慢性腎病并發(fā)慢性心血管損傷大鼠模型的建立

姚波，馬曉燕，張魯囡，王禹

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.北京衛(wèi)戍區(qū) 海淀第三退休干部休養(yǎng)所，北京 100853

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）是威脅人類健康的重要疾病，全世界有超過(guò)200萬(wàn)人患有終末期腎臟病[1-2]，需要依賴腎臟替代治療維持生命。大鼠CKD模型可促進(jìn)人們對(duì)CKD發(fā)生機(jī)制的理解，并用于測(cè)試新藥。在大鼠飼料中添加腺嘌呤可誘導(dǎo)形成大鼠CKD模型。飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75% 的腺嘌呤便可導(dǎo)致腎臟損傷，具體表現(xiàn)為腎臟體積增大、結(jié)節(jié)樣外觀、凋亡性病損、70% ～80% 的腎臟組織纖維化、血漿尿素氮和血清肌酐升高、電解質(zhì)代謝紊亂[3]和氧化應(yīng)激。與人類CKD以年計(jì)的進(jìn)展進(jìn)度不同，大鼠CKD模型的這些改變均可在4周內(nèi)出現(xiàn)。

作為一種嘌呤堿基，腺嘌呤是黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)物，是體內(nèi)尿酸的潛在來(lái)源之一[4]。尿酸是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、CKD、高血壓、心肌肥大和炎癥的重要因素[5]，能夠?qū)е滦呐K和腎臟損傷，在某些情況下還能導(dǎo)致終末期腎臟病[6]。本次研究的主要目的是明確腺嘌呤誘導(dǎo)CKD模型的腎臟和心臟結(jié)構(gòu)及功能改變的特征，其次要明確應(yīng)用別嘌呤醇降低尿酸濃度能否減輕大鼠對(duì)腺嘌呤的反應(yīng)。經(jīng)過(guò)劑量實(shí)驗(yàn)、腎臟和心臟結(jié)構(gòu)分析及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為，應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% 的腺嘌呤誘導(dǎo)16周，能夠引發(fā)高尿酸誘導(dǎo)性的慢性腎臟損傷，這可能作為一種用于模擬人類CKD且伴有心血管并發(fā)癥的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程和方法均通過(guò)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物福利委員會(huì)的審核。9～10周齡雄性Wistar大鼠（n=76，體重333±1 g）購(gòu)自維通利華公司，分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，處理16周。第1組（對(duì)照組，n=12）飲食為大鼠粉末食料（維通利華公司）；第2～5組，向粉末食料中添加腺嘌呤（Carbosynth公司），使腺嘌呤質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.075% （n=10）、0.25% （n=12）、0.5% （n=10）或 0.75% （n=8）；第 6組給予0.25% 腺嘌呤16周，同時(shí)給予25 mg/（kg·d）別嘌呤醇（Sigma公司）（n=12）；第7組從第8～16周單獨(dú)給予25 mg/（kg·d）別嘌呤醇（n=12）。

1.2 收縮壓的測(cè)量

每4周測(cè)量1次大鼠的收縮壓，測(cè)量前靜脈注射給予Zoletil（替來(lái)他明15 mg/kg，唑拉西泮15 mg/kg）使動(dòng)物輕度鎮(zhèn)靜。用MLT1010 Piezo-Electric Pulse Tranducer（ADInstrucments公司）及不可充氣的尾鉗（tail-cuff）與 MLT884 Physiologi?cal Pressure Transducer及Power Lab數(shù)據(jù)獲取單元（ADInstruments公司）測(cè)量并獲取數(shù)據(jù)[7]。

1.3 腎功能評(píng)估

16周飼喂結(jié)束后，將大鼠于代謝籠中飼養(yǎng)24 h，收集尿液用于蛋白、肌酐和尿素氮濃度的測(cè)量。收集尿液后，麻醉大鼠并收集血漿標(biāo)本。測(cè)量血漿尿素氮、肌酐、尿酸、鈉、鉀、鈣、乳酸脫氫酶、總膽固醇、總甘油三酯及非酯化脂肪酸。計(jì)算肌酐清除率。

1.4 獲取離體的心臟

獲取血液標(biāo)本后剪下大鼠的心臟，于0℃結(jié)晶灌注液中保存。在殘主動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈口上方向主動(dòng)脈內(nèi)置入套管，進(jìn)行心臟灌注，通過(guò)在左心室內(nèi)置入乳膠球囊導(dǎo)管評(píng)估等容心室功能；導(dǎo)管與Capto SP844MLT844 Physiological Pressure Transducer and Chart軟件相連，用MacLab System和PowerLab數(shù)據(jù)獲取單元（ADInstruments公司）測(cè)量獲得數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖去除心房和右心室，留下左心室和室間隔，用紗布吸干，稱重。心肌舒張的順應(yīng)性通過(guò)舒張順應(yīng)性常數(shù)κ計(jì)算。

1.5 血管反應(yīng)的器官浸浴實(shí)驗(yàn)

