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    氧化石墨烯紫外吸收適配體傳感器對鏈霉素殘留的高靈敏檢測

    2019-10-08 03:49:10劉振平夏明星
    食品科學(xué) 2019年18期
    關(guān)鍵詞:光度蜂蜜特異性

    劉振平,姜 容,夏明星

    (1.重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院,重慶 404020;2.重慶海關(guān)技術(shù)中心,重慶 404020)

    鏈霉素(streptomycin,STR)是從鏈霉菌中純化而來的氨基糖苷類化合物,被廣泛用于治療人和動物由于革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染[1-3]。食品中少量的STR殘留會對人產(chǎn)生過敏反應(yīng)、腎毒性和耳毒性[4-6],因此,在環(huán)境分析和食品安全控制領(lǐng)域需要開發(fā)高靈敏的STR殘留檢測方法。

    研究人員開發(fā)了多種用于STR檢測的技術(shù)和方法,如高效液相色譜法[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、放射免疫分析法、熒光免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法[11-12]等,然而這些方法需要繁瑣的程序和復(fù)雜的預(yù)處理過程,因此不適合STR的快速和實時檢測。高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測勞動強(qiáng)度大,且設(shè)備昂貴,在生物樣品分析中,免疫分析方法如放射免疫分析法、熒光免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法可能與共存物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)從而產(chǎn)生干擾[13]。目前,利用核酸適配體特異性識別STR分子引起了廣泛關(guān)注[14-16],核酸適配體又稱核酸適配子,是一段能以高親和力與靶分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA分子[17-18],由人工合成并通過體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出來。與其他傳感材料相比,適配體具有成本低、合成和改性簡單、熱穩(wěn)定性好、毒性和免疫原性低、靈敏度高、反應(yīng)快等優(yōu)點,因此,適配體在生物傳感器的研究與開發(fā)中具有較大潛力[19-20]。

    氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯的衍生物,具有大量的表面氧基,如環(huán)氧、羥基和羧基,具有良好的親水性和生物相容性[21-25],同時,GO因具有大環(huán)芳香共軛體系而具有很強(qiáng)的光吸收能力且符合朗伯比爾定律,可用于定量分析[26]。適配體可通過非特異作用結(jié)合在GO表面[27],增大GO在水中的溶解度。當(dāng)目標(biāo)物進(jìn)入體系后,基于目標(biāo)物與適配體之間的高親和力,適配體會脫離GO,導(dǎo)致GO在水中的溶解度降低,吸光度也隨之降低,從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的間接定量分析。本研究以體系GO的紫外吸收為信號,基于STR適配體與GO、STR和之間的相互作用建立了STR殘留檢測的適配體傳感器。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    STR陰性蜂蜜 重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司;洋槐花蜂蜜 市購;氧化石墨烯 南京先豐納米材料科技有限公司;STR適配體(5’-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CGG GGT CTG GTG TTC TGC TTT GTT CTG TCG GGT CGT CTG CAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3’) 生工生物工程(上海)股份有限公司;STR對照品 重慶葆光生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為分析純;實驗操作過程中所用溶液均為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)配制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TG16-W型臺式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;KQ-700DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Nova400場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司;Vetex70傅里葉紅外光譜儀德國Bruker公司;Zeta Sizer Nano ZS90粒徑和Zeta電位分析儀 英國Malvern公司。

    1.3 方法

    1.3.1 實驗原理

    基于氧化石墨烯紫外吸收信號的核酸適配體傳感器檢測STR原理如圖1所示。在GO飽和水溶液中,當(dāng)無STR存在時,STR適配體堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與GO六元環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水鍵和π-π鍵作用[28],該作用對GO在水中的分散具有保護(hù)作用;當(dāng)STR進(jìn)入體系后,適配體與STR的特異性親和力大于其與GO的非特異作用力,適配體與STR結(jié)合后脫離GO,導(dǎo)致GO分散性降低而聚集,離心后上清液紫外吸光度降低,進(jìn)而建立STR質(zhì)量濃度與GO吸光度之間的線性關(guān)系,實現(xiàn)對STR的高靈敏、特異性檢測。

    圖1 基于氧化石墨烯紫外吸收信號的核酸適配體傳感器檢測STR原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of streptomycin detection using aptasensor based on UV signal of GO

    1.3.2 實驗條件優(yōu)化

    1.3.2.1 GO質(zhì)量濃度的選擇

    根據(jù)文獻(xiàn)[29]報道,GO在水中的最大溶解度為0.712 mg/mL,為確保體系中GO處于過飽和狀態(tài),本研究選擇1 mg/mL作為體系中GO的最終質(zhì)量濃度。

