響應面法優(yōu)化多依果酒的釀造工藝

黃艷麗，尹錦榮，王 瓊，虞志君，袁其敏，楊超凡，趙 秀

（云南農(nóng)業(yè)大學 熱帶作物學院，云南 普洱 665000）

多依果（Docynia delavayi fruit）又稱栘衣果、酸蘋果，是薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）栘[木衣]屬（Docynia）熱帶經(jīng)濟作物云南栘（Docynia delavayi（Franch.）Schneid.）的果實。云南栘主要分布于亞洲，在我國產(chǎn)于云南、貴州、四川等西南各地[1-2]。多依營養(yǎng)豐富，食藥兩用[3]，其富含多種氨基酸，具有健胃消食和抗疲勞的作用[4-5]；且其還是一味傣藥，含有黃酮類[6-13]、多酚類[14-15]等活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和治療心血管病的藥用價值[16]。多依果是云南省極具地方特色的熱帶水果，當?shù)厝舜罅坎烧秤?，栘依產(chǎn)業(yè)對提高山區(qū)農(nóng)民收入和生活水平具有重要的意義。

多依果中粗纖維和植物單寧含量較高，生吃時質(zhì)地酸澀[15]，使得外地受眾較少，因而造成了多依果資源的大量浪費。目前，受限于地域環(huán)境特征，關(guān)于多依果產(chǎn)品的研究開發(fā)，報道較少[17]。朱明君等[18]通過人工接種冠突散囊菌（Eurotium cristatum）固態(tài)發(fā)酵多依果茶飲料，并研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后果茶的呈味氨基酸和人體必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)升高，這表明通過發(fā)酵可以改變多依果鮮果的粗渣口感；冀智勇等[19-20]對多依果的營養(yǎng)成分進行了研究，并在此基礎(chǔ)上介紹了多依腌制果、果醬、果脯、果角、果片、果飲料、果醋、果酒的粗加工工藝，但加工方法簡單，且沒有對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。多依果在民間的酒釀歷史悠久，但受到技術(shù)水平的限制，風味口感各異，難以大規(guī)模推廣。因此，研究多依果酒的釀造工藝并加以科學優(yōu)化，既可以將多依果的營養(yǎng)成分保存到果酒中，豐富果酒品種，又可充分利用多依果的野生資源，進而推動多依果產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

酵母菌生長繁殖的適宜溫度為20～25 ℃左右。受亞熱帶季風氣候影響，多依果主產(chǎn)地普洱市四季如春，在10～12月份多依果成熟采摘期時日溫差約為18～26 ℃，因此，當?shù)囟嘁拦漆勚贫噙x擇自然溫度發(fā)酵。本研究以多依果為原料，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵多依果酒，以酒精度、可溶性固形物含量及感官評分為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應面法優(yōu)化多依果酒的釀造工藝參數(shù)，旨在釀造一款具有多依果典型香氣和富含其多種營養(yǎng)成分的果酒，為多依果產(chǎn)品的開發(fā)以及多依果酒的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多依果（黃熟期）：云南普洱農(nóng)貿(mào)市場；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（10 000 U/mL）：諾維信生物有限公司；白砂糖（食品級）：深圳安泰生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E分析天平：美國METTLER TLLEDO公司；HC-3618R高速冷凍離心機：安徽中科中佳公司；LH-B55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司；PB-10酸度計：北京賽多利斯科學儀器有限公司；GMK-702R糖度測定儀：北京西諾遠大科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多依果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：挑選無病蟲害、無霉變、無破損的黃熟期多依果，洗凈，晾干。

切塊、打漿：鮮果稱質(zhì)量，切塊，按料液比2∶1（g∶mL）加水，混合打漿。

酶解：添加0.2%的果膠酶于果漿中，室溫酶解6 h。

糖度調(diào)整：添加試驗所需白砂糖量，以達到果酒發(fā)酵所需的酒精度要求。

殺菌：添加試驗所需的二氧化硫進行滅菌。

酵母活化：稱取試驗所需酵母菌用量，加入5 mL無菌水，在35 ℃條件下水浴活化30 min，備用。

接種發(fā)酵：將活化后的酵母液接入到發(fā)酵罐中酶解后的果漿中，室溫發(fā)酵，并且定期攪拌排氣。

過濾、陳釀：發(fā)酵液紗布過濾，酒液密封陳釀1～2個月，得多依果酒。

1.3.2 多依果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗

根據(jù)預試驗結(jié)果確定初始發(fā)酵條件為白砂糖添加量24%、二氧化硫添加量6%、酵母菌添加量3%，室溫（日溫差18～26 ℃）發(fā)酵7 d。在此基礎(chǔ)上，分別改變白砂糖添加量（20%、22%、24%、26%、28%）、二氧化硫添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、酵母菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d），測定多依果發(fā)酵液的酒精度及可溶性固形物含量，并進行感官評定。

