王綠音,楊慧敏，李晶，張慧，李懿，張偉，梁成罡,

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009

甘精胰島素是由重組DNA技術表達的具有長效作用的人胰島素類似物，適用于Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的治療[1]。甘精胰島素由2條肽鏈組成，相對分子質量為6063.0。與人胰島素相比，它在結構上發(fā)生了如下2個變化：首先，用甘氨酸取代了A鏈21位的天冬酰胺；其次，在B鏈的C端添加了2個帶正電荷的精氨酸[2]。這些改變將甘精胰島素的等電點由人胰島素的5.4升高至6.7，皮下注射甘精胰島素后，在生理pH值條件下甘精胰島素的溶解度下降，分子聚集成六聚體形成藥物沉淀，緩慢持續(xù)地釋放少量甘精胰島素，從而產生長效、平穩(wěn)、無峰值的血藥濃度，有效控制空腹血糖，降低低血糖風險[3-4]。

肽圖分析是驗證生物技術產品一級結構完整性及正確性最有效的方法之一，同時也是考察產品的批間一致性及其工程菌遺傳穩(wěn)定性的重要手段。該項目系生物技術產品的常規(guī)檢測指標，對產品的質量控制有非常重要的意義[5]。V8蛋白酶是一種可特異性作用于谷氨酸C端的絲氨酸蛋白酶，在適宜條件下可特異性切割與甘精胰島素A鏈第4、17位，B鏈第13、21位的谷氨酸殘基C端相結合的肽鍵。甘精胰島素A、B鏈之間由2對二硫鍵連接，故水解后產生4個理論肽段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ）[6-8]（圖1）。目前各國藥典及國內外企業(yè)均采用V8酶水解甘精胰島素，然后用RPHPLC分離4個目標肽段得到其肽圖譜[9-10]。研究中發(fā)現，采用《歐洲藥典》9.5版（European Pharma?copoeia 9.5，EP9.5）甘精胰島素肽圖分析方法中的酶解條件，反應的完全性及有效性不佳，從酶解后典型的色譜圖來看，主成分消化不完全，非特異酶解肽段含量較高，理論目標肽段中的Ⅳ和Ⅰ含量過低，有時甚至無法有效檢出，無法確保除酶切位點外的其他序列的正確性及完整性[9]，不適于推廣為行業(yè)標準方法。近年來各申報單位均舍棄了上述方法，以中國藥典2015年版（Chp2015）重組人胰島素肽圖分析方法[11]為基礎進行甘精胰島素肽圖分析，但在酶解反應的完全性、酶解產生的理論目標肽段的穩(wěn)定性等方面仍然存在問題。因此，為滿足甘精胰島素日常質控和科學監(jiān)管及評價需求，研究建立酶解反應完全、特異性強、肽段分離效果好的甘精胰島素肽圖分析方法，具有充分的必要性和現實緊迫性。

圖1 甘精胰島素結構圖及V8蛋白酶切位點

我們通過優(yōu)化酶解條件中的鹽濃度及pH值、酶量、反應溫度與時間等關鍵因素，大大改善了甘精胰島素的酶解效果，建立了滿足上述要求的肽圖分析方法，根據Chp2015四部通則9101[12]藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行了專屬性、中間精密度、重復性及耐用性考察，并通過LC-MS對各肽段的色譜峰進行了準確鑒別。為甘精胰島素產品的研發(fā)生產與申報提供技術支持及質控標準參考，也為新版中國藥典該品種肽圖鑒別質量標準的制訂與提高打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

甘精胰島素樣品來自國內外不同生產企業(yè)；甘精胰島素國家對照品（批號140701-20040）及B32脫精氨酸甘精胰島素對照品（410017-201701）均來自中國食品藥品檢定研究院；V8酶（1000 U/mg，1 mg/支，Worthington公司）；鹽酸、Tris、磷酸、硫酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三氟乙酸（純度≥99.5% ，Alfa Aesar公司）；乙腈（色譜純，Fisher Scientific公司）。

精密稱取56.804 g硫酸鈉，溶于800 mL純水，磷酸調節(jié)pH2.3，加水定容至1 L，即為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液。精密稱取4.8456 g Tris，溶于90 mL純水，稀鹽酸調節(jié)pH9.0，加水定容至100 mL，即為0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液。吸取900 μL稀鹽酸于800 mL超純水中，定容至1 L，即為0.01 mol/L鹽酸溶液。取V8酶，加水制成5000 U/mL的溶液，分裝至0.5 mL離心管中，-20℃保存，用前取出。

