CRISPR/Cas9方法失活白念珠菌CaMIT1基因及其突變株表型分析

徐慧慧 蔣伶活，2

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，淄博 255000)

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種人體共生菌，對(duì)免疫功能缺陷的患者能夠引起系統(tǒng)感染，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者死亡[1-2]。白念珠菌感染宿主細(xì)胞時(shí)，會(huì)遭遇到宿主細(xì)胞的防御壓力(例如，發(fā)熱、氧化應(yīng)激，以及亞硝化作用)，環(huán)境壓力(例如，腸道中的低氧和唾液與上皮層中的抗真菌多肽)。這些壓力直接作用于白念珠菌的細(xì)胞表面。真菌表面的細(xì)胞壁是一種動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境壓力的破壞十分重要。和其他酵母細(xì)胞一樣，白念珠菌的細(xì)胞壁由糖骨架組成，主要成分是β-葡聚糖，幾丁質(zhì)和甘露聚糖。β-1，3 和 β-1，6葡聚糖組成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，被磷酸肽鍵甘露聚糖(phosphopeptidomannan， PPM)、甘露聚糖蛋白(mannoproteins)和磷脂甘露聚糖(phospholipomannan， PLM)組成的復(fù)合糖外層包圍[3-4]。磷酸肽鍵甘露聚糖、甘露聚糖蛋白和磷脂甘露聚糖統(tǒng)稱為甘露聚糖綴復(fù)合物，這些寡聚甘露糖綴復(fù)合物在白念珠菌與宿主的關(guān)系中發(fā)揮重要作用，與白念珠菌毒力緊密相關(guān)[5-8]。寡聚甘露糖通過(guò)β-1，2 鍵連接，形成一種獨(dú)特的空間構(gòu)象，能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別。甘露聚糖通過(guò)由β-1，2連接的甘露糖殘基與磷脂連接形成PLM。白念珠菌釋放的PLM中的β-寡聚甘露糖可以與宿主細(xì)胞作用，通過(guò)宿主細(xì)胞上的Toll-like receptor-2誘導(dǎo)TNF-α合成[9-11]。盡管目前對(duì)β-甘露聚糖在白念珠菌病理生理學(xué)中的功能有諸多認(rèn)識(shí)，但是對(duì)β-甘露聚糖基化的調(diào)控尚不清楚白念珠菌的β-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(mannosyltransferase)參與β-甘露聚糖鏈的合成[12]。CaMIT1編碼GDP-甘露糖﹕肌醇-磷酸-酰胺(inositol-phospho-ceramide， IPC)甘露糖轉(zhuǎn)移酶[13]。CaMIT1突變株缺少PLM，IPCs不能夠被甘露糖基化形成Mannose IPC (MIPC )，從而影響白念珠菌毒力。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對(duì)鈣離子敏感。為了進(jìn)一步研究Mit1p在鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，我們利用一種新的基因編輯手段CRISPR去構(gòu)建CaMIT1基因的突變株。

CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)體系，已被運(yùn)用到真菌、植物和動(dòng)物的研究領(lǐng)域中[14-15]。Fink教授實(shí)驗(yàn)室基于這項(xiàng)技術(shù)的原理，構(gòu)建了在白念珠菌中可以操作的CRISPR體系，證明這種方法可以有效地編輯白念珠菌基因組[16]。白念珠菌CRISPR體系，由白念珠菌兼容性的Cas9核酸酶和一個(gè)合成的導(dǎo)向RNA(synthetic guide RNA)組成，sgRNA能夠與基因組上特異性的20個(gè)堿基的序列進(jìn)行雜交，sgRNA識(shí)別的序列緊跟著一個(gè)由NGG組成的PAM(Protospacer-Adjacent Motif)位點(diǎn)，Cas9蛋白能夠識(shí)別PAM位點(diǎn)并在此位點(diǎn)進(jìn)行剪切，因此sgRNA具有指導(dǎo)Cas9蛋白到基因組特定PAM位點(diǎn)的功能。CRISPR體系可以通過(guò)一步轉(zhuǎn)化法獲得兩個(gè)等位基因同時(shí)失活的純合子突變株，為基因功能和毒力研究提供了一種簡(jiǎn)單而快速的手段。以CaMIT1基因?yàn)槔覀兂晒νㄟ^(guò)這種方法獲得了兩個(gè)等位基因同時(shí)失活的CaMIT1純合子突變株，并通過(guò)倍比稀釋對(duì)Mit1p的功能進(jìn)行了初步分析。