胸主動(dòng)脈弓（長(zhǎng)度4 mm）置于器官浸浴小室，靜息張力為10 mN。測(cè)量去甲腎上腺素的累積濃度反應(yīng)（收縮）曲線；在對(duì)去甲腎上腺素次峰值（～70% ）收縮存在的同時(shí)，測(cè)量乙酰膽堿和硝普納的濃度-反應(yīng)（舒張）曲線。

1.6 組織病理學(xué)

獲得活體組織腎臟和心臟（左心室）以后，立即在10% 福爾馬林中固定，每天更換福爾馬林溶液。用酒精梯度對(duì)樣本進(jìn)行脫水，在石蠟中固定。腎臟、左心室和肝臟做薄層切片（4 μm），蘇木素-伊紅（H ＆ amp;E）染色或Masson三色染色。進(jìn)行過(guò)碘酸希夫染色（PAS），以觀察近端腎小管管腔刷狀緣的緩解。用ImagePro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像形態(tài)學(xué)分析。

1.7 免疫印跡

本研究中使用的一抗包括多克隆山羊TNF-α（1∶1000）、多克隆兔抗NF-κB p50（1∶1000）、多克隆兔抗 NF-κB p52（1∶1000）、單克隆兔抗TGF-β1（1∶1000）（SantaCruzBiotechnology 公司），以及多克隆兔抗PLA2（1∶1000）、單克隆小鼠抗HO-1（1∶1000）（Abcam公司）。

將腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿。根據(jù)蛋白濃度確定電泳上樣量，各組上樣量保持一致，以GADPH（1∶5000，Sigma-Aldrich公司）作為對(duì)照，用ImageJ圖像分析軟件分析條帶濃度。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色使用的一抗包括單克隆小鼠抗ED-1（1∶150，Serotec公司）、單克隆小鼠抗α-SMA（1∶400，Sigma公司）。免疫組織化學(xué)染色在4 μm切片上采用常規(guī)操作進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，使用One way方差分析和Tukey檢驗(yàn)，或Two way方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠體重的影響

0.75 % 腺嘌呤組大鼠攝食量保持恒定；0.075% 腺嘌呤組大鼠體重?zé)o明顯改變；16周時(shí)，與衰老相關(guān)的體重增加在0.25% 腺嘌呤組中更明顯；0.5% 腺嘌呤組大鼠體重?zé)o增長(zhǎng)，0.75% 腺嘌呤組大鼠體重下降（圖1）。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠體重的影響

2.2 不同劑量腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠收縮壓和心臟結(jié)構(gòu)的影響

0.25 % 、0.5% 和0.75% 腺嘌呤組大鼠的收縮壓顯著增加，但0.075% 腺嘌呤組增加的程度較輕（圖2A）。0.075% 腺嘌呤組大鼠的左心室結(jié)構(gòu)無(wú)改變，但在高濃度腺嘌呤組中可觀察到明顯的纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B）。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)腺嘌呤飼喂大鼠的血壓和心肌結(jié)構(gòu)變化

2.3 0.25% 腺嘌呤對(duì)大鼠心血管功能的影響

0.25 % 腺嘌呤飼喂組大鼠的收縮壓從第4周開(kāi)始升高，到第8周開(kāi)始穩(wěn)定。左心室剛性常數(shù)（stiffness constant）升高（32.9±1.4 vs.23.1±0.8），伴有心臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)和血管周纖維化。在離體胸主動(dòng)脈環(huán)中，去甲腎上腺素介導(dǎo)的收縮，內(nèi)皮依賴乙酰膽堿介導(dǎo)的和平滑肌依賴硝普鈉介導(dǎo)的舒張受損（圖3）。血清甘油三酯、總膽固醇和非酯化脂肪酸升高（表1）。

圖3 腺嘌呤飼喂和別嘌呤醇治療后，去甲腎上腺素（A）介導(dǎo)的收縮，內(nèi)皮乙酰膽堿（B）、平滑肌硝普鈉（C）介導(dǎo)的舒張功能變化

表1 不同劑量腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠血漿指標(biāo)的影響

2.4 不同劑量腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響

不同劑量的腺嘌呤飼喂大鼠后，血漿參數(shù)和蛋白尿程度在0.75% 腺嘌呤組大鼠中較其他組更高（表2）。腎臟病理切片中，單位面積內(nèi)擴(kuò)張的腎小管數(shù)、含有碎片的小管數(shù)、異常腎小球數(shù)、纖維化面積比例在0.75% 腺嘌呤組大鼠體內(nèi)也有明顯升高（數(shù)據(jù)未示）。

2.5 應(yīng)用別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠抑制腎組織內(nèi)多種蛋白表達(dá)

用25 mg/（kg·d）的別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠至少8周，能夠降低血漿尿酸濃度，改善腎功能，表現(xiàn)為蛋白尿、肌酐、血漿尿素氮及清除率降低。結(jié)構(gòu)上，小球損傷、炎癥和膠原沉積在別嘌呤醇治療后降低（數(shù)據(jù)未示）。別嘌呤醇治療后，腎臟 HO-1、TNF-α、PLA2、NF-κB p50、NF-κB p52和TGF-β的表達(dá)降低（圖4）。

