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    HPLC—雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量

    2018-10-19 05:11馮果李瑋何新吳增光鄭傳奇
    中國(guó)藥房 2018年17期
    關(guān)鍵詞:含量測(cè)定高效液相色譜法

    馮果 李瑋 何新 吳增光 鄭傳奇

    中圖分類(lèi)號(hào) R917;R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2018)17-2369-04

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.15

    摘 要 目的:建立同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18,流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為0~15 min,324 nm,>15~45 min,346 nm,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為20 ?L。結(jié)果:傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.33~6.60 μg(r=0.999 7)、0.21~4.20 μg(r=0.999 2);檢測(cè)限分別為6.60、4.20 ng,定量限分別為18.90、12.60 ng;精密度、穩(wěn)定性(48 h)、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%(n=6或n=7);平均加樣回收率分別為98.27%、99.98%,RSD分別為1.96%、1.84%(n=9)。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性和重復(fù)性好,適用于苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的同時(shí)測(cè)定。

    關(guān)鍵詞 了哥王;苗藥;高效液相色譜法;傘形花內(nèi)酯;西瑞香素;含量測(cè)定

    ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for content determination of umbelliferone and daphnoretin in ethanol extract of Miao medicine Wikstroemia indica simultaneously. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (gradient elution) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 324 nm during 0-15 min and 346 nm during >15-45 min. The column temperature was 30 ℃, and injection volume was 20 μL. RESULTS: The linear range was 0.33-6.60 μg for umbelliferone (r=0.999 7) and 0.21-4.20 μg for daphnoretin (r=0.999 2). The detection limits were 6.60 and 4.20 ng, and the limits of quantification were 18.90 and 12.60 ng, respectively; RSDs of precision, stability (48 h) and reproducibility tests were lower than 2% (n=6 or n=7). The average recoveries were 98.27% (RSD=1.96%, n=9) and 99.98% (RSD=1.84%,n=9), respectively. CONCLUSIONS: The method is simple, accurate, stable and reproducible. It is suitable for content determination of umbelliferone and daphnoretin in Miao medicine W. indica simultaneously.

    KEYWORDS Wikstroemia indica; Miao medicine; HPLC; Umbelliferone; Daphnoretin; Content determination

    了哥王[Wikstroemia indica(L.)C. A.Mey.]為瑞香科蕘花屬植物[1],為南方常用苗藥,其性寒、味苦、辛、微溫,有大毒,歸肺、肝經(jīng),具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛等功效。目前,從了哥王中分離得到的80多種化合物可分為香豆素類(lèi)、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾族類(lèi)、皂苷類(lèi)、萜類(lèi)、酰胺類(lèi)、多糖類(lèi)和揮發(fā)油等10大類(lèi)[2-14]。此外,了哥王中還含有大量的酯類(lèi)、酮類(lèi)、烯類(lèi)、醇類(lèi)等化合物。了哥王具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧、利尿、引產(chǎn)、鎮(zhèn)咳祛痰、降低心肌耗氧量等藥理作用[15-20],臨床廣泛用于呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、皮膚等急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、急慢性感染性炎癥、頸淋巴結(jié)腫大、乳腺炎、肝炎、肝硬化、肝腹水、肢體疼痛、帶狀皰疹、皮下剝離傷、坐骨神經(jīng)痛和多種癌癥如乳腺癌、惡性淋巴癌、肺癌及各種體表癌等[21]。傘形花內(nèi)酯和西瑞香素為苗藥了哥王香豆素類(lèi)主要有效成分。本研究采用高效液相色譜(HPLC)-雙波長(zhǎng)法建立了同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的方法,以期為苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量測(cè)定及完善了哥王藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    1260 HPLC儀,包括 G1311B四元泵、內(nèi)置真空脫氣機(jī)、G1329B標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測(cè)器、G1316A 柱溫箱、ChemStation 色譜工作站(美國(guó) Agilent 公司);XL-10B粉碎機(jī)(浙江大鵬機(jī)械有限公司);LT1002E電子天平(常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司);SLG-1000滲漉提取罐(北京儀器廠);RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);FA2004電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠); HH-S4恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);KQ-3200DA數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 藥品與試劑

    了哥王藥材采購(gòu)于廣西各中藥材市場(chǎng),共10批,經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王[Wikstroemia indica(L.)C. A.Mey.],使用時(shí)取藥材粉碎成粗粉(過(guò)1號(hào)篩),備用;了哥王藥材來(lái)源詳見(jiàn)表1。傘形花內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):BW5534,純度:>98%)購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;西瑞香素對(duì)照品(批號(hào):111758,純度:>98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為純凈水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) ;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;波長(zhǎng):0~15 min,324 nm,>15~45 min,346 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 ?L;流動(dòng)相:乙腈(A相)-0.2%磷酸溶液(B相),梯度洗脫(0~5 min,22%~25%A;5~15 min,25%~25%A;15~20 min,25%~30%A;20~25 min,30%~33%A;25~30 min,33~30%A;30~35 min,30%~28%A;35~40 min,28%~25%A;40~45 min,25%~22%A)。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品33.00、21.00 mg,分別置于 50 mL的量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為0.66、0.420 mg/mL的對(duì)照品貯備液,4 ℃保存,備用。

