運(yùn)輸、復(fù)原沖調(diào)以及消化吸收的過程中要經(jīng)過干燥、高溫、高滲透壓、胃中酸性環(huán)境、腸道膽汁等作用，最終作用于宿主腸道引發(fā)腸道炎癥及更深層次的疾病。因此，降低菌體的環(huán)境耐受能力對于控制阪崎克羅諾腸桿菌的存活及感染能力具有重要的作用。前期，本研究團(tuán)隊(duì)探究了多種植物源活性物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用，證明了檸檬醛具有良好的抑菌效果[20]，并且發(fā)現(xiàn)檸檬醛在亞抑制濃度下能夠抑制阪崎克羅諾腸桿菌的毒力因子從而降低其致病能力[12]，本研究探究了亞抑制濃度的檸檬醛降低阪崎克羅諾腸桿菌多種環(huán)境耐受能力及降低菌體對抗生素敏感性的作用。

嬰幼兒配方乳粉是阪崎克羅諾腸桿菌的主要污染來源和傳播途徑，由于阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的耐干燥能力，其能夠在乳粉的貨架期內(nèi)長期存活[6]。本研究結(jié)果表明，亞抑制濃度的檸檬醛能夠顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌的耐干燥能力，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。Amalaradjou等[16]也有類似的發(fā)現(xiàn)，反式肉桂醛也能夠降低阪崎克羅諾腸桿菌的耐受干燥的能力，經(jīng)750 μmol/L的反式肉桂醛作用的菌體在干燥7 d后，與對照組相比細(xì)菌數(shù)量下降了1.0（lg（CFU/mL））。菌體外膜蛋白OmpA、OmpC和伴侶蛋白GroES被證明與阪崎克羅諾腸桿菌的耐干燥能力相關(guān)。本研究實(shí)時(shí)RT-PCR表明，檸檬醛能夠顯著降低菌體ompA、ompC和groES基因的相關(guān)轉(zhuǎn)錄，推測檸檬醛可能是通過影響這3 個(gè)基因與耐受干燥相關(guān)蛋白的形成從而降低了菌體的耐干燥能力。

阪崎克羅諾腸桿菌對高滲透壓環(huán)境的適應(yīng)性是其能夠在嬰幼兒配方奶粉及其他食品生產(chǎn)加工過程中生存和生長的關(guān)鍵。Breeuwer等[21]發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾腸桿菌相比大腸桿菌、沙門氏菌和其他腸桿菌科菌株對高滲透壓的耐受能力更強(qiáng)，且該菌能通過金屬離子積累以及可溶性物質(zhì)如海藻糖、脯氨酸、糖膠和甜菜堿增加細(xì)胞間的滲透壓，維持大分子周圍的水膜來防止細(xì)胞間的脫水作用。本研究通過在溶液中添加75 g/100 mL的山梨醇使aw為0.81模擬奶液濃縮環(huán)節(jié)的高滲透壓環(huán)境，結(jié)果表明，檸檬醛可降低阪崎克羅諾腸桿菌的滲透壓耐受能力，檸檬醛作用后的菌體在高滲壓處理36 h后的存活率僅為0.1%左右。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)青霉素能增加單核細(xì)胞增生李斯特菌對滲透壓的敏感性，從而降低其對高滲透壓的耐受性。高滲條件下，外膜孔蛋白OmpC，滲透性應(yīng)答調(diào)節(jié)器OmpR和滲透誘導(dǎo)蛋白OsmY扮演滲透保護(hù)劑跨膜運(yùn)輸載體的角色[23]。本研究實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果表明，檸檬醛使阪崎克羅諾腸桿菌ompC、ompR和osmY 3 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄量均降低，因此推測檸檬醛可能通過影響滲透保護(hù)劑跨膜運(yùn)輸載體的形成，從而降低阪崎克羅諾腸桿菌的滲透壓耐受性。

高溫?zé)崴疀_調(diào)是奶粉中阪崎克羅諾腸桿菌進(jìn)入人體前的最后一道防線。阪崎克羅諾腸桿菌的生長溫度范圍為3.6～47.6 ℃，與其他腸桿科菌類相比可以耐受更高的溫度[24]。Nazarowecwhite等[25]通過測定在52、54、56、58、60 ℃的嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾腸桿菌耐熱性發(fā)現(xiàn)它具有良好的耐熱能力。通常，為防止高溫沖調(diào)造成嬰幼兒奶粉營養(yǎng)成分損失，常用50～60 ℃的溫水沖調(diào)，因此選取50、55 ℃和60 ℃三個(gè)溫度探究檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌熱耐受性的影響，結(jié)果表明，檸檬醛能夠顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌在3 個(gè)溫度下的耐熱能力，且60 ℃時(shí)檸檬醛降低阪崎克羅諾腸桿菌耐熱能力的效果最強(qiáng)。Lim等[26]也得到相似結(jié)論，番石榴提取物對沙門氏菌耐熱性具有良好的抑制作用。Lategan等[27]發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)添加劑如環(huán)氧乙烷、丁二烯二氧化碳和乙酸，均能降低鼠傷寒沙門氏菌的耐熱性。RNA聚合酶σ因子（RpoS）與阪崎克羅諾腸桿菌種環(huán)境耐受能力相關(guān)[28]。Mfla-1165蛋白被提議作為阪崎克羅諾腸桿菌耐熱性的生物學(xué)標(biāo)志[29]。本研究實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析表明，檸檬醛能使rpoS和mfla-1165轉(zhuǎn)錄水平降低，因此，推測檸檬醛是通過調(diào)節(jié)阪崎克羅諾腸桿菌熱應(yīng)力相關(guān)蛋白的表達(dá)來降低其耐熱能力。

