PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)克羅諾桿菌中外分離株的分型比較

王小曼，趙 煒，李詩(shī)瑤，周幗萍

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.南通海關(guān)監(jiān)管科，江蘇 南通 226002；3.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430030）

克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種無(wú)芽孢的革蘭氏陰性條件致病菌，主要引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、敗血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，死亡率高達(dá)40%～80%，患者痊愈后仍會(huì)有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。HEALY B等[1]的報(bào)道顯示，一些免疫力缺陷的成人尤其是老人也會(huì)被感染，會(huì)導(dǎo)致如肺炎、膿毒癥、腳潰瘍、局部感染、骨髓炎、脾膿腫等疾病。但與成年人感染情況相比，5歲以下的兒童發(fā)生克羅諾桿菌的感染比例更高[2]。

分類(lèi)系統(tǒng)將克羅諾桿菌獨(dú)立為屬，包括七個(gè)種：阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、蘇黎世克羅諾桿菌（Cronobacter turicensis）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronobacter malonaticus）、莫金斯克羅諾桿菌（Cronobacter muytjensii）、都柏林克羅諾桿菌（Cronobacter dublinensis）、康帝蒙提克克羅諾桿菌（Cronobacter condiment）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）[3-4]?？肆_諾桿菌存在于食品和環(huán)境中，其分離來(lái)源較為廣泛，從肉類(lèi)、蔬菜、水果、谷物、牛奶、奶粉替代品、加工奶酪、水[5-7]等食品，草藥[8]、香料[9-10]以及家庭灰塵、土壤樣本等環(huán)境[11]，甚至在果蠅[12]的腸道均有分離出該細(xì)菌。即食食品[13-14]中的克羅諾桿菌的分離率較高，可見(jiàn)多種食品均存在克羅諾桿菌的污染。有研究發(fā)現(xiàn)，新生兒患腦膜炎主要與阪崎克羅諾桿菌克隆復(fù)合物CC4有關(guān)，而成人感染相關(guān)菌株集中在ST7和ST1型，ST12與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎有關(guān)。因此對(duì)克羅諾桿菌分離株進(jìn)行準(zhǔn)確的分型鑒定尤為重要，有利于對(duì)疾病爆發(fā)進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)防[15-18]。

多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）方法[19]已經(jīng)成功地將臨床相關(guān)的克羅諾桿菌菌株聚集到特定的序列型別（sequence type，ST）或克隆復(fù)合體（clonal complex，CC）中，形成穩(wěn)定的進(jìn)化譜系。CC型包括3個(gè)或3個(gè)以上的ST型分型組，較為流行的ST型在細(xì)菌群組中占據(jù)最核心的位置[20]。克羅諾桿菌具有多種ST型，但許多新生兒腦膜炎病例主要是由阪崎克羅諾桿菌ST4型引起的[21]。2015年，ZENG H等[22]報(bào)道了一例由阪崎克羅諾桿菌株引起的新生兒腦膜炎病例，該菌株為新的多藥耐藥菌株，其序列型為阪崎克羅諾桿菌ST256。武漢市婦幼保健院[23]還從2例嬰兒腦膜炎患者體內(nèi)分離出了多重耐藥性菌株，分別為丙二酸鹽克羅諾桿菌ST60和阪崎克羅諾桿菌ST83。2016年，南京市某兒童醫(yī)院[24]從重癥肺炎新生兒的痰標(biāo)本中獲得了阪崎克羅諾桿菌ST1型菌株。2016年10年，南京江寧某中學(xué)[25]出現(xiàn)了疑似由克羅諾桿菌污染的千張燒肉引起的腹痛，腹瀉的食物中毒事件。

本文將對(duì)PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的中國(guó)克羅諾桿菌分離株（截至2019年6月28日，下載PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/cronobacter/）的克羅諾桿菌分離株提交信息，包括分離來(lái)源、分離時(shí)間和國(guó)家、血清型，克隆譜系和ST型等進(jìn)行分析，利用Excel分析PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中全球克羅諾桿菌的分離來(lái)源，分布情況，以及序列分型的多樣性，并著重分析中國(guó)的克羅諾桿菌的分布情況，對(duì)比中國(guó)臨床株與國(guó)外臨床株的致病情況，深入比較分離株的遺傳多樣性，揭示其進(jìn)化關(guān)系，為檢測(cè)我國(guó)食品中的克羅諾桿菌提供理論依據(jù)。

1 PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中克羅諾桿菌的全球分布狀況

截至2019年6月28日，從PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/cronobacter/）中下載的克羅諾桿菌分離株信息，篩選出具有完整ST型的分離株2 407株，包含657種ST型和52種CC型。

