豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法的建立

張?zhí)K珍 王益軍 田 蘊(yùn) 賀 燕 葛 敏

(連云港市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，連云港222000)

β-受體激動(dòng)劑是一類動(dòng)物興奮劑，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、降低脂肪沉淀等作用，當(dāng)它們被用于家畜飼糧時(shí)，能顯著提高胴體的瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率。由于用于家畜生產(chǎn)的β-受體激動(dòng)劑通常劑量高，用藥時(shí)間長(zhǎng)，因此容易造成畜禽產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑殘留超標(biāo)，通過(guò)食物鏈的傳遞，最終被消費(fèi)者食用，造成人體內(nèi)的殘留和蓄積損傷[1-3]。人在發(fā)生β-受體激動(dòng)劑中毒反應(yīng)時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的心悸、惡心、嘔吐、心率加快等癥狀，嚴(yán)重的可能會(huì)危害生命健康[4-5]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部明令禁止將β-受體激動(dòng)劑用于所有動(dòng)物性食品。然而在利益的驅(qū)使下，仍有養(yǎng)殖戶將β-受體激動(dòng)劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，因此建立畜禽產(chǎn)品中殘留β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法，通過(guò)生產(chǎn)鏈追溯至不法生產(chǎn)者，在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮著重要作用。

常見的β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法有免疫檢測(cè)方法(如酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法)和色譜法(高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法)[6-10]。近年來(lái)，隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的廣泛運(yùn)用，β-受體激動(dòng)劑的液質(zhì)檢測(cè)方法也不斷地得到優(yōu)化[11-20]。本文研究了豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑(圖1)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)快速檢測(cè)分法，以期能為大批量畜禽產(chǎn)品中5種β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQS Micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源(美國(guó)Waters)；電子天平(德國(guó)賽多利斯)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；固相萃取儀(美國(guó)Supelco)；氮吹儀(美國(guó)Organomation)；PRiME HLB固相萃取柱(美國(guó)Waters)；精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；基本型圓周混合器、數(shù)顯振蕩搖床(德國(guó)IKA)。

圖1 5種β-受體激動(dòng)劑分子結(jié)構(gòu)

5種β-受體激動(dòng)劑：萊克多巴胺純度為98.0%，克倫特羅純度為99.1%，沙丁胺醇純度為99.2%，西馬特羅純度為99.9%，氯丙那林純度為99.9%。5種β-受體激動(dòng)劑內(nèi)標(biāo)：萊克多巴胺-D3純度為99.0%，克倫特羅-D9純度為99.4%，沙丁胺醇-D3純度為98.4%，西馬特羅-D7純度為99.3%，氯丙那林-D7純度為99.8%。甲醇、乙腈為默克色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取5種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別用純甲醇配制成1 mg/mL單標(biāo)儲(chǔ)備液。于-18 ℃避光保存。準(zhǔn)確吸取5種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用純甲醇逐級(jí)稀釋為1 μg/mL的混合溶液，5種β-受體激動(dòng)劑內(nèi)標(biāo)混合溶液配制方法同上，于4 ℃冷藏保存。

1.2 分析條件

色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH-C18(2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣量為4 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：10 mmol/L乙酸銨(pH=5)，流動(dòng)相B：10 mmol/L乙酸銨(pH=5) 甲醇溶液；流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓0.6 kV；離子源溫度500 ℃；去溶劑氣流速1 000 L/Hr。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取絞碎后試樣2.00 g于50 mL離心管中，添加適量?jī)?nèi)標(biāo)。加入10 mL的80%乙腈水溶液，漩渦1 min，振蕩提取10 min，10 000 r/min離心10 min。取6 mL上清液直接加載到6 mL規(guī)格PRiME HLB固相萃取柱，保持1 s每滴流速，收集全部流出液，振蕩混勻。取4 mL流出液在50 ℃下氮?dú)獯抵两?。? mL濃度為10%甲醇水溶液復(fù)溶，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

通過(guò)比較0.2%甲酸水溶液-40%甲醇乙腈溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液和10 mmol/L乙酸銨水溶液-10 mmol/L乙酸銨甲醇溶液(pH=5)3種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中有乙酸銨存在時(shí)，峰型較好，響應(yīng)值較高，因此，用10 mmol/L乙酸銨水溶液-10 mmol/L乙酸銨甲醇溶液(pH=5)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，5種β-受體激動(dòng)劑正離子掃描特征離子色譜圖見圖2。

表1 梯度洗脫程序

MRM: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；RAC：萊克多巴胺；CLE：克倫特羅；SAL：沙丁胺醇；CIM：西馬特羅；CLO：氯丙那林；RAC-D3：萊克多巴胺-D3；CLE-D9：克倫特羅-D9；SAL-D3：沙丁胺醇-D3；CIM-D7:西馬特羅-D7；CLO-D7:氯丙那林-D7。

MRM: multiple-reaction monitoring； RAC: ractopamine; CLE: clenbuterol; SAL: salbutamol; CIM: cimaterol; CLO: clorprenaline; RAC-D3: ractopamine-D3; CLE-D9: clenbuterol-D9; SAL-D3: salbutamol-D3; CIM-D7: cimaterol-D7; CLO-D7: clorprenaline-D7.

