人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞上清凝膠加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合

冷曉燕，段云飛，段穎，徐燕，常菁

江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司，江蘇 無(wú)錫 214000

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及皮膚缺損部位的再上皮化、肉芽組織的增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等，其中任何一個(gè)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面愈合障礙[1-2]。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，生長(zhǎng)因子扮演著非常重要的角色，這是由于它們?cè)隗w外具有獨(dú)特的、能夠刺激靜止期細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行有絲分裂的能力，在這一復(fù)雜的過(guò)程中，生長(zhǎng)因子的調(diào)控非常精細(xì)，它們能對(duì)傷口愈合的各個(gè)時(shí)期產(chǎn)生影響，從而加快愈合速度[3]。然而，應(yīng)用高劑量單一因子治療難愈性創(chuàng)面雖然能在一定程度上緩解患者病情，但調(diào)控機(jī)制單一，且價(jià)格昂貴，因此限制了其臨床應(yīng)用。有學(xué)者對(duì)臍帶來(lái)源的干細(xì)胞上清液中的成分進(jìn)行了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明該上清液中含有多種細(xì)胞因子，如大量的IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF、TGF-β1等[4]，這些因子在創(chuàng)面愈合過(guò)程中非常重要。

本實(shí)驗(yàn)中，我們將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hu?man umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）上清凝膠直接作用于活體創(chuàng)面，觀察是否會(huì)影響創(chuàng)面的再次上皮化、肉芽組織增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等過(guò)程，探討干細(xì)胞上清對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合的影響，研究hUC-MSCs上清與動(dòng)物創(chuàng)面愈合的關(guān)系，以及促進(jìn)創(chuàng)面愈合的合理蛋白含量，旨在為臨床促進(jìn)創(chuàng)面愈合尋找新的藥物和新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

健康新生兒臍帶取自解放軍101醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的胎兒；雌性ICR小鼠40只，體質(zhì)量25～30 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；α-MEM、胎牛血清（FBS）（BI公司）；CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR單克隆抗體（BD公司）；RNA Simple Total RNA kit、Quantscript RT kit（大連寶生物公司）；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（天根公司）；常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀（BD公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 hUC-MSCs的分離培養(yǎng)

從手術(shù)室取得新鮮健康新生兒臍帶，用PBS沖洗干凈，用剪刀鑷子剔去血管，剝出里面的華氏膠組織，充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10% FBS，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

將原代細(xì)胞消化下來(lái)后，加PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取200 μL細(xì)胞懸液按組合方案分別加入5 μL熒光標(biāo)記的單抗（CD90-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE）混勻，室溫避光孵育20 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 成骨成脂細(xì)胞分化

取第3代細(xì)胞消化傳代后，以約1.0×105/孔接種到6孔板中，成脂、成骨分化及對(duì)照各2孔，待細(xì)胞貼壁后，向分化組加入相應(yīng)的分化培養(yǎng)液。成骨分化培養(yǎng)基中含1.0×10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β磷酸甘油；成脂分化培養(yǎng)基中含10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、50 μg/mL抗壞血酸、10 μg/mL胰島素注射液、0.2 mmol/L吲哚美辛。每3～4 d換液1次，分化4周后，用4% 低聚甲醛將細(xì)胞固定，分別用茜素紅染液和油紅O染色，蘇木精復(fù)染，于顯微鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Oct4、Sox2的表達(dá)

直接向6孔板的每孔細(xì)胞內(nèi)加1 mL TRN?zol，吹打混勻后用氯仿-異丙醇法提取總RNA，采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，以95℃變性30 s、不同溫度退火30 s、72℃延伸30 s行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6 hUC-MSCs上清液的收集

當(dāng)?shù)?代細(xì)胞長(zhǎng)至70% 匯合度時(shí)，用不含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基（α-MEM）培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，用蛋白電泳方法檢測(cè)胎牛血清殘留量，以將胎牛血清耗盡的培養(yǎng)時(shí)間為止，將收集的液體1000 r/min離心5 min，分裝到15 mL離心管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 hUC-MSCs上清液粗提純及總蛋白濃度檢測(cè)

采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行鹽析，收集蛋白沉淀，加水溶解后過(guò)濾，將葡聚糖凝膠柱G-25（5 cm×60 cm）連接AKTA蛋白純化儀，用含0.15 mol/L NaCl的去離子水作為洗脫劑，對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除鹽、脫色處理。將收集到的樣品用0.22 μm濾膜過(guò)濾后于4℃保存?？偟鞍诐舛葯z測(cè)采用BCA法。