1 材料

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用到菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物，固體培養(yǎng)基滅菌前加入20g/L瓊脂粉；YPD培養(yǎng)基含藥物：YPD培養(yǎng)基濕熱滅菌后，加入相應(yīng)濃度的藥物；LB+氨芐霉素培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化鈉，5g/L酵母提取物，調(diào)整pH到7.0，滅菌后加入100 μg/mL 氨芐霉素，固體培養(yǎng)基滅菌前加入20g/L瓊脂粉。

1.3 主要試劑

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

酵母轉(zhuǎn)化用Salmon Sperm DNA (ssDNA)、LiAc、PEG 3350， 以及細(xì)胞裂解酶lyticase等試劑購(gòu)自Sigma公司；所用藥物諾爾斯菌素(nourseothricin， NAT)、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等試劑購(gòu)NEB公司。熒光增白劑(CFW)、酮康唑(KCZ)、氟康唑(Flu)和特比萘芬(Teb)等購(gòu)自Sigma公司；氯化鈣，氯化理和SDS購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.4 主要儀器及設(shè)備

PCR反應(yīng)儀(德國(guó)艾本德公司)、全溫?fù)u瓶柜(太倉(cāng)強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、核酸電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio. Rad)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

需要設(shè)計(jì)三對(duì)引物。(1)sgRNA引物設(shè)計(jì)。sgRNA是由20bp堿基組成的序列。Vyasetal. 2015的補(bǔ)充數(shù)據(jù)中包含有不同的sgRNA序列，選擇文件(Targ.NoTs.subs12nt.HitsGenesOnly.

Hits1Gene2 Alle.3letterName)，也可以利用軟件Benchling進(jìn)行查找。sgRNA有以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：a) sgRNA應(yīng)在目的基因ORF內(nèi)，且靠近起始密碼子ATG，盡早終止有功能蛋白質(zhì)的合成；b) On-Target和Off-Target分?jǐn)?shù)越高越好，分?jǐn)?shù)高表明sgRNA結(jié)合的特異性強(qiáng)。sgRNA需要連接到質(zhì)粒pV1093上，質(zhì)粒pV1093用BsmBI進(jìn)行酶切后暴露出黏性末端，需在引物兩端添加黏性末端，正向引物為5’-atttgX20g-3’(表2，MIT1-sgF)，反向引物為5’-aaaacX20c-3’ (表2，MIT1-sgR)，PAM位點(diǎn)應(yīng)該在sgRNA的3’端(如圖1C)。(2)修復(fù)模板DNA(Repair DNA)引物設(shè)計(jì)。修復(fù)模板DNA含有突變位點(diǎn)和同源臂，根據(jù)需要進(jìn)行修飾。在構(gòu)建突變株時(shí)，通過(guò)堿基修飾導(dǎo)入終止密碼子，有3點(diǎn)需要修飾的地方：a) 至少一個(gè)終止密碼子(UAA， UAG 或UGA)，且該終止密碼子必須在基因ORF中；b) 破壞PAM位點(diǎn)，例如將NGG中的一個(gè)G替換成其他堿基；c)為了篩選正確的轉(zhuǎn)化子，引入一個(gè)或者消除一個(gè)酶切位點(diǎn)。最好選擇常用的，且酶切效率較高的限制性酶切位點(diǎn)(EcoRI，BamHI，HindⅢ，NdeI，XbaI，XhoI)，如圖1E。此外，在正向和反向引物的5’末端分別添加40bp的sgRNA兩側(cè)的同源序列(表2，MIT1-repairF/ MIT1-repairR)；(3)篩選引物設(shè)計(jì)。在sgRNA的兩側(cè)設(shè)計(jì)正向和反向引物，擴(kuò)增出一條1kb左右的條帶。兩條引物與sgRNA的位置在200bp以上(見表2，MIT1-CF/ MIT1-CR)。