1.1 地區(qū)分布

如表1所示，在PubMLST總數(shù)據(jù)庫(kù)中，分離株主要來(lái)源是亞洲和歐洲：其中亞洲提交的分離株最多（992株），其中僅中國(guó)就提交907株，歐洲（899株）主要包括捷克、愛(ài)爾蘭、德國(guó)、英國(guó)和法國(guó)提交的菌株；其次為北美洲、大洋洲和南美洲：北美洲（274株）以美國(guó)提交的菌株為主；大洋洲（98株）以澳大利亞提交的菌株為主；南美洲（66株）以巴西提交的菌株為主；最少的是非洲（4株）。由此可見(jiàn)，以國(guó)家為單位，中國(guó)的克羅諾桿菌分離株數(shù)量最多，反映了我國(guó)學(xué)者充分利用PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)的積極性和能力，也為本文的分析提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表1 全球克羅諾桿菌分離株分布情況Table 1 Distribution of global Cronobacter isolates

1.2 分離來(lái)源

提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中的克羅諾桿菌分離株主要來(lái)源于食品、臨床、環(huán)境等。如表2所示，我國(guó)提交的食品株最多，為580株，主要包括嬰幼兒配方奶粉（188株），香料（97株），食品配料（19株）以及即食食物（88株）；愛(ài)爾蘭提交的環(huán)境株最多，為88株；捷克提交的臨床株最多，為87株，而我國(guó)臨床株數(shù)量較少，僅有38株。

因克羅諾桿菌主要危害2歲以下嬰幼兒，而嬰幼兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是其主要感染途徑，其中，PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中PIF分離株的ST型分布如圖1所示，ST4和ST1是其中的主要型別，但我國(guó)分離株優(yōu)勢(shì)型別中還有ST64，ST83，ST12型等；而其他國(guó)家的優(yōu)勢(shì)型別則包括ST13，ST7，ST297，ST14型，與我國(guó)的數(shù)據(jù)存在一定的差異。ST4型菌株被認(rèn)為與新生兒腦膜炎高度相關(guān)，卻是中外嬰幼兒配方奶粉中檢出率最高的克羅諾桿菌型，但該ST型在中國(guó)分離株中占比（19.1%）顯著低于國(guó)外（27.1%），另一個(gè)被認(rèn)為與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎高度相關(guān)的致病型ST12（4.8%）卻在中國(guó)占有較高的比例，但在國(guó)外則無(wú)ST12，不占優(yōu)勢(shì)。

表2 全球克羅諾桿菌分離株主要來(lái)源Table 2 Main sources of global Cronobacter isolates

圖1 嬰幼兒配方奶粉中完整序列型分布Fig.1 Distribution of complete sequence types in infant milk formula

2 克羅諾桿菌7個(gè)管家基因的保守性與多樣性

PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中克羅諾桿菌分離株的等位基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，7個(gè)管家基因片段的等位基因值在182～346之間，pps等位基因數(shù)目最多，為346個(gè)，其等位基因多樣性最為豐富；fusA等位基因數(shù)目最少，為182個(gè)，atpD等位基因數(shù)目也較少，為183個(gè)，可見(jiàn)這兩個(gè)管家基因在菌株間差異較小，與其他管家基因序列相比更為保守。

3 中國(guó)克羅諾桿菌分析

3.1 中國(guó)克羅諾桿菌分離株ST型和CC型分布狀況

篩選PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)，具有完整ST型的中國(guó)分離株有907株，占全球分離株的37.7%，但是我國(guó)的ST型和CC型分別為366種（占總數(shù)據(jù)的55.7%）和43種（占總數(shù)據(jù)的82.7%），可見(jiàn)中國(guó)的克羅諾桿菌分離株相對(duì)于其他國(guó)家地區(qū)分離株具有更為豐富的ST型和CC型。

圖2 中國(guó)分離株完整序列型與克隆復(fù)合體型分布Fig.2 Distribution of complete sequence types and clonal complex types of isolated strains in China

如圖2a所示，ST型主要包括ST4（89株），ST1（81株），ST64（44株），ST7（35株），ST8（27株），占總ST型的30.43%；其中ST4，ST1，ST64，ST8均屬于阪崎克羅諾桿菌（Cronobacterium sakazakii）；ST7屬于丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronobacter malonaticus）。

如圖2b所示，CC型主要包括CC4（103株，以ST4為核心），CC1（88株，以ST1為核心），CC7（54株，以ST7為核心），CC64（52株，以ST64為核心），CC8（32株，以ST8為核心），占總CC型的59.6%。

3.2 中國(guó)分離株來(lái)源和物種分布情況

表3 中國(guó)分離株主要來(lái)源和物種分布情況Table 3 Distribution of main sources and species of isolated strains in China