LC-20A高效液相色譜儀（包括Prominence LC-20AD/20AT二元泵、Prominence SIL-20A自動進樣器、Prominence SPD-20A/20AV UV-VIS檢測器、LC-solution色譜工作站，島津公司）；Acquity UPLC超高效液相色譜-Xevo G2 Q Tof串聯四級桿飛行時間質譜儀（Waters公司）；HAAKE-S30不銹鋼加熱水浴循環(huán)器（Thermo Scientific公司）；ME155DU電子天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 甘精胰島素肽圖分析方法的建立

1.2.1 樣品處理 分別取甘精胰島素樣品及對照品原料適量，各加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至濃度為10 mg/mL的溶液。取20 μL 10 mg/mL的甘精胰島素樣品及對照品溶液，加至98 μL 0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）溶液中，加入 V8酶溶液（5000 U/mL）4 μL，純水78 μL，混勻，置37℃水浴中保溫1 h，取出后加入3 μL磷酸終止反應，混勻，即為供試品及對照品溶液，4℃保存。

1.2.2 色譜條件 采用Waters Symmetry 300 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），以0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（pH2.3）-乙腈（90∶10）為流動相A、乙腈-水（50∶50）為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，90% ～80% A；5～45 min，80% ～40% A；45～50 min，40% A），流速1 mL/min，檢測波長214 nm，柱溫40℃，進樣量20 μL。

1.2.3 LC-MS條件 按上述方法處理樣品，對酶解產生的各肽段進行液相色譜分離并收集，分別進行LC-MS分析。

1.2.3.1 超高效液相色譜條件 采用Waters Ac?quity UPLC Peptide CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1% 甲酸水溶液為流動相A、0.1% 甲酸乙腈溶液為流動相B，梯度洗脫（0～6.95 min，95% ～60% A；6.95～7.29 min，60% ～95% A；7.29～10.50 min，95% A），流速0.3 mL/min，檢測波長214 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL。

1.2.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式，脫溶劑器溫度450℃，源溫80℃，毛細管電壓3.0 kV，cone電壓40 V，collision電壓Low CE 6eV，collision電壓High CE 6eV，數據采集范圍m/z為100～2000，采用MSE模式獲得各肽段母離子一級及二級質譜數據。

1.2.4 數據分析 采用LC-solution色譜工作站對樣品的理論肽段進行積分，記錄肽段Ⅱ和Ⅲ的分離度及拖尾因子。通過計算各肽段的相對保留時間RRT（樣品肽段的保留時間與對照品肽段的保留時間的比率）對甘精胰島素進行陽性鑒別。

用Masslynx 4.1軟件采集數據，用Biophaml?ynx 1.3.2軟件進行數據處理。選擇V8酶作為酶切試劑，選擇30 ppm的質量偏差，漏切位點數設為1，選擇N端焦谷氨酸環(huán)化為固定修飾。

1.3 甘精胰島素肽圖分析方法的優(yōu)化

對緩沖體系中的Tris濃度與pH值、酶量及酶解溫度與時間進行了優(yōu)化。選擇0.2 mol/L Tris-HCl（pH9.0）、0.4 mol/L Tris-HCl（pH8.0）及 0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）作為 3 個候選酶解緩沖液；酶量的考察，分別加入 2 μL（10 U）、4 μL（20 U）、6 μL（30 U）V8酶水解200 μg甘精胰島素；選擇45℃水浴1 h、37℃水浴0.5 h、37℃水浴1 h及37℃水浴2 h作為4個候選的酶解溫度與時間條件。所有實驗均遵循改變其中1個條件其余保持不變的原則，取同一份樣品按上述不同條件下的制備方法處理后進樣分析。

1.4 所建方法與現有方法的對比

方法1：按1.2.1項樣品處理方法及1.2.2項色譜條件測定甘精胰島素肽圖；方法2：按EP9.5甘精胰島素肽圖鑒別項下的樣品處理方法及1.2.2項色譜條件測定甘精胰島素肽圖；方法3：按Chp2015版重組人胰島素肽圖鑒別項下的樣品處理方法及1.2.2項色譜條件測定甘精胰島素肽圖。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性 取0.01 mol/L鹽酸溶液代替樣品按上述方法處理，作為V8酶對照；取20 μL 10 mg/mL的甘精胰島素樣品，加至78 μL酶解緩沖液中，加入82 μL純水，水浴后終止反應，作為甘精胰島素樣品對照；另取B32脫精氨酸甘精胰島素對照品，按上述方法加入V8酶處理，作為B32脫精氨酸甘精胰島素樣品對照。所有酶解后的樣品均按上述色譜條件進行肽圖分析。