圖25種β-受體激動(dòng)劑及其同位素內(nèi)標(biāo)的正離子掃描特征離子色譜圖

Fig.2 Positive ion scanning characteristic ion chromatograms of 5 β-agonists and isotopic internal standard

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正離子掃描(ESI+)模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。以5.0 μL/min的流速注入100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得合適的母離子條件，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量和錐孔電壓，篩選信號(hào)最強(qiáng)的子離子作為定量離子，信號(hào)次強(qiáng)的子離子作為定性離子，得出多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件：離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量(表2)。

表2 5種β-受體激動(dòng)劑及其同位素內(nèi)標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

2.3 方法線性和檢出限

精密量取5種β-受體激動(dòng)劑混合溶液，用10%甲醇水溶液稀釋成濃度為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，含內(nèi)標(biāo)物濃度為5 ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。內(nèi)標(biāo)法以各特征離子質(zhì)量色譜峰與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可以看出，5種β-受體激動(dòng)劑濃度在0.5～50.0 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.999 63～0.999 96。

根據(jù)特征離子色譜峰信噪比(S/N)=3計(jì)算方法的檢出限，得出5種β-受體激動(dòng)劑檢出限為0.01～0.04 μg/kg。按照S/N=10得出5種β-受體激動(dòng)劑定量限為0.02～0.15 μg/kg。

2.4 回收率

稱取豬肝、牛肉、羊肉的空白樣品，進(jìn)行0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)不同濃度的添加回收試驗(yàn)，按照1.3方法進(jìn)行前處理，每個(gè)水平重復(fù)3次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見表4。5種β-受體激動(dòng)劑回收率在豬肝中為93.7%～106.1%，牛肉中為95.2%～104.0%，羊肉中為95.1%～106.0%。結(jié)果表明，該方法具有較好的回收率，可以滿足豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑殘留的日常檢測(cè)要求。

表3 5種β-受體激動(dòng)劑回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表4 豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 精密度

按照1.3前處理方法，分別稱取豬肝、牛肉、羊肉樣品，進(jìn)行陽(yáng)性添加，制備0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)不同濃度的樣品，每個(gè)水平重復(fù)6次，進(jìn)行分析測(cè)定。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。同樣操作方法，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度RSD,結(jié)果見表5。豬肝中5種β-受體激動(dòng)劑日內(nèi)精密度RSD為0.6%～4.5%，日間精密度RSD為0.5%～4.4%；牛肉中5種β-受體激動(dòng)劑日內(nèi)精密度RSD為0.9%～4.1%，日內(nèi)精密度RSD為0.9%～5.3%；羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑日內(nèi)精密度RSD為1.2%～3.6%，日內(nèi)精密度RSD為1.2%～4.1%。結(jié)果表明，該方法具有較好的重復(fù)性和日間精密度?？梢詽M足豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑殘留的日常檢測(cè)要求。

3 討 論

3.1 前處理步驟優(yōu)化

畜禽產(chǎn)品中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，本試驗(yàn)中用乙腈/水溶劑沉淀蛋白質(zhì)，通過(guò)離心去除蛋白質(zhì)。然后用PRiME HLB小柱進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速的凈化。一般固相萃取需要活化、上樣、淋洗、洗脫4個(gè)步驟達(dá)到凈化目的。本試驗(yàn)過(guò)程中，樣品提取液直接上樣至PRiME HLB固相萃取柱，既省略了以往固相萃取過(guò)程中的活化、淋洗、洗脫3個(gè)步驟，又去除了樣品中的脂肪等復(fù)雜基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了一步凈化，凈化后的樣品溶液通過(guò)24孔氮吹儀濃縮，實(shí)現(xiàn)批量快速處理，試驗(yàn)前處理省時(shí)高效，可提高檢測(cè)效率。

表5 豬肝、牛肉、羊肉中5種β-受體激動(dòng)劑的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3.2 液質(zhì)條件的優(yōu)化

本法通過(guò)比較不同流動(dòng)相對(duì)色譜峰的影響，最終確定用10 mmol/L乙酸銨水溶液-10 mmol/L乙酸銨甲醇溶液(pH=5)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)優(yōu)化液相梯度洗脫條件，使5種β-受體激動(dòng)劑的出峰時(shí)間在6 min以內(nèi)，可獲得較好的峰型。

采用電噴霧離子源正離子模式掃描，獲得5種β-受體激動(dòng)劑的母離子和子離子信息，確定最佳定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。通過(guò)對(duì)離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得較好的響應(yīng)值。

4 結(jié) 論

① 當(dāng)5種β-受體激動(dòng)劑濃度為0.5～5.0 μg/kg時(shí)，豬肝中回收率為93.7%～106.1%，牛肉中回收率為95.2%～104.0%，羊肉中回收率為95.1%～106.0%。

② 5種β-受體激動(dòng)劑檢出限為0.01～0.04 μg/kg，定量限為0.02～0.15 μg/kg。

③本試驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，適合大批量畜產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測(cè)分析。