表1 GAPDH、Oct4、Sox2引物序列

1.8 凝膠劑的制備

將收集到的純化上清用凍干機(jī)凍干成粉，用無(wú)菌水將凍干粉溶解為濃度19 g/L的蛋白凝縮液。3% 甲基纖維素（MC）與1.3 g/L純化上清等體積混合即為低劑量凝膠劑，3% MC與19 g/L純化上清（凍干濃縮而成）等體積混合即為高劑量凝膠劑。

1.9 小鼠皮膚損傷模型的建立

將ICR小鼠用4% 水合氯醛麻醉，用剃毛器除去背部被毛，采用5 mm皮膚打孔器于小鼠背部制備2個(gè)對(duì)稱的皮膚創(chuàng)傷模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組（10只，實(shí)驗(yàn)期間傷口不給予任何處理）、溶劑對(duì)照組（10只，實(shí)驗(yàn)期間傷口給予3% 甲基纖維素處理）、實(shí)驗(yàn)材料組［共20只，分為Ⅰ組（10只，實(shí)驗(yàn)期間傷口給予低劑量凝膠劑處理）、Ⅱ組（10只，實(shí)驗(yàn)期間傷口給予高劑量凝膠劑處理）］。

1.10 創(chuàng)面愈合率

進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)后小鼠分籠飼養(yǎng)，每天觀察進(jìn)食情況、創(chuàng)面變化及愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

1.11 組織學(xué)分析

第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片，HE染色，評(píng)估不同組別切口愈合的大體情況。第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片，Masson三色染色，評(píng)估不同組別切口愈合過(guò)程中膠原形成的大體情況。

1.12 愈合組織相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè)

白細(xì)胞介素1β（IL-1β）是具有代表性的炎性因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)力生長(zhǎng)因子，VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。另外，Ⅰ型膠原（Col1）是機(jī)體主要的結(jié)構(gòu)膠原，由2條α1鏈（Col1a1）和1條α2鏈（Col1a2）組成三螺旋結(jié)構(gòu)[5]。Col1a1在Ⅰ型膠原合成過(guò)程中起著極其重要的作用，而皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程也與膠原纖維的形成息息相關(guān)[6]。我們采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取愈合組織總mRNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)。Q-PCR檢測(cè)則借助熒光定量PCR試劑盒，設(shè)置程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s，40次循環(huán)；擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線制作，確保擴(kuò)增的特異性。引物序列見(jiàn)表2。

表2 TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β、β-actin引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖形態(tài)改變

臍帶組織培養(yǎng)5～7 d后，可見(jiàn)有部分細(xì)胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細(xì)小的梭形，1周后細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖，形成大小不等的細(xì)胞集落，10 d左右去掉組織塊，15 d左右可鋪滿培養(yǎng)瓶的90% 。傳代后的細(xì)胞呈纖維狀生長(zhǎng)，如圖1。

圖1 第3代hUC-MSCs（100×）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，hUC-MSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD34、CD45、HLADR（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定原代hUC-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

2.3 成骨成脂分化

成脂誘導(dǎo)分化1周后，顯微鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有少量脂滴形成，4周后，油紅O染色可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有較多油滴空泡；成骨分化4周后，細(xì)胞大量重疊成團(tuán)處被染成深紅色的“鈣結(jié)節(jié)”（圖3）。

圖3 hUC-MSCs成脂（A）和成骨（B）體外誘導(dǎo)分化

2.4 Oct4、Sox2的表達(dá)

RT-PCR后電泳檢測(cè)顯示，第2代和第5代hUC-MSCs都表達(dá)Oct4和Sox2（圖4）。Oct4、Sox2是胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志基因，對(duì)維持干細(xì)胞特性具有重要作用，表明hUC-MSCs具有干細(xì)胞特性。

2.5 術(shù)后小鼠創(chuàng)面的愈合情況

2.5.1 小鼠皮膚創(chuàng)面的宏觀所見(jiàn) 打孔造模當(dāng)天，創(chuàng)口邊緣整齊，傷口紅腫，可見(jiàn)明顯出血及滲液，創(chuàng)口較為濕潤(rùn)；第1 d，創(chuàng)口已無(wú)滲血、滲液，創(chuàng)口皮膚干燥，大部分小鼠傷口可見(jiàn)一層膜狀物，少數(shù)已結(jié)痂；第2 d，各組小鼠傷口均可見(jiàn)完整痂皮覆蓋，顏色較淺，質(zhì)地較軟；第3 d，傷口邊緣開(kāi)始收縮，起皺，傷口周圍紅腫消退；第4 d，痂皮顏色普遍加深，傷口面積明顯縮小；第5～7 d，痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離，部分已剝脫，創(chuàng)口表面由增生的上皮覆蓋，傷口面積進(jìn)一步縮??；第8～9 d，痂皮陸續(xù)脫落，愈合程度快慢不一；第10 d，所有小鼠痂皮都已脫落，傷口呈線形愈合，明顯短縮；第15 d，創(chuàng)口已完全愈合，部分小鼠創(chuàng)口皮膚稍隆起，質(zhì)地較韌。