    分別精密吸取傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品貯備液 25.0 mL,置于同一 50 mL 量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為0.330、0.210 mg/mL的混合對(duì)照品溶液,4 ℃保存,備用。

    2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取了哥王乙醇滲漉法提取物粉末(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“乙醇提取物”)[22]約0.5 g,精密稱(chēng)定,置于具塞三角燒瓶中,加80%甲醇30 mL超聲(功率:200 W,頻率:40 kHz )提取30 min,過(guò)濾,揮干濾液,殘?jiān)眉状既芙?,溶液轉(zhuǎn)移至10 mL的量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

    2.2.3 空白溶液 取流動(dòng)相作為空白溶液。

    2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液各適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜。結(jié)果,在該色譜條件下,傘形花內(nèi)酯和西瑞香素之間及與其他成分達(dá)到較好的分離,分離度大于1.5。供試品溶液和混合對(duì)照品溶液的傘形花內(nèi)酯、西瑞香素分別在9.0、35.5 min左右出現(xiàn),理論板數(shù)以傘形花內(nèi)酯計(jì)不低于3 000,詳見(jiàn)圖1。

    2.4 線性關(guān)系考察

    精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL分別至10 mL的量瓶中,甲醇定容,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),收集續(xù)濾液,即得。分別吸取20 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,得傘形花內(nèi)酯、西瑞香素回歸方程分別為y=57.086x+37.736(r=0.999 7)、y=41.162x+2.962 8(r=0.999 2)。結(jié)果表明,傘形花內(nèi)酯、西瑞香素進(jìn)樣量分別在0.33~6.60 μg、0.21~4.20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.5 檢測(cè)限與定量限考察

    取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí),得檢測(cè)限;當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí),得定量限。結(jié)果,傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的檢測(cè)限分別為6.60、4.20 ng,定量限分別為18.90、12.60 ng。

    2.6 精密度試驗(yàn)

    取混合對(duì)照品溶液(傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.330、0.210 mg/mL) 適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果,傘形花內(nèi)酯和西瑞香素峰面積的RSD分別為1.73%、1.51%(n=6),表明儀器精密度良好。

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取了哥王乙醇提取物粉末(批號(hào):20160304)供試品溶液適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果,傘形花內(nèi)酯、西瑞香素峰面積的RSD分別為1.30%、0.74%(n=7),表明供試品溶液室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取了哥王乙醇提取物粉末(批號(hào):20160304)0.5 g,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,共 6 份,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果,傘形花內(nèi)酯、西瑞香素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.751、43.62 mg/g(n=6),RSD分別為1.25%、0.73% (n=6),表明本方法重復(fù)性良好。

    2.9 加樣回收率試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取已知含量的了哥王乙醇提取物粉末(批號(hào):20160304,含傘形花內(nèi)酯、西瑞香素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.751、43.62 mg/g)約0.10 g,共9份,分別加入相當(dāng)于了哥王乙醇提取物原有含量的 80%、100%和 120% 對(duì)照品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果詳見(jiàn)表2。

    2.10 樣品含量測(cè)定

    取10批樣品各適量,分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果詳見(jiàn)表3。

    3 討論

    3.1 提取條件的選擇

    筆者在前期試驗(yàn)中考察了回流提取法和超聲提取法對(duì)樣品中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量的影響。結(jié)果表明,回流提取法傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量分別為0.750 2、43.587 5 mg/g,超聲提取法傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量分別為0.751 0、43.620 0 mg/g,兩者間沒(méi)有顯著差異,且超聲提取法簡(jiǎn)單、方便,故確定超聲提取法為樣品提取方法。在前期試驗(yàn)中,筆者還對(duì)水、乙醇、甲醇和80%的甲醇等不同溶劑進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,采用80%甲醇為溶劑效果更好。

    3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

    通過(guò)對(duì)傘形花內(nèi)酯和西瑞香素進(jìn)行紫外掃描,結(jié)果表明傘形花內(nèi)酯和西瑞香素分別在324、346 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。在分析過(guò)程中筆者還發(fā)現(xiàn),傘形花內(nèi)酯的出峰時(shí)間要早于西瑞香素。為了既能同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)香豆素類(lèi)成分,又不影響這2個(gè)成分的吸收強(qiáng)度,筆者選擇在不同時(shí)間段內(nèi)切換檢測(cè)波長(zhǎng)以同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)成分,即在0~15 min,檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm;15~45 min,檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm。

    3.3 檢測(cè)方法的選擇

    在研究過(guò)程中,筆者對(duì)檢測(cè)方法的流動(dòng)相也進(jìn)行了優(yōu)選,包括對(duì)不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等流動(dòng)相進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,當(dāng)選用乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相時(shí),峰和分離度較好。在該流動(dòng)相條件下筆者還進(jìn)行了等度和不同梯度洗脫試驗(yàn),考察了流速為0.8、1.0 mL/min時(shí)對(duì)傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的出峰時(shí)間和分離效果的影響。結(jié)果表明,選擇梯度洗脫、流速為1.0 mL/min時(shí),傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的出峰時(shí)間和分離效果較好。

    綜上所述,HPLC-雙波長(zhǎng)法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性和重復(fù)性好,適用于苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的同時(shí)測(cè)定。

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    (收稿日期:2018-04-07 修回日期:2018-07-11)

    (編輯:余慶華)

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