1.3.3 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵時間為6 d，選取對多依果發(fā)酵液酒精度、感官評分具有顯著性影響的因子白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）和酵母菌接種量（C）作為考察因素，酒精度（Y）為響應值進行3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

1.3.4 測定方法

（1）理化指標

酒精度：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法測定；總糖、總酸含量：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定、酸堿滴定法測定；可溶性固形物含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中折光計法測定。

（2）微生物指標

菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》測定；大腸菌群計數(shù)：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》測定。

（3）感官評價

根據(jù)多依果果酒的特點，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官檢查與評定方法和標準，制定多依果感官評分標準，并組建感官評定小組20人進行感官評分，取其平均值為評分結(jié)果。感官評分標準見表2。

表2 多依果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Docynia delavayi fruit wine

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 10進行響應面試驗設計與分析，采用Origin 2008進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 多依果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 白砂糖添加量對多依果酒發(fā)酵的影響

白砂糖添加量對多依果酒發(fā)酵的影響見圖1。由圖1可知，白砂糖添加量在20%～28%的范圍內(nèi)，隨著白砂糖添加量的逐漸增加，多依果酒的酒精度和感官評分均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，可溶性固形物含量則呈現(xiàn)先持平后升高的趨勢。當白砂糖添加量＜24%之前，白砂糖添加量過低，發(fā)酵不充分，導致果酒的酒精度偏低，且口感發(fā)澀，感官評分偏低；當白砂糖添加量為24%時，果酒的酒精度達到最高（7.30%vol），此時酒液感官評分也是最佳（96分）；而當白砂糖添加量＞24%之后，可溶性固形物含量急劇上升，殘?zhí)橇窟^多，反而不利于酵母菌的繁殖，導致果酒的酒精度下降，而且過甜的口感也使得感官評分不高。因此，確定最佳的白砂糖添加量為24%。

2.1.2 二氧化硫添加量對多依果酒發(fā)酵的影響

二氧化硫在果酒發(fā)酵過程中起到殺菌、保鮮、提高其口感質(zhì)量的作用。二氧化硫添加量對多依果酒發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 二氧化硫添加量對多依果酒發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of SO2 addition on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖2可知，二氧化硫添加量在4%～8%的范圍內(nèi)，對多依果酒的酒精度影響較小，酒精度、感官評分及可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當二氧化硫添加量為5%時，酒精度達到最大（8.32%vol），此時果酒感官評分也最高（97分）；當二氧化硫添加量＞5%之后，二氧化硫含量過高，酵母菌的活性受到抑制，可溶性固形物含量增加，感官評分降低。因此，確定最佳二氧化硫添加量為5%。

2.1.3 酵母菌接種量對多依果酒發(fā)酵的影響

酵母菌接種量對多依果酒發(fā)酵的影響見圖3。由圖3可知，酵母菌接種量在1%～5%范圍內(nèi)，隨著酵母菌接種量的逐漸增加，多依果酒的酒精度呈現(xiàn)先增高后平緩的趨勢，感官評分呈現(xiàn)下降趨勢，可溶性固形物含量呈現(xiàn)先快速下降后平緩的趨勢。當酵母菌的接種量＜3%之前，其接種量與果酒的酒精度呈正相關(guān)。當酵母菌接種量為3%時，酒精度最高達到9.48%vol。但當酵母菌接種量＞3%之后，其本身需要消耗果肉的營養(yǎng)物質(zhì)，導致酒精轉(zhuǎn)化率下降[21]。而且酵母菌的接種量在一定程度上影響了果酒的果香味，使得感官評分一直下降。因此，綜合評價酵母菌的最佳接種量為3%。

圖3 酵母菌接種量對多依果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on Docynia delavayi fruit wine fermentation