1.5.2 重復性（精密度） 取對照品溶液，按1.2.1項制備甘精胰島素樣品，消化后的溶液按1.2.2項色譜條件重復進樣6次，考察甘精胰島素4個特征肽段保留時間和峰面積的相對標準偏差（RSD）。

1.5.3 中間精密度 由2名實驗者于同一時間按1.2.1方法制備2份樣品，由同一實驗人員于不同時間同法制備3份樣品，每份樣品進樣2次分析。

1.5.4 耐用性 取甘精胰島素對照品，按1.2.1項處理，分別加入V8酶15、20及25 U，得到加入不同酶量后的樣品消化溶液。對甘精胰島素對照品按1.2.1及1.2.2的方法酶解后分析，設置柱溫為38℃、40℃、42℃，得到不同柱溫下的樣品肽圖譜。此外，采用Waters Symmetry300、Aglient ZOR?BAX SB及Phenomenex Luna C18色譜柱對同一份樣品消化液進行肽圖分析。

1.5.5 酶解后樣品的穩(wěn)定性 酶解后的甘精胰島素樣品存放于HPLC儀器的樣品室（6℃）中，于0、12、24 h各進樣分析。將酶解后的樣品分裝后存放于-20℃，于0、1、7 d時，取出溶解并進樣分析。

2 結果

2.1 甘精胰島素肽圖分析方法的建立

按1.2項下的方法分析甘精胰島素的肽圖，HPLC結果見圖2，色譜圖中主要包括4個理論肽段及3個非特異酶解肽段。通過與未處理的甘精胰島素樣品色譜圖比較，可確定肽段Ⅵ為未消化的主成分。其余2個非特異酶解肽段則被推測為位于肽段Ⅰ之后的Ⅳ+Ⅰ片段[2]及肽段Ⅰ′，通過下述LC-MS進行鑒定。肽段Ⅱ和肽段Ⅲ的分離度大于25.0，且二者的拖尾因子均小于1.5，理論目標肽段Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ的RRT均在1.00±0.01范圍內。LC-MS分析得到的各肽段一級質譜結果見表1、圖3，肽段Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ的實測離子質量與理論值一致。通過MSE高能量碎裂獲得的二級碎片b、y離子信息，確定了4個目的肽段氨基酸序列的正確性，證實了位于肽段Ⅰ之后的2個非特異酶解肽段分別為肽段Ⅳ+Ⅰ及Ⅰ′（圖4），該結果也與我們的推測一致。

圖2 新建方法測得的甘精胰島素肽圖譜

圖3 甘精胰島素肽段一級質譜圖

圖4 甘精胰島素Ⅰ+Ⅳ肽段、Ⅰ′肽段MSE譜圖

研究表明，肽段Ⅰ′在肽段Ⅰ之后出峰，是酶解過程中由肽段Ⅰ的A鏈N端第5位谷氨酰胺自身環(huán)化形成的焦谷氨酸衍生物Glp（A5）-I[8]。該衍生物來源于肽段Ⅰ，其生成量與環(huán)境溫度、pH值密切相關[13-14]，本研究以肽段Ⅰ′與Ⅰ的峰面積之比作為衡量肽段Ⅰ穩(wěn)定性的指標。計算圖2中Ⅰ′與Ⅰ的峰面積比值為0.05% ，表明采用本方法酶解所得的肽段Ⅰ的穩(wěn)定性較好。

以未消化的主成分比率（肽段Ⅵ與較為穩(wěn)定的肽段Ⅱ的峰面積之比）作為衡量酶解完全性的指標。計算圖2中肽段Ⅵ與Ⅱ的峰面積比值為0.05% ，表明采用本方法測得的未消化的主成分含量較低，酶解的完全性較好。

2.2 甘精胰島素肽圖分析方法的優(yōu)化

對酶解條件中的幾個關鍵參數進行了優(yōu)化，以不同條件得到的非特異酶解肽段（未消化的主成分、片段Ⅳ+Ⅰ和片段Ⅰ′）的含量作為判定候選條件優(yōu)劣的指標。由圖5可見，采用0.4 mol/L Tris-HCl（pH9.0）作為酶解緩沖液處理樣品，非特異酶解肽段的含量最低，酶解最為完全。