如表3所示，中國(guó)分離株主要來(lái)源于食品，包括嬰幼兒配方奶粉、香料、食品配料、即食食品以及蔬菜等。嬰幼兒配方奶粉中的分離株最多（188株），臨床分離株則較少（38株）；克羅諾桿菌屬7個(gè)種均存在于中國(guó)分離株中，其中阪崎克羅諾桿菌602株，丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌143株以及都柏林克羅諾桿菌104株的數(shù)量最多。而前兩者在我國(guó)臨床分離株中占比卻高達(dá)92.1%。

水和環(huán)境分離株分別有38和31株，占比僅為8.9%，這與在我國(guó)克羅諾桿菌主要與食品安全特別是嬰幼兒食品安全高度相關(guān)，對(duì)其生態(tài)分布的研究不多有關(guān)。但也說(shuō)明食品原料生產(chǎn)及加工環(huán)境中該菌的遍在性，污染途徑多樣，杜絕其污染的難度不小。

3.3 阪崎克羅諾桿菌ST4，ST12及丙二酸鹽克羅諾桿菌ST7型的分布以及來(lái)源分析

英國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)新生兒腦膜炎病例主要與阪崎克羅諾桿菌ST4型相關(guān)，中國(guó)ST4型分離株有89株，分布廣泛，如表4所示，主要來(lái)源為嬰幼兒配方奶粉、即食食品、奶粉、香料，同時(shí)在嬰兒面條、冰淇淋、乳清蛋白粉、蔬菜等中也有分離出，但臨床分離株非常少（2株）。

阪崎克羅諾桿菌ST12型與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎有關(guān)，中國(guó)ST12型分離株有14株，主要來(lái)源于嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方米粉、奶粉、即食食品以及香料中，未見(jiàn)臨床分離株。

表4 中國(guó)克羅諾桿菌ST4、ST12型與ST7型來(lái)源Table 4 Sources of Cronobacter ST4,ST12 and ST7 in China

丙二酸鹽克羅諾桿菌中ST7型被認(rèn)為與成年人感染相關(guān)，中國(guó)ST7型分離株共有35株，主要來(lái)源于冰淇淋、即食食品、嬰幼兒配方米粉、水，從奶粉、香料、蔬菜、牛奶中也有分離出，但未見(jiàn)臨床分離株。

3.4 國(guó)內(nèi)外中國(guó)臨床分離株比較

對(duì)PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)國(guó)外臨床株ST型分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，國(guó)外臨床株有365株，明確致病的菌株有53株，提交國(guó)家包括法國(guó)（29株），美國(guó)（17株），以色列（3株），新西蘭（2株），英國(guó)（1株），巴西（1株）。明確致病的ST4菌株有39株，占所有明確致病臨床株的73.6%，特別在嚴(yán)重致死感染中占比極為突出，如在導(dǎo)致壞死性小腸結(jié)腸炎菌株中占到83.3%，在腦膜炎、腦膿腫等腦部疾病致病株中占比70.0%，在其他如菌血癥、腹瀉等嚴(yán)重感染中占比55.5%。所以有學(xué)者明確指出ST4型與新生兒腦膜炎之間具有顯著相關(guān)性[21]。

PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)國(guó)外ST21分離株主要分離于成年人糞便，肺標(biāo)本以及腹膜液；ST148（1株）分離自老年人血液中；ST60主要為成年人臨床株，但無(wú)進(jìn)一步的臨床信息；ST256曾從絲光綠蠅消化道中分離出，但未出現(xiàn)臨床株；ST201無(wú)臨床株，僅有一株從食品配料中分離出。國(guó)外與嬰幼兒腦病相關(guān)的CC4型菌株（16株），包括ST4，ST107，ST109；其他ST型如ST1，ST307，ST494也會(huì)導(dǎo)致腦??；1998年以色列新生兒感染阪崎克羅諾桿菌病例中，從患敗血癥腦膜炎并發(fā)癥新生兒血液中分離出ST83菌株[26-27]；ST12會(huì)導(dǎo)致壞死性小腸結(jié)腸炎；ST8則與腹瀉有關(guān)；在法國(guó)嬰兒重癥監(jiān)護(hù)室爆發(fā)克羅諾桿菌感染案例中，分離出3株ST13，兩株分離自無(wú)癥狀新生兒，一株分離自具有消化問(wèn)題的新生兒[28]。值得引起注意的是都柏林克羅諾桿菌ST80和ST88曾引起病人膿腫；蘇黎世克羅諾桿菌ST19也曾引起新生兒致死性腦膜炎[29]；尤尼沃斯克羅諾桿菌ST59與腿部感染有關(guān)[30]。國(guó)外[31]曾報(bào)道兩例由克羅諾桿菌引起的血性腹瀉案例與我國(guó)報(bào)道的腹瀉事件癥狀略有不同。