2.1.4 發(fā)酵時間對多依果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間對多依果酒發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對多依果酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation time on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間（5～9 d）的延長，酒精度和可溶性固形物含量整體趨于平緩，感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當發(fā)酵時間為6 d時，酒精度達到最大（8.48%vol），此時酒液感官評分也最高（98分）。發(fā)酵時間過長，果香味變淡，感官評分逐漸下降。因此，確定最佳發(fā)酵時間為6 d。

2.2 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d，選用酒精度（Y）為響應值，以白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）、酵母菌接種量（C）為考察因素，進行3因素3水平的響應面試驗，試驗設計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

利用Design Expert 10軟件對表3的結(jié)果進行多元回歸擬合分析，得到二次多元回歸方程：

Y=9.260-0.220A+0.100B+0.365C+0.180AB-0.010AC-0.110BC-0.635A2+0.045B2+0.015C2

由表4可知，該模型的P值＜0.000 1，極顯著，說明所得方程有意義；失擬項P值＞0.05，不顯著，說明所構(gòu)建的模型很好，與試驗的差異較?。幌嚓P(guān)系數(shù)R2為0.950 4，調(diào)整系數(shù)R2adj為0.956 2，差值＜0.2，說明預測值與試驗值有較好的相關(guān)性，試驗誤差較小；模型的信噪比為21.788，遠大于4，則表明該模型適合用于多依果酒釀造工藝和酒精度的預測。在該模型中，一次項A、C、交叉項AB和二次項A2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項B對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值大小可知，各因素對多依果酒酒精度影響的主次順序為：酵母菌接種量（C）＞白砂糖添加量（A）＞二氧化硫添加量（B）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面分析

對多依果酒的酒精度產(chǎn)生影響的各因素兩兩交互作用的響應面及等高線見圖5。由圖5a可知，響應曲面傾斜度很高，等高線呈橢圓形，說明白砂糖添加量和二氧化硫添加量的交互作用對多依果酒的酒精度有極其顯著性影響。由圖5b可知，響應曲面有傾斜度，等高線趨于圓形，說明白砂糖添加量和酵母菌添加量的交互作用對酒精度的影響較小。由圖5c可知，響應曲面傾斜度不高，等高線接近橢圓形，說明二氧化硫添加量和酵母菌添加量的交互作用對酒精度有影響，但沒有達到顯著性水平（P＞0.05）。

結(jié)合以上結(jié)果分析，根據(jù)回歸方程對試驗結(jié)果進行優(yōu)化，得到多依果酒的最優(yōu)釀造條件為：白砂糖添加量23.69%，二氧化硫添加量4.51%，酵母菌接種量3.97%，在此工藝條件下，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d，多依果酒的酒精度理論值為9.74%vol。根據(jù)實際情況，將工藝參數(shù)修正為：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，按修正后的工藝參數(shù)值進行模型的驗證試驗，得到多依果果酒的實際酒精度為9.82%vol，與理論值接近，說明采用響應面法優(yōu)化多依果酒釀造工藝條件是準確可行的，該模型有一定的應用價值。

圖5 各因素交互作用對多依果酒酒精度影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content in Docynia delavayi fruit wine

2.3 多依果酒的質(zhì)量指標測定結(jié)果

對按最優(yōu)工藝參數(shù)制備的多依果酒進行感官評價和部分質(zhì)量指標測定。感官評定結(jié)果表明，多依果酒體具有多依果特征香氣，與酒香混為一體，色澤為黃橙色，口感醇和，感官評分為98分。質(zhì)量指標結(jié)果表明，酒精度9.82%vol，可溶性固形物含量13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數(shù)18CFU/mL，大腸菌群＜3MPN/100mL。果酒各指標項目檢測結(jié)果均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》的標準要求。

3 結(jié)論

以云南省普洱市特產(chǎn)的多依果為原料，酒精度、感官評分、可溶性固形物含量為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應面法設計和優(yōu)化試驗，確定多依果酒的最佳釀造工藝：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d。在此最優(yōu)釀造工藝條件下，多依果酒顏色呈黃橙色，果香與酒香協(xié)調(diào)，滋味醇厚，感官評分為98分。酒精度為9.82%vol，可溶性固形物含量為13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數(shù)18 CFU/mL，大腸菌群＜3 MPN/100 mL，各項指標均符合相關(guān)果酒行業(yè)標準。