當體系中加入 V8酶的量為 4 μL（20 U）時（圖6），主成分的酶解程度優(yōu)于2 μL（10 U），且與加入6 μL（30 U）時的酶解程度相當。低酶量（10 U）導致的不完全酶解使得肽段Ⅵ+Ⅰ的含量顯著高于20～30 U酶量條件下該肽段的含量。此外，由于酶量增多，酶解更加完全，加入6 μL（30 U）V8酶產生的肽段Ⅵ+Ⅰ的量略低于4 μL（20 U）條件，但二者相差不大，故選擇4 μL（20 U）作為最佳酶量。

在4個酶解溫度與時間條件中，37℃反應0.5 h及45℃反應1 h得到的片段Ⅳ+Ⅰ的量明顯高于于另外2個條件。此外，37℃反應2 h所得的片段Ⅳ+Ⅰ的量略低于37℃反應1 h，這是因為隨著反應時間的延長，片段Ⅳ+Ⅰ被酶切得更加充分。然而隨著酶解反應時間的延長，水解衍生物焦谷氨酸（Ⅰ′）增多，綜合實驗效率及酶解效果，選擇37℃水浴1 h為最佳反應條件（圖7）。

表1 甘精胰島素主要肽段及離子化信息

2.3 所建方法與現有方法的對比

比較采用所建方法、EP9.5甘精胰島素肽圖分析法、Chp2015重組人胰島素肽圖分析法中的酶解條件處理樣品，并按照1.2.2項色譜圖條件測定的肽圖。Chp（圖8A）及本方法（圖8C）的色譜圖可清晰地呈現4個理論肽段，而EP9.5方法的色譜圖（圖8B）中肽段Ⅰ和Ⅳ無法被有效檢出。

在酶解反應的完全性方面，計算3種方法測定的未消化的主成分比率（肽段Ⅵ與Ⅱ的峰面積之比），其中本方法（圖8C）的未消化主成分比率為0.05% ，遠低于Chp（圖8A）的0.23% 及EP9.5（圖8B）的1.14% ，表明3種方法中，Chp方法的酶解效率高于EP9.5，而新方法的酶解反應效率最高，酶解完全性更好。3種方法中肽段Ⅵ+Ⅰ的含量差異也很好地佐證了上述結論，其中EP9.5方法中肽段Ⅳ+Ⅰ的含量更是高至與主要肽段Ⅲ相當。

圖5 用不同酶解緩沖液酶解后的甘精胰島素肽圖譜

圖6 用不同酶量酶解后的甘精胰島素肽圖譜

圖7 用不同酶解溫度和時間酶解后的甘精胰島素肽圖譜

在酶解產生肽段的穩(wěn)定性方面，考察3種方法所得肽段Ⅰ的穩(wěn)定性，計算Ⅰ′與Ⅰ的峰面積比值，本方法（圖8C）為0.05% ，遠低于Chp（圖8A）的0.09% ，表明本方法肽段Ⅰ的穩(wěn)定性更好。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性 專屬性考察結果表明V8酶對照在樣品各肽段出峰時間均無干擾峰出現（圖9E）。B32脫精氨酸甘精胰島素肽圖譜中的肽段Ⅲ′與甘精胰島素的肽段Ⅲ相比，僅在B鏈C端缺失一個親水的精氨酸，導致肽段Ⅲ′疏水性增強，出峰時間明顯晚于甘精胰島素的肽段Ⅲ（圖9B），2種胰島素對照樣品的結果也與之對應（圖9C、D）。這些結果表明本方法分辨率較高，可精準反映甘精胰島素一級結構的正確性，專屬性較好。

圖8 3種酶解方法測得的甘精胰島素肽圖譜

2.4.2 重復性（精密度） 考察甘精胰島素4個特征肽段保留時間和峰面積的RSD，由表2可見，各肽段保留時間及峰面積的RSD均≤0.20% ，表明方法的精密度較好，符合肽圖分析的技術要求。

2.4.3 中間精密度 以樣品中各肽段的相對保留時間（色譜圖上樣品特征峰的保留時間與對照品對應峰的保留時間之比）的RSD作為評價中間精密度的指標，結果見表3。各肽段相對保留時間均在1.00±0.01范圍內，RSD為0.12% ～0.26% ，表明不同人員及不同時間下制備樣品測得結果的變異程度較小，方法的中間精密度良好。