2.2 sgRNA克隆

用限制性核酸內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切2 μg載體pV1093，55 ℃酶切20 min后用CIP酶37 ℃處理1 h，用片段純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)用T4 Polynucleotide kinase對(duì)sgRNA的引物進(jìn)行退火添加磷酸基團(tuán)。最后將退火后得到的寡聚核苷酸片段與載體用T4 Ligase進(jìn)行連接。

2.3 白念珠菌的轉(zhuǎn)化

將克隆獲得的質(zhì)粒pV1093-sgRNA用KpnⅠ和SacⅠ進(jìn)行酶切，并純化回收；同時(shí)以修復(fù)模板DNA引物做PCR獲得修飾模板，并純化回收。將回收后的質(zhì)粒和模板DNA用LiAc轉(zhuǎn)化方法同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入白念珠菌細(xì)胞。具體操作步驟為：將白念珠菌細(xì)胞在YPD液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到5 mL新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600為0.1，培養(yǎng)5 h后3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。用0.1 mol/L的LiAc洗滌細(xì)胞1次，再次用3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，最后用100 μL 的0.1 mol/L LiAc將細(xì)胞重懸，并加入10 μL提前煮沸過(guò)的10 mg/mL的Salmon Sperm DNA (ssDNA)，2 μg酶切后的質(zhì)粒以及2 μg的修復(fù)模板DNA模板，吹吸混勻后加入600 μL 40 % PEG/0.1 mol/L LiAc緩沖液，充分混勻。42℃熱激30 min，離心棄上清后，用2 mL YPD培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中，200 r/min、室溫(25 ℃)復(fù)蘇過(guò)夜后，取1.5 mL培養(yǎng)物離心水洗，涂布在含有200 μg/mL NAT的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，將獲得轉(zhuǎn)化子在200 μg/mL NAT的YPD平板上劃線，30℃培養(yǎng)1 d后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

2.4 菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子

菌落PCR主要包括兩個(gè)步驟：一是處理細(xì)胞獲得足夠質(zhì)量和數(shù)量的基因組DNA；二是PCR反應(yīng)。

具體操作步驟：1、基因組DNA的制備。在冰上配制裂解體系：1/50體積Lyticase(20 Unit/μL)，5X Taq Buffer，加水補(bǔ)充體積，并分裝到PCR管或者96孔PCR板中，每個(gè)樣品25 μL的體系；用扁頭牙簽挑取轉(zhuǎn)化子，在裂解體系中混合均勻，室溫放置30～60min；加入100 μL水，95℃處理5min，使蛋白失活；3000 r/min離心10 min，上清液即基因組DNA。2、PCR反應(yīng)。根據(jù)所用Taq酶的使用說(shuō)明進(jìn)行PCR的體系的配制和程序設(shè)置。

2.5 表型實(shí)驗(yàn)

挑取菌株單菌落接種到3 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃ 220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)16 h，調(diào)整OD600值為2，倍比稀釋得到細(xì)胞濃度分別為2×107cells/mL、2×106cells/mL、2×105cells/mL、2×104cells/mL和2×103cells/mL。每個(gè)菌株，每個(gè)濃度吸取2.5 μL，點(diǎn)到Y(jié)PD和含有不同藥物的固體培養(yǎng)基上，從右到左濃度遞增，在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d拍照觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 CRISPR/Cas9方法構(gòu)建白念珠菌CaMIT1基因的突變株