2.5.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間和創(chuàng)面愈合率 每天觀察各組動(dòng)物的創(chuàng)面愈合情況，以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合時(shí)間的依據(jù)。每組于傷后1、3、5、7、9 d隨機(jī)取5只ICR小鼠進(jìn)行創(chuàng)面拍照（圖5），用Im?age J圖像分析軟件，用手動(dòng)方式標(biāo)記未愈合創(chuàng)面的邊緣，運(yùn)用軟件自動(dòng)算出愈合創(chuàng)面的大小。創(chuàng)面愈合率=（最初創(chuàng)面大小-未愈合創(chuàng)面大?。?最初創(chuàng)面大小×100% 。不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率見(jiàn)表3，將不同時(shí)間點(diǎn)的3組創(chuàng)面愈合率分別與空白對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，高劑量組于創(chuàng)傷后第5 d創(chuàng)面愈合率為67.1% ±6.6% ，第7 d為78.1% ±5.8% ，均分別顯著高于空白對(duì)照組第5 d（58.6% ±12.6% ）和第7 d（71.8% ±9.2% ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第3、9 d的創(chuàng)面愈合率無(wú)明顯差別。

圖4 hUC-MSCs的Oct4和Sox2基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖

圖5 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況

2.6 組織學(xué)分析

2.6.1 HE染色 常規(guī)HE染色可見(jiàn)，第3 d血痂與已經(jīng)增厚的創(chuàng)緣皮膚分離，創(chuàng)面可見(jiàn)明顯的肉芽組織形成，梭形成纖維細(xì)胞開(kāi)始增生，各組差異不明顯；第6 d實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組多，總體來(lái)說(shuō)細(xì)胞數(shù)量減少，各組小鼠傷口處仍有厚痂，但已開(kāi)始剝離傷口；第8 d創(chuàng)面周圍明顯上皮化，創(chuàng)面面積明顯縮小，實(shí)驗(yàn)組（高劑量和低劑量組）已填滿整個(gè)傷口區(qū)域，對(duì)照組可見(jiàn)肉芽組織形成，但不完整；第15 d創(chuàng)口（圖6）基本愈合，原先的創(chuàng)口已完全被表皮覆蓋，表皮均質(zhì)變薄，低劑量組傷口寬度明顯小于對(duì)照組，高劑量組傷口處細(xì)胞層次變多，更接近于正常皮膚組織，少數(shù)高劑量組個(gè)體傷口處出現(xiàn)毛囊汗腺等皮膚附屬器官。

2.6.2 Masson染色 創(chuàng)面新生組織切片經(jīng)Masson三色染色后觀察，傷后3～8 d出現(xiàn)肉芽組織，膠原纖維增生不明顯；傷后15 d，膠原纖維增生顯著（圖7，箭頭示膠原纖維，呈藍(lán)色）?？瞻捉M和MC組術(shù)后15 d，新生真皮膠原積累松散，多呈彌漫狀，規(guī)則積累的膠原蛋白較少。低劑量和高劑量組真皮有粗大并明顯走向的膠原纖維，真皮膠原積累優(yōu)于對(duì)照組。

2.7 分子水平檢測(cè)愈合組織相關(guān)因子的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠皮膚切創(chuàng)傷口組織中TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖8。傷后第2 d，高劑量上清處理的小鼠傷口組織TGF-β1和Col1a1基因表達(dá)增加，明顯多于對(duì)照組（P＜0.05），到第3 d時(shí)降至正常水平，與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。此外，傷后第3 d，實(shí)驗(yàn)組（高劑量和低劑量組）VEGF的表達(dá)量均高于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而IL-1β基因的表達(dá)，可以看到高劑量組從第3 d開(kāi)始顯著低于空白對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)ICR小鼠創(chuàng)面愈合率（% ）