2.4.4 耐用性 耐用性考察結果見表4，當反應體系中的酶量與色譜條件中的柱溫發(fā)生微小變動時，各肽段相對保留時間均在1.00±0.01范圍內，RSD為0.01% ～0.36% 。此外，對同一份樣品采用不同品牌的色譜柱測定，各肽段的相對保留時間RSD均小于0.35% ，肽段Ⅲ與Ⅱ的拖尾因子均小于1.3，分離度均大于25.0（圖6）。這些結果表明上述測定條件微小變化時，測定結果受影響的程度不大，方法的變異度低，耐用性較好。

2.4.5 酶解后樣品的穩(wěn)定性 考察了樣品的儲存穩(wěn)定性（6℃）及凍存（-20℃）穩(wěn)定性。由表5可見，樣品消化液于6℃存放24 h及-20℃條件下儲存7 d后，測定結果依然較穩(wěn)定。

表2 重復性（精密度）考察結果（n=6）

表3 中間精密度考察結果（n=6）

3 討論

肽圖分析作為控制基因重組藥物一致性的重要手段，對重組蛋白的結構確證和專屬性鑒別具有重要意義[15-17]。該方法常通過酶解蛋白質產生肽段碎片，然后對碎片進行可重現的分離及鑒定，包括蛋白質前處理、酶解、特征肽段的分離及鑒別這3個主要步驟。一個好的肽圖分析方法，除須具備高度的特異性、可鑒定酶切位點處序列信息的正確性以外，還應具備酶解反應完全、理論目標肽段分離度良好且清晰可辨、理論目標肽段在酶解體系中穩(wěn)定性較好、非特異酶解肽段的含量較低等特點，從而實現對蛋白質中單一氨基酸的氧化、脫氨等變化的精確檢測。

圖9 專屬性色譜圖

表4 耐用性考察結果（n=3）

表5 酶解后樣品的穩(wěn)定性考察結果（n=3）

現行的甘精胰島素肽圖分析藥典方法收載于EP9.5，該方法在酶解的完全性及理論目標肽段的檢出等方面存在問題，因此各申報單位紛紛參考Chp2015重組人胰島素肽圖分析方法。該方法適用于等電點為5.4的重組人胰島素，對于等電點為6.2的甘精胰島素而言，仍存在樣品無法完全溶解、非特異酶解肽段含量較高等缺陷。研究中發(fā)現，提高緩沖體系中的鹽濃度與pH值，可增加甘精胰島素樣品的溶解度，從而在一定程度上降低未消化的主成分的含量。此外，溫度越高、pH值越低，酶解過程中產生的焦谷氨酸衍生物也會增多。因此，充分考察并對這些影響酶解效果的關鍵因素進行優(yōu)化，對于甘精胰島素肽圖分析方法的建立至關重要。

本研究對酶解條件中的關鍵因素進行了優(yōu)化，包括緩沖體系中的鹽濃度和pH值、V8蛋白酶的量、酶促反應溫度與時間，最終確定了最佳酶解條件。在該條件下，酶解反應更充分，甘精胰島素完整蛋白基本被完全酶解，非特異酶解肽段產生較少，較大程度地降低了其對表征理論目標肽段的干擾。比較采用本方法與EP9.5甘精胰島素、Chp2015重組人胰島素肽圖分析方法的酶解條件測得的肽圖譜可見，本方法在酶解反應的完全性、特異性、酶解產生肽段的穩(wěn)定性等方面具有顯著優(yōu)勢。通過LC-MS法對酶解產生的各目標肽段進行了確證，并且首次對2個酶解產生的非特異肽段（Ⅰ+Ⅳ及Ⅰ′）進行了鑒別。方法學驗證結果表明，該方法對甘精胰島素有很好的專屬性，重復性試驗的RSD在0.20% 以內，中間精密度試驗測得的相對保留時間RSD為0.01% ～0.36% 。此外，酶量及柱溫的微調、更換不同品牌的色譜柱等并未給實驗結果帶來明顯變化，表現了良好的耐用性。且酶解后樣品溶液的儲存穩(wěn)定性及凍存穩(wěn)定性均較好。以上數據顯示該方法適于相應檢測要求，具有相當的準確性和可靠性，可以達到控制產品質量的目的。

綜上，我們建立了良好的甘精胰島素肽圖分析方法，該方法可作為甘精胰島素結構確證與一致性比較的常規(guī)檢驗方法，并廣泛用于工藝開發(fā)、過程控制與終產品的放行檢驗。本研究為該品種質量標準的提高打下了基礎，同時也可為其他胰島素類產品的肽圖鑒別提供參考。