按照Fink教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的白念珠菌CRISPR/Cas9體系[16](見圖1)，我們首先構(gòu)建含有CaMIT1的sgRNA的 pV1093質(zhì)粒，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證， 得到正確的pV1093- sgMIT1質(zhì)粒。用KpnⅠ和SacⅠ同時(shí)對(duì)pV1093- sgMIT1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得11 kb 和3 kb左右的兩條片段 (見圖2D) ，其中大片段包含有CaCas9p表達(dá)體系、sgRNA表達(dá)體系，以及NatR基因，并將通過(guò)片段兩端的ENO1基因同源序列整合到基因組的ENO1基因位點(diǎn)。pV1093- sgMIT1質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物與修復(fù)模板DNA(見圖2E)一起轉(zhuǎn)化到白念珠菌的野生型菌株SN148，在含有200 μg/mL 的YPD固體培養(yǎng)基上能獲得100以上的轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因型驗(yàn)證(圖2F、2G)。通過(guò)PCR，以野生型菌株和CaMIT1突變株的基因組DNA為模板，都能擴(kuò)增出1kb左右的DNA條帶(見圖2F)。由于經(jīng)過(guò)CRISPR編輯后的基因組序列中引入了一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，而野生型基因序列中沒有，所以用XhaⅠ酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，從CaMIT1突變株基因組中擴(kuò)增出的1kb PCR產(chǎn)物會(huì)被切成400 bp和660 bp兩個(gè)小片段，而從未經(jīng)過(guò)編輯的野生型菌株基因組中得到的1kb PCR產(chǎn)物則不會(huì)被切成兩個(gè)小片段(見圖2G)。在15個(gè)轉(zhuǎn)化子中，1、2、3、4、5、7、8、9、12、13可能是成功編輯過(guò)的突變菌株，此酶切效率達(dá)到60%以上。由于白念珠菌是雙倍體，不能被XbaⅠ酶切完全的PCR產(chǎn)物有可能是來(lái)自雜合子的基因組DNA，所以我們挑選被XbaⅠ酶切完全的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。包括我們獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)化子mit1-1(HHCA1)、mit1-2(HHCA1)、mit1-3(HHCA1)就是從9個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖2中的1-5，8，9，12，13號(hào))中經(jīng)過(guò)對(duì)它們的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得的。測(cè)序結(jié)果表明這3個(gè)轉(zhuǎn)化子中CaMIT1基因都產(chǎn)生了預(yù)期的突變。

圖1白念珠菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)。(A) 由質(zhì)粒pV1093組成的單一體系，整合到基因組上ENO1基因位置。(B) pV1093質(zhì)粒圖譜。CaCas9p蛋白的3’末端融合有3X SV40核定位信號(hào)和3X FLAG標(biāo)簽。CaCas9p的啟動(dòng)子是組成型表達(dá)的ENO1啟動(dòng)子，同時(shí)是CaCas9p整合到基因組上的整合位點(diǎn)。利用RNA聚合酶ⅢⅢ的啟動(dòng)子SNR52p來(lái)表達(dá)sgRNAs。(C) 用BsmBⅠ酶切質(zhì)粒pV1093，同時(shí)將設(shè)計(jì)的導(dǎo)向序列(紅色框架內(nèi)是CaMIT1導(dǎo)向序列)退火，并將退火后的寡聚核苷酸(陰影部分序列) 連接到質(zhì)粒上構(gòu)建導(dǎo)向表達(dá)系統(tǒng)。(D) Cas9突變方法的原理圖。這種系統(tǒng)能夠在基因的特定(*，PAM位點(diǎn))位點(diǎn)產(chǎn)生純合子突變，同時(shí)使序列突變來(lái)阻止在整合后重復(fù)剪切。(E) 野生型和突變株在CaMIT1突變位點(diǎn)的序列。兩個(gè)連續(xù)的終止密碼子在CaMIT1的閱讀框架(ORF)上。在PAM位點(diǎn)引入了XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)。

Fig.1Candida albicans CRISPR/Cas9 system. (A) The solo system consists of one plasmid， pV1093， which targets ENO1. (B) Restriction map of plasmid pV1093. The CaCAS9 gene is fused to sequences encoding the 3X SV40 nuclear localization signal and 3x FLAG tag for in-frame fusion to the 3’ end of the gene. The CaCas9p from this construct is expressed from the constitutive ENO1 promoter at the plasmid integration site. The RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter SNR52p was used to control of sgRNA expression. (C) Cloning strategy of guide sequence. oligos (shaded sequences) with desired guide sequence (CaMIT1 guide sequence in red box) are annealed， digested with BsmBI and ligated with BsmBⅠ-digested pV1093 vector. (D) Illustration of gene editing process. The CRISPR/Cas9 system creates homozygous mutations in the target gene (*， PAM site). (E) Comparison between DNA sequences ofCaMIT1 loci in the wild-type and the mutant. Two consecutive stop codons are shown within the mutated region. XbaⅠ restriction enzyme site is introduced at the PAM region.