    1.3.2.2 適配體濃度優(yōu)化

    將300 μL不同濃度的STR適配體(50、100、200、500、800、1 000、1 200 nmol/L)與1.5 mL 2 mg/mL GO在室溫孵育10 min。然后,用PBS將上述溶液稀釋至3 mL,STR適配體的終濃度分別為5、10、20、50、80、100 nmol/L和120 nmol/L。室溫孵育10 min后,10 000 r/min離心5 min,取上清液,稀釋一定倍數(shù)后230 nm波長處測量吸光度。

    1.3.3 STR的檢測

    在定量檢測STR時,在優(yōu)化的條件下,將一定濃度STR適配體300 μL與1.5 mL 2 mg/mL GO在室溫下混合15 min。然后,加入不同質(zhì)量濃度的STR標(biāo)準(zhǔn)溶液300 μL并稀釋至3 mL,在37 ℃孵育90 min[30],使適配體與STR充分結(jié)合。上述溶液中的STR終質(zhì)量濃度分別為0.002 4、0.024、0.24、2.4、24 ng/mL和240 ng/mL?;旌弦涸?0 000 r/min離心5 min后,將上清液稀釋后在230 nm波長處記錄了紫外-可見吸收光譜。

    1.3.4 特異性實驗

    按照1.3.3節(jié)方法分別測定終質(zhì)量濃度為0.24 ng/mL的STR、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、克林霉素、呋喃西林和呋喃唑酮溶液,重復(fù)3 次,結(jié)果與空白對比。

    1.3.5 實際樣品處理

    以蜂蜜為檢測對象測試基于氧化石墨烯紫外吸收信號的核酸適配體傳感器對實際樣品檢測的實用性。具體步驟如下:分別取1 g蜂蜜,分別加水稀釋至100 mL,加入STR標(biāo)準(zhǔn)樣品,將混合樣品混勻搖晃20 min后,在3 000 r/min離心20 min,取上清液備用。制成不同質(zhì)量濃度的STR的蜂蜜實際樣品,檢測的具體步驟與標(biāo)準(zhǔn)樣品相同,且STR的最終質(zhì)量濃度分別為0.005、0.05、0.5、5 ng/mL和50 ng/mL。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    利用 Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理,采用OriginPro 8.5作圖和線性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GO的表征

    圖2 GO掃描電鏡圖像Fig. 2 SEM image of GO

    通過掃描電鏡、紫外-可見吸收光譜和傅里葉紅外光譜對GO進(jìn)行表征。如圖2所示,GO的掃描電鏡圖像為褶皺的片狀結(jié)構(gòu),有明顯分層,說明GO表面含有環(huán)氧基和羥基等增大了層間距。GO在230 nm波長處有明顯的紫外吸收峰(圖3)。如圖4所示,3 000~3 700 cm-1為O—H價鍵伸縮振動峰,1 569 cm-1處為C=C伸縮振動峰,1 401 cm-1處為—O—H變形振動峰,1 148 cm-1處為C—OH價鍵伸縮振動峰,1 003 cm-1處為C—O伸縮振動峰,表明GO表面含有較多的含氧基團(tuán)。

    圖3 GO紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectrum of GO

    圖4 GO傅里葉紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectroscopy spectrum of GO

    2.2 水動力直徑和Zeta電位分析

    利用動態(tài)光散射法監(jiān)測GO與STR適配體相互作用前后的水動力直徑和電荷變化[31]。如表1所示,在GO飽和溶液中加入終濃度80 nmol/L STR適配體15 min后,平均水動力直徑由414.8 nm增大到455.3 nm,表明GO與適配體發(fā)生了相互作用[32];加入STR并在37 ℃孵育90 min后,平均水動力直徑明顯降低,表明適配體與STR結(jié)合后從GO表面分離;在Zeta電位變化情況也可以看出帶負(fù)電荷的適配體與GO結(jié)合后電位明顯降低,當(dāng)加入STR后電位升高,進(jìn)一步證明了本研究的實驗原理。

    表1 GO適配體傳感器的水動力直徑及Zeta電位Table 1 Hydration diameter and zeta potential of the GO-based aptasensor