3 討論

研究表明，機(jī)體組織在損傷的每個(gè)時(shí)期都有不同的細(xì)胞因子在發(fā)揮作用，如引起組織收縮、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、決定浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的種類、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度、誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞分化及肉芽組織形成、誘導(dǎo)上皮組織形成等。因此，檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組損傷處組織中各種與損傷修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況可以反映出創(chuàng)傷愈合的作用機(jī)制，即通過(guò)什么途徑促進(jìn)傷口愈合[7]。通過(guò)創(chuàng)面愈合率的計(jì)算，我們發(fā)現(xiàn)傷后的初期和后期，各組小鼠傷口面積差異不明顯，傷口愈合依賴于各基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)有序調(diào)控，而表達(dá)產(chǎn)物的積累需要一定的時(shí)間，所以早期高劑量組和對(duì)照組傷口愈合率無(wú)差異，而小鼠皮膚自身具有很強(qiáng)的修復(fù)能力，到了后期，即便對(duì)照組傷口也已基本愈合，所以9 d時(shí)高劑量組與對(duì)照組也無(wú)明顯差異。在3～9 d之間，高劑量組的優(yōu)勢(shì)在外觀上得以顯示，愈合率顯著高于空白對(duì)照組。病理切片使我們能夠觀察到傷口深層次的變化，初期各組病理形態(tài)大體相同，此后實(shí)驗(yàn)組同期的修復(fù)情況要好于對(duì)照組，體現(xiàn)在成纖維細(xì)胞數(shù)量更多，肉芽組織出現(xiàn)得更早更明顯。Masson染色可以幫助我們更好地觀察膠原纖維的積累，藍(lán)色越深代表膠原纖維越多。已有研究證實(shí)，VEGF可以促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集，刺激多種炎性分子的釋放，提高血管的通透性，從而加重炎性反應(yīng)。而持續(xù)的炎性反應(yīng)可能刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌大量的膠原，從而促進(jìn)了病理性瘢痕的形成。在15 d的Masson病理切片上，我們看到實(shí)驗(yàn)組的藍(lán)色更深，膠原的積累是瘢痕形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]，我們處死小鼠前還未見(jiàn)到傷口出現(xiàn)明顯的瘢痕疙瘩，因?yàn)槭聦?shí)上瘢痕的形成需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

圖6 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d（HE染色，箭頭示創(chuàng)面位置）

圖7 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d（Masson染色）

圖8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)傷后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因表達(dá)水平變化

由實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，可以推測(cè)在小鼠皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后的早期，也就是第2～3 d，我們制備的干細(xì)胞上清凝膠促進(jìn)了TGF-β1、Col1a1、VEGF基因的表達(dá)。TGF-β1能直接刺激成纖維細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（包括纖維連接蛋白）、膠原、氨基葡糖等的合成，并對(duì)新合成的細(xì)胞基質(zhì)的降解具有明顯的抑制作用；局部注射TGF-β1可以促進(jìn)傷口愈合和典型肉芽組織形成[9]。TGF-β1作為趨化因子，推動(dòng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、膠原積累。Col1a1表達(dá)量增加又進(jìn)一步加速了膠原的形成。創(chuàng)傷修復(fù)須經(jīng)歷炎性反應(yīng)、肉芽組織形成及組織重塑等主要階段，每一階段都有血管及其相關(guān)生物活性物質(zhì)的參與，新生血管對(duì)于創(chuàng)面愈合起著至關(guān)重要的作用，為快速生長(zhǎng)的細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)支持，以促進(jìn)創(chuàng)傷組織的修復(fù)[8]。VEGF與肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞上的血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖和遷移，促進(jìn)血管構(gòu)建和生成。在造模后3 d，我們從病理切片上確實(shí)觀察到此時(shí)大量肉芽組織形成和成纖維細(xì)胞的聚集，與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果相印證。這些作用都加快了實(shí)驗(yàn)組，特別是高劑量組小鼠創(chuàng)面的修復(fù)速率。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷修復(fù)后期，高劑量組的IL-1β這一炎癥因子表達(dá)水平降低。已有研究表明，小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合初期，傷口出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著傷口愈合，炎性細(xì)胞逐漸減少直至消失[10]。據(jù)此推測(cè)，高劑量的hUC-MSCs上清凝膠加速了傷口愈合，使得炎癥反應(yīng)提前消退，炎性細(xì)胞在高劑量組小鼠傷口組織中更早消失。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了人臍帶來(lái)源干細(xì)胞上清凝膠能夠有效加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，但其具體機(jī)制還須深入研究。