3.2 CaMIT1突變株表型分析

在SN148遺傳背景下，CaMIT1突變株對(duì)0.4 mol/L和0.6 mol/L CaCl2表現(xiàn)為極為敏感(如圖3A)。環(huán)孢霉素A是鈣離子/鈣調(diào)磷酸酯酶信號(hào)途徑中，鈣調(diào)磷酸酯酶的抑制劑，能夠抑制鈣信號(hào)途徑的激活[18-19]。培養(yǎng)基中加入50 μg/mL環(huán)孢霉素A(Cyclosporine A，CsA)不能夠抑制CaMIT1突變株對(duì)鈣離子的敏感表型，說(shuō)明鈣離子的敏感表型不是由于鈣離子信號(hào)途徑的激活而導(dǎo)致的。與Mille等人的報(bào)道一致，CaMIT1突變株對(duì)十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate， SDS)，對(duì)熒光增白劑(Calcofluor White， CFW)不敏感[13]；但是，CaMIT1突變株對(duì)剛果紅(Congo Red， CR)表現(xiàn)出抗性(見圖3B)。此外，我們發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對(duì)LiCl、克霉唑(Clotrimazole， Clo)、酮康唑(Ketoconazole， KCZ)以及苯胺抗真菌藥物(Anidualafungin， Anidua)表現(xiàn)為敏感表型(見圖3A、B)。LiCl溶液通常呈微堿性，但是CaMIT1突變株對(duì)堿性環(huán)境并不敏感(見圖3B)。最后，我們還發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對(duì)DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea， HU)敏感，但對(duì)DNA損傷劑甲磺酸甲酯(Methyl Methanesulfonate， MMS)不敏感(見圖3B)。

圖2白念珠菌的CRISPR是一種有效的突變系統(tǒng)。(A)質(zhì)粒提取試劑盒提取pV1093質(zhì)粒；(B) BsmBI酶切線性化質(zhì)粒pV1093；(C) sgRCH1-F/R引物退火，并用T4 Polynucleotide kinase 在末端添加磷酸基團(tuán)后得到RCH1的sgRNA寡聚核苷酸序列；(D)KpnⅠ和SacⅠ雙酶切線性化pV1093-sgRCH1質(zhì)粒；(E) PCR擴(kuò)增獲得修復(fù)模板DNA；(F) 轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子后，菌落PCR擴(kuò)增目的片段，包含被突變位點(diǎn)。(G) 修復(fù)模板DNA中引入酶切位點(diǎn)XbaI，用限制性內(nèi)切酶XbaI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，篩選正確的轉(zhuǎn)化子

Fig.2C.albicansCRISPR is an efficient mutagenesis system. (A) Plasmid pV1093 was extracted by using plasmid extraction kit. (B) Plasmid pV1093 was linearized by digestion with BsmBI. (C) Primer of sgRCH1-F/R were annealed to obtain sgRNA oligos ofRCH1， and phosphorylated by T4 Polynucleotide kinase. (D) Plasmid pV1093-sgRCH1 was linearized by digestion withKpnIand SacI. (E) Repair DNA was obtained through PCR. (F) Colony PCR was used to amplify the flanking region including mutant site after transformation. (G) To verify correct transformants， the PCR products were subjected to digestion with the restriction enzymeXbaIwhose site was introduced during the mutagenesis

圖3 CaMIT1突變株表型.

4 討論

白念珠菌是雙倍體，傳統(tǒng)的URA-Blaster方法需要分2步才能敲除一個(gè)基因的兩個(gè)等位基因，因此基因敲除過(guò)程耗時(shí)繁瑣。而且，白念珠菌沒有已知的有絲分裂過(guò)程，自然界不存在單倍體的形態(tài)。因此，缺少簡(jiǎn)單而快速的基因失活手段是研究白念珠菌基因功能和致病性的主要障礙。本研究通過(guò)利用Fink教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的應(yīng)用于白念珠菌的CRISPR方法成功獲得了白念珠菌mit1/mit1純合子突變菌株。通過(guò)表型實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了mit1/mit1突變菌株的表型與Mille等人用傳統(tǒng)URA-Blaste方法構(gòu)建的突變株的表型一致[13]。我們的工作進(jìn)一步證明了這一技術(shù)的可行性。CRISPR這種高效簡(jiǎn)便的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，無(wú)疑會(huì)加速白念珠菌基因功能的研究進(jìn)程。Fink教授實(shí)驗(yàn)室還構(gòu)建了質(zhì)粒pV1200，質(zhì)粒pV1200中的NatR標(biāo)記含有翻轉(zhuǎn)酶Flippase (NATR-FLP) ，其NATR-FLP-SNR52p-sgRNA兩端含有同源序列FRT，翻轉(zhuǎn)酶可以通過(guò)同源重組的原理將NATR-FLP-SNR52p-sgRNA從基因組中刪除，因此NATR篩選標(biāo)記又可被用于下個(gè)基因的敲除[16]。