3 討論

目前，科學(xué)家們廣泛接受的CKD動(dòng)物模型是大鼠5/6腎切除模型[8]，這種模型能夠模擬人類腎臟疾病中腎小球?yàn)V過(guò)率下降、血清肌酐和尿素氮升高、體重降低[9]的病理改變，但存在死亡率高、腎臟結(jié)構(gòu)和功能結(jié)局多變，以及剩余可用腎組織體積有限等缺點(diǎn)。其他CKD模型包括單側(cè)腎單次夾閉[10]、雙側(cè)腎單次夾閉、通過(guò)鏈霉素化學(xué)誘導(dǎo)糖尿病[11]和基因模型如糖尿病性肥胖db/db小鼠和ob/ob小鼠[12]。這些模型僅可復(fù)制一部分人類CKD的表現(xiàn)，無(wú)法完整地復(fù)制相應(yīng)的表現(xiàn)。

飲食中添加腺嘌呤能夠誘導(dǎo)腎臟損傷，其主要表現(xiàn)為血清肌酐和血漿尿素氮濃度升高，以及肌酐和血漿尿素氮清除率下降[5]。早期的研究表明，0.75% 腺嘌呤飼喂能夠引起顯著且迅速的病理改變[13]。我們?cè)趧┝糠秶芯恐幸汛_認(rèn)了這一結(jié)果，反映在人類中，即為不常見(jiàn)的急性進(jìn)展性腎臟損傷。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.25% 腺嘌呤能夠在16周時(shí)誘導(dǎo)與人類CKD類似的慢性腎臟損傷。同時(shí)，我們也觀察到慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化程度升高、腎小管萎縮和擴(kuò)張、腎小球損傷等病理改變，模型大鼠的血清脂質(zhì)濃度也有所升高，這可能是由于腎臟損傷引起的代謝障礙所導(dǎo)致。0.25% 腺嘌呤飼喂的大鼠出現(xiàn)了高血壓和心室膠原沉積等癥狀，但無(wú)法確認(rèn)腎臟損傷和心血管系統(tǒng)損傷是同時(shí)發(fā)生還是次序發(fā)生。第4周時(shí)收縮壓升高，尿試紙檢驗(yàn)提示出現(xiàn)蛋白尿；第8周時(shí)收縮壓進(jìn)一步升高，尿液中開(kāi)始出現(xiàn)血液或白細(xì)胞，提示腎臟和心血管疾病同時(shí)進(jìn)展。

表2 不同劑量腺嘌呤飼喂對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響

圖4 腺嘌呤飼喂、別嘌呤醇治療后大鼠腎臟HO-1（A）、TGF-β（B）、TNF-α（C）、PLA2（D）、NF-κB p50（E）、NF-κB p52（F）的表達(dá)

腎臟和心血管反應(yīng)的同時(shí)存在提示飲食中添加0.25% 腺嘌呤能夠克服許多其他CKD動(dòng)物模型的缺點(diǎn)。相比于大鼠，小鼠可能對(duì)腺嘌呤更敏感，這還有待進(jìn)一步的探討。

腺嘌呤誘導(dǎo)的腎臟損傷可能由血漿尿酸濃度升高所致。作為一種嘌呤堿基，腺嘌呤可能通過(guò)黃嘌呤氧化酶而成為尿酸的來(lái)源之一。血漿尿酸濃度在0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠中升高，而在別嘌呤醇治療的大鼠體內(nèi)下降。別嘌呤醇治療能夠改變0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠的心臟和腎臟功能和結(jié)構(gòu)，提示尿酸可能在心臟和腎臟病理改變中扮演主要角色。別嘌呤醇在db/db小鼠中也可改善腎臟功能并緩解小管間質(zhì)纖維化損傷[14]。

另一個(gè)可能的參與機(jī)制是氧化應(yīng)激本身。支持這種假設(shè)的證據(jù)之一是HO-1表達(dá)水平的升高。氧化物可以誘導(dǎo)腎小球選擇性下降，細(xì)胞表型喪失、凋亡[15]，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥細(xì)胞反應(yīng)，氧化物濃度與下降的腎臟功能負(fù)相關(guān)。HO-1是人類腎臟疾病和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭嗅槍?duì)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵防御機(jī)制，HO-1的表達(dá)與蛋白尿和小管間質(zhì)改變的嚴(yán)重程度相關(guān)。HO-1在自由基介導(dǎo)的損傷腎臟中過(guò)表達(dá)。氧化物能夠引起足細(xì)胞損傷，而足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致腎小球損傷和進(jìn)一步硬化的關(guān)鍵因素。

慢性腎病并發(fā)慢性心血管損傷大鼠模型的建立，為今后腎病、心血管系統(tǒng)疾病的研究提供了一種新的動(dòng)物模型，其科研潛力有待進(jìn)一步發(fā)掘。同樣，由于該模型的各方面相關(guān)研究資料尚不多，其穩(wěn)定性及代表性也有待考證。