我國(guó)臨床分離株（38株）主要為阪崎克羅諾桿菌（22株）和丙二酸鹽克羅諾桿菌（13株），同時(shí)出現(xiàn)了都柏林克羅諾桿菌（2株），蘇黎世克羅諾桿菌（1株）。與國(guó)外上傳的數(shù)據(jù)相比，我國(guó)明確致病菌株為阪崎克羅諾桿菌（13株）與丙二酸鹽克羅諾桿菌（5株），與腦膜炎有關(guān)的臨床株有ST256（1株），ST60（2株），ST83（2株），沒(méi)有ST4型；與肺炎相關(guān)的臨床株為ST1（3株）；未注明病癥的患者分離株有10株，包括ST1（1株），ST4（2株），ST13（2株），ST201（3株），ST21（1株），ST148（1株）。ST4菌株只有2株而且未注明致病情況，僅占臨床分離株的5.3%，我國(guó)也沒(méi)有任何臨床分離株為ST7型，與國(guó)外情況存在極大差異。

4 結(jié)束語(yǔ)

MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中目前具有2407株完整ST型克羅諾桿菌菌株，分離源主要是亞洲和歐洲的國(guó)家，非洲，大洋洲等地區(qū)的克羅諾桿菌分離株較少，這可能是不同地區(qū)的檢測(cè)手段和重視程度不同。目前我國(guó)的克羅諾桿菌食品分離株較多，分布較為廣泛，除嬰幼兒食品、即食食品、香料、蔬菜外，冰淇淋、糖果等也有分離株。阪崎克羅諾桿菌ST1和ST4的食品分離株占比較大，且分離自嬰幼兒配方奶粉的ST4型（36株）和ST1型（26株）較多，與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎相關(guān)的ST12菌株也占較高的比例，雖然我國(guó)關(guān)于嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌檢測(cè)的工作開(kāi)展范圍較廣，但LIU H等[7，32]從飲用水中也檢測(cè)到了克羅諾桿菌，可見(jiàn)克羅諾桿菌的污染可能會(huì)通過(guò)嬰幼兒配方奶粉以外的途徑傳播，并且我國(guó)香料中克羅諾桿菌檢出率也相當(dāng)高，而且為避免揮發(fā)常在加熱殺菌后才加入，使其成為克羅諾桿菌的污染載體。HU J等[33]從環(huán)境和土壤中檢測(cè)出克羅諾桿菌，環(huán)境也可能是感染克羅諾桿菌的因素，應(yīng)當(dāng)引起重視。

從物種分布來(lái)看，我國(guó)分離株主要包括阪崎克羅諾桿菌（602株），丙二酸鹽克羅諾桿菌（143株）和都柏林克羅諾桿菌（104株）。我國(guó)臨床株中除阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌，也出現(xiàn)了都柏林克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌，國(guó)外曾出現(xiàn)過(guò)蘇黎世克羅諾桿菌引發(fā)新生兒致死性腦膜炎，因而克羅諾桿菌屬其他種的致病性也應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。另外，克羅諾桿菌以非典型食物中毒感染聞名，YONG W等[36]發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌不僅會(huì)影響嬰幼兒和免疫力低下成人，還可能作為食源性急性腸胃炎的病原體影響健康的成年人。

我國(guó)分離株中ST4，ST12和ST7型菌株較多，但主要是食品分離株，臨床株較少（ST1為4株，ST4為2株），ST7無(wú)臨床分離株。而數(shù)據(jù)庫(kù)中除了以色列之外其他亞洲國(guó)家均未見(jiàn)臨床株，我國(guó)臨床株也較少（38株），而我國(guó)菌株總數(shù)量在數(shù)據(jù)庫(kù)中占比高達(dá)37.7%，致病型菌株卻僅占9.4%。且我國(guó)有明確致病信息和型別的信息與歐美國(guó)家的致病型差異也很大：僅有ST256，ST60以及ST83與新生兒腦膜炎相關(guān)；中國(guó)的文獻(xiàn)中僅有1例克羅諾桿菌ST83致死的案例報(bào)道。PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的907株克羅諾桿菌中國(guó)分離株信息也證實(shí)我國(guó)學(xué)者的科研能力和對(duì)克羅諾桿菌的重視程度，因此可能是我國(guó)的克羅諾桿菌與其他國(guó)家地域的菌株在系統(tǒng)進(jìn)化和毒力上具有差異，或者與該細(xì)菌的感染對(duì)象-人種差異有關(guān)。