    2.3 實驗條件優(yōu)化結(jié)果

    本研究選擇1 mg/mL作為體系中GO的最終質(zhì)量濃度,經(jīng)過測試,此質(zhì)量濃度的GO水溶液處于過飽和狀態(tài)。適配體可以促進(jìn)GO在水中的分散性,且不會因離心而聚集[33]。如圖5所示,隨著STR適配體濃度的增加,GO吸光度不斷增大,當(dāng)STR適配體濃度達(dá)到80 nmol/L時,GO吸光度增強(qiáng)變緩,表明80 nmol/L的STR適配體可以有效防止GO在水中聚集。因此,本研究選定80 nmol/L作為STR適配體實驗濃度。在測定樣品吸光度時,為確保測量值在量程范圍內(nèi),經(jīng)過反復(fù)實驗,將樣品離心后的上清液稀釋10 倍后,測定的吸光度在準(zhǔn)確的量程范圍內(nèi),確保結(jié)果準(zhǔn)確。

    圖5 STR適配體濃度對GO吸光度的影響Fig. 5 Effect of STR aptamer concentration on absorbance of GO

    2.4 STR的定量檢測結(jié)果

    在優(yōu)化的試驗條件下,本研究建立適配體傳感器對STR質(zhì)量濃度梯度為0.002 4、0.024、0.24、2.4、24 ng/mL和240 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定。如圖6所示,在230 nm波長處,GO溶液的吸光度隨著STR質(zhì)量濃度增大而降低。以STR質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),GO吸光度為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果顯示,兩者在STR質(zhì)量濃度為0.002 4~240 ng/mL范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:A=-0.105 73lgCSTR+0.471 5,R2=0.994,檢出限為0.001 3 ng/mL。該適配體傳感器,有較低的檢測限和較寬的檢測范圍(表2)。此外,將制備好的適配體傳感器置于4 ℃條件下避光保存,在最優(yōu)實驗條件下,每隔1 d對質(zhì)量濃度為2.4 ng/mL的STR進(jìn)行檢測,用以檢驗該適配體傳感器的穩(wěn)定性。在2.4 ng/mL STR條件下,紫外吸收測定結(jié)果的日內(nèi)精密度為1.89%,日間精密度為2.64%。上述結(jié)果表明,放置一段時間的適配體傳感器檢測效果與最初制備的適配體傳感器檢測效果差異不大,具有良好的穩(wěn)定性(7 d)。

    圖6 GO吸光度隨STR質(zhì)量濃度變化的紫外光譜Fig. 6 UV spectra of GO with varying STR concentrations

    表2 本實驗適配體傳感器與其他方法比較Table 2 Comparison of the GO-based aptasensor with other detection methods

    2.5 特異性實驗結(jié)果

    為驗證該適配體傳感器的特異性,排除實際樣品檢測中可能遇到的其他族類或結(jié)構(gòu)類似抗生素的干擾,分別加入0.24 ng/mL的STR、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、克林霉素、呋喃西林和呋喃唑酮反應(yīng)進(jìn)行吸光度測定。如圖7所示,與空白對照,當(dāng)檢測體系中存在0.24 ng/mL STR時,吸光度明顯降低,但是當(dāng)檢測體系中的STR由其他抗生素替代時,吸光度無明顯變化。由此表明,本實驗構(gòu)建的適配體傳感器對STR具有較高的特異性。

    圖7 適配體傳感器特異性分析Fig. 7 Specificity analysis of the aptasensor

    2.6 蜂蜜樣品檢測結(jié)果

    分別取適量兩種不同來源蜂蜜樣品,按照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理后,進(jìn)行加標(biāo)回收實驗,加標(biāo)回收率分別為89.3%~108.1%和94.7%~110.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于4.87%(n=3)。結(jié)果表明,該適配體傳感檢測方法準(zhǔn)確可靠,可用于實際蜂蜜樣品中STR含量的測定(表3)。

    表3 蜂蜜樣品中STR的檢測結(jié)果Table 3 Detection of STR in honey samples using the aptasensor

    3 結(jié) 論

    本研究以紫外吸收為信號,以STR適配體促進(jìn)GO在水中的分散性且與STR特異性結(jié)合為基礎(chǔ),構(gòu)建了STR基于GO紫外吸收信號的核酸適配體傳感器。通過簡單地將GO、適配體和靶分子混合在一起,就可以得到檢測結(jié)果,而且具有較高靈敏性。在優(yōu)化的實驗條件下,GO紫外吸光度信號隨著STR質(zhì)量濃度的增大而降低,且與STR質(zhì)量濃度在0.002 4~240 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢出限為0.001 3 ng/mL;同時,對不同來源的蜂蜜實際樣品做加標(biāo)回收率實驗,回收率分別為89.3%~108.1%和94.7%~110.0%。由此表明,本適配體傳感器可用于實際樣品中STR的高效、高靈敏檢測。本研究建立的適配體傳感器所需設(shè)備簡單、成本低、效率高,為動物源性食品和環(huán)境分析中STR殘留的快速和現(xiàn)場高靈敏檢測提供了新的方案。

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