胃酸是宿主抵抗食源性致病菌的一道重要的防線，前期研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌能夠在酸性環(huán)境下存活甚至生長[30]，使得嬰幼兒在食用被阪崎克羅諾腸桿菌污染的乳粉后，菌體將能夠突破胃酸屏障從而引起壞死性小腸結(jié)腸炎等腸道炎癥，增大了菌體感染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究證明亞抑制濃度的檸檬醛能夠降低阪崎克羅諾腸桿菌對酸性環(huán)境的耐受能力，經(jīng)質(zhì)量濃度為31.250 μg/L檸檬醛作用的阪崎克羅諾腸桿菌在酸性環(huán)境（pH 3.3）中生存60 min后菌量下降3（lg（CFU/mL））。Lehrke等[31]現(xiàn)經(jīng)過Nisin和綠茶提取物作用的單核細(xì)胞增生李斯特菌對酸性環(huán)境的敏感性增強(qiáng)，經(jīng)Nisin（30 IU/mL）和綠茶提取物（5 390 mg/L）處理48 h并耐受酸性環(huán)境（pH 4.0）1 h后，單增李斯特菌CIP 80.11分別下降2.7（lg（CFU/mL））和1.4（lg（CFU/mL）），而未經(jīng)作用的菌體數(shù)量僅下降0.2（lg（CFU/mL））。Fur蛋白（鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白）和PhoP/PhoQ雙組份系統(tǒng)（菌體感知環(huán)境的傳感器）與大腸桿菌和沙門氏菌的耐酸能力相關(guān)[32-33]。本研究實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果表明，檸檬醛可顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌phoP/phoQ和fur基因的轉(zhuǎn)錄。因此，推測檸檬醛可通過影響阪崎克羅諾腸桿菌PhoP/PhoQ雙組份系統(tǒng)的傳感調(diào)節(jié)功能及Fur蛋白的表達(dá)從而降低菌體的耐酸能力。

腸道中的膽鹽能夠通過破壞細(xì)胞膜中的磷脂結(jié)構(gòu)、降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白、影響微生物的生長等多種方式發(fā)揮其對細(xì)菌的抑殺作用[10]，阪崎克羅諾腸桿菌是腸道中的定植菌，其能夠耐受一定濃度的膽鹽環(huán)境。健康人體內(nèi)膽鹽通常在2%左右波動(dòng)[17]，因此測定亞抑制濃度檸檬醛作用后的阪崎克羅諾腸桿菌在2%膽鹽下的生長情況。結(jié)果顯示檸檬醛處理后的阪崎克羅諾腸桿菌在2%膽鹽環(huán)境中的生長速度明顯下降，且作用效果呈現(xiàn)濃度依賴性。檸檬醛作用使得阪崎克羅諾腸桿菌在腸道膽鹽環(huán)境中生長緩慢，這將使菌體脂多糖產(chǎn)生量減少且對腸上皮細(xì)胞的黏附和侵入數(shù)量降低。

目前，抗生素治療是控制阪崎克羅諾腸桿菌感染的主要方法，一些研究表明阪崎克羅諾腸桿菌對常用抗生素較為敏感，但長期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致阪崎克羅諾腸桿菌耐藥性增加，這增大了控制其感染的難度[34]。本研究結(jié)果表明，亞抑制濃度的檸檬醛能夠增加阪崎克羅諾腸桿菌對氨芐西林和頭孢西丁這兩種抗生素的敏感性，且呈現(xiàn)濃度依賴性。Zanini等[18]也有類似的發(fā)現(xiàn)，檸檬醛和香芹酚能夠增加單核細(xì)胞性李斯特菌和英諾克李斯特菌對紅霉素和黏菌素的敏感性，并推測檸檬醛和香芹酚是通過影響菌體細(xì)胞膜的通透性從而使抗生素更容易到達(dá)作用靶點(diǎn)，達(dá)到殺菌的目的。Karumathil等[35]證明亞抑制濃度的反式肉桂醛和丁香酚能夠增強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，并且發(fā)現(xiàn)這兩種天然物質(zhì)影響了菌體外排泵的功能，但沒有增加菌體細(xì)胞膜的通透性。實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果表明，天然物質(zhì)顯著降低了鮑曼不動(dòng)桿菌與耐受β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

4 結(jié) 論

本研究以檸檬醛為研究對象，以阪崎克羅諾腸桿菌為作用主體，探究了檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的環(huán)境壓力耐受能力和抗生素敏感性的影響。首先利用液體稀釋法測定不同質(zhì)量濃度檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響，確定檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的亞抑制濃度；接著探究了亞抑制濃度的檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌干燥、滲透壓、熱、酸和膽鹽耐受能力的影響；同時(shí)，研究利用E-test?法檢測了檸檬醛作用后的阪崎克羅諾腸桿菌對抗生素氨芐西林和頭孢西丁敏感性的變化；最后利用實(shí)時(shí)RT-PCR分析了檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境耐受相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果表明檸檬醛可降低阪崎克羅諾腸桿菌干燥、滲透壓、熱、酸、膽鹽的耐受能力，且呈現(xiàn)濃度依賴性；并且，亞抑制濃度的檸檬醛增強(qiáng)了菌體對氨芐西林和頭孢西丁的敏感性；實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果表明，檸檬醛降低了與阪崎克羅諾腸桿菌環(huán)境耐受能力相關(guān)的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平。上述研究結(jié)果表明：檸檬醛可降低阪崎克羅諾腸桿菌的多種環(huán)境壓力耐受能力，增強(qiáng)菌體對抗生素的敏感性。這為檸檬醛應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工過程中控制阪崎克羅諾腸桿菌奠定理論基礎(chǔ)，也為天然活性物質(zhì)控制食源性致病菌提供新的思路。