此外，Mitchell教授實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)報(bào)道了一種短暫的CRISPR基因組編輯方法[20]。這種短暫的CRISPR編輯體系，以pV1093為模板通過(guò)PCR獲得CaCas9p表達(dá)體系，通過(guò)single-joint PCR獲得sgRNA表達(dá)體系。以pNAT為模板，用含有同源臂的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增NAT敲除盒，或者用氨基酸合成基因做篩選遺傳標(biāo)記。SN148氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株含有四種氨基酸合成基因缺失，包括URA3、HIS1、LEU2和ARG4。 Mitchell教授的短暫CRISPR基因組編輯方法證明sgRNA不需要整合到基因組上發(fā)揮作用。因此可以將CaCAS9整合到基因組上，利用PCR擴(kuò)增獲得sgRNA的表達(dá)體系和氨基酸篩選標(biāo)記，通過(guò)更換sgRNA和氨基酸篩選標(biāo)記獲得純合子突變菌株，以及多基因突變株。

釀酒酵母ScSUR1基因是白念珠菌CaMIT1的同源基因，和釀酒酵母ScSUR1突變株細(xì)胞一樣，白念珠菌CaMIT1突變株對(duì)鈣離子敏感[21]。我們的結(jié)果表明CaMIT1突變株對(duì)鈣離子的敏感性不能夠被CsA所抑制，說(shuō)明其敏感表型與鈣離子信號(hào)途徑的激活無(wú)關(guān)，我們推測(cè)是由于CaMIT1缺失導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞質(zhì)膜或者細(xì)胞壁存在缺陷造成的，這和CaMIT1突變株對(duì)SDS敏感這一表型結(jié)果一致[13]，見圖3。CFW和CR是誘發(fā)細(xì)胞壁脅迫的藥物[22]，它們都能夠與多種多聚糖物質(zhì)結(jié)合，尤其對(duì)幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖具有高親和性，這兩種染料都能夠誘導(dǎo)不正常的隔膜，從而導(dǎo)致酵母的母細(xì)胞和子細(xì)胞在細(xì)胞分裂過(guò)程中不能夠完全斷裂。我們發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對(duì)CFW不敏感，而對(duì)CR表現(xiàn)出耐受性(見圖3)。CaMIT1突變株對(duì)這兩種藥物的不同表型表明這兩種染料與幾丁質(zhì)和β(1，3)-葡聚糖的結(jié)合底物可能不同。CaMIT1缺失可能導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞壁對(duì)CR的結(jié)合度下降，而沒有影響對(duì)CFW的結(jié)合度。CaMIT1突變株對(duì)破壞細(xì)胞膜通透性的抗真菌藥物Clo，KCZ和Anidualafungin表現(xiàn)出敏感性，這與CaMIT1缺突變株對(duì)SDS敏感性表型是一致的[16]。CaMIT1突變株對(duì)Li+敏感，LiCl溶液為微堿性，但是在pH8.3以及pH10.0條件下CaMIT1突變株的生長(zhǎng)狀況和野生型細(xì)胞一致，說(shuō)明CaMIT1突變株對(duì)Li+調(diào)控存在缺陷。HU和MMS都是細(xì)胞周期藥物，HU是一種DNA合成抑制劑，對(duì)S期以外的細(xì)胞無(wú)影響，但是可以阻止細(xì)胞進(jìn)入S期而停留在G1/S交界(看作G1期細(xì)胞)[23]。MMS是一種烷基化試劑，是DNA損傷試劑，能夠使細(xì)胞停留在S期[24]。CaMIT1突變株對(duì)HU敏感，而對(duì)MMS不敏感，CaMIT1突變株應(yīng)答HU的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，CaMIT1p與白念珠菌的細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁完整性以及鈣離子的穩(wěn)態(tài)相關(guān)。