富鋅微生物的篩選及其飼喂雞的生物學效價評定

衛(wèi)愛蓮 代張超 魯 陳 丁小玲 刁 歡 閆一博 李呂木

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥230036)

鋅是動植物及人類重要的必需微量金屬元素，參與體內(nèi)多種生化反應，如蛋白質(zhì)的合成、DNA和RNA的代謝、信號傳導、基因表達以及調(diào)節(jié)細胞的凋亡[1]。不僅如此，鋅還在促進動物的生長、免疫[2]、繁殖及腦神經(jīng)等方面起著重要的作用[3]。并且動物年齡越小，鋅對動物的影響越大[4]。仔豬缺鋅可導致生長受阻，皮膚出現(xiàn)不全角化癥[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，飼喂高于動物營養(yǎng)需要量的高鋅飼糧，對雞[6]、羊[7]、豬[8]等動物具有促生長作用，因而生產(chǎn)上普遍采用高鋅飼糧[9]。由于無機鋅價格低廉，硫酸鋅(ZnSO4)等無機鋅是常用的飼糧鋅營養(yǎng)源。但用無機鋅作為鋅源，其吸收利用率低[10-11]且易造成環(huán)境的污染，所以尋找新的鋅源迫在眉睫。因此，利用率較高的微生物鋅受到了廣泛重視。郭雪娜等[12]在402株酵母菌中篩選到了1株可以將硫酸鋅高效轉(zhuǎn)化為酵母鋅的菌株，其鋅含量可達9.3 mg/g。李宇興等[13]篩選的富鋅酵母，對無機鋅的轉(zhuǎn)化率達50%。Cha等[14]比較了釀酒酵母菌FF-10對氯化鋅、氧化鋅和硫酸鋅等不同無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的效果，發(fā)現(xiàn)氯化鋅轉(zhuǎn)化效率更高。大鼠飼喂試驗表明，酵母鋅的利用率要高于硫酸鋅[15]。隨著國家不斷加大環(huán)境保護的力度，為提高鋅的在動物體內(nèi)的利用率，降低糞尿中鋅殘留量，一些利用率高的鋅源，如氨基酸螯合鋅[16]等更受歡迎，但是由于其價格較高而限制了其在生產(chǎn)上的廣泛應用。因此，研發(fā)價格低廉、制備方法簡單的微生物鋅源顯得尤為必要。為此，本研究擬從實驗室保存的飼用菌種中篩選出高效轉(zhuǎn)化無機鋅為微生物鋅的菌株，以期開發(fā)出價格相對低廉的微生物鋅，為綠色畜牧業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與試驗動物

試驗所用的16株飼用菌種，其編號分別為2、3、4、6、8、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、58，均為本實驗室保存的菌株，其中乳酸菌1株，酵母菌12株，芽孢桿菌3株。鋅標準液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、硫酸鋅(西隴科學股份有限公司)、葡萄糖(煙臺市雙雙化工有限公司)均為分析純。試驗雞為健康的18周齡的海蘭褐公雞，購自安徽省合肥市長豐縣安禽禽業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，土豆200 g，pH自然，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.2 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基

牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.3 乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.05 g，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.4 無機鋅轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

在YPD、NB和MRS培養(yǎng)基中加入相應濃度的硫酸鋅，以上培養(yǎng)基的滅菌條件為121 ℃、15 min。

1.3 主要儀器

火焰原子吸收光譜儀(ZEEnit700p，德國耶拿分析儀器股份公司)、高速冷凍離心機(JW-3021HR，安徽嘉文裝備有限公司)、恒溫搖床(ZHP-250，上海三發(fā)科技有限公司)、烘箱(DGT-G82A，合肥達斯卡特科學有限公司)、消化爐(ML-3-4，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4 鋅含量的測定

1.4.1 標準曲線的繪制

按照GB/T 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[17]中火焰原子吸收吸收光譜法繪制鋅標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為：

Y=0.3026x+0.0127。

1.4.2 微生物鋅含量的測定

待測培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用超純水配制0.9%的生理鹽水，洗滌3次后收集菌體，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，參照GB/T 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[17]進行消化分解，再稀釋5、10、20倍進行上機測定。

1.5 富鋅微生物的篩選

取備選菌種按照各自的標準培養(yǎng)條件培養(yǎng)好后，分別接種到100 mL對應的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，芽孢桿菌于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，乳酸菌于37 ℃靜止培養(yǎng)2 d。然后在固體培養(yǎng)基中進行3次純化，挑取菌株接入無機鋅濃度為2 mg/L的對應的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌培養(yǎng)和芽孢桿菌培養(yǎng)3 d，乳酸菌培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結(jié)束用高速冷凍離心機對菌液進行離心(4 000 r/min、5 min)，棄去上清液，再用去離子水沖洗3遍后在透析袋中透析，直至上清液中檢測不出鋅離子，再離心收集沉淀得到菌體，然后在60 ℃的烘箱中烘干至恒重[18]。以微生物轉(zhuǎn)化無機鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率為依據(jù)，篩選出對無機鋅轉(zhuǎn)化率高的菌株。

1.6 目標菌種培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

對無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和菌液接種量4個因素依次進行優(yōu)化，根據(jù)菌種對無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅轉(zhuǎn)化率的高低，篩選出最佳轉(zhuǎn)化率的組合參數(shù)。以上一次篩選的最優(yōu)轉(zhuǎn)化率因素作為下一次最優(yōu)轉(zhuǎn)化率因素篩選時的條件。

1.6.1 無機鋅濃度的優(yōu)化

設置5個無機鋅濃度，分別為2、4、6、8和10 mg/L，每個處理2個重復，菌液接種量為2%，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.6.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

設置5個培養(yǎng)溫度，分別為26、27、28、29和30 ℃，每個處理2個重復，無機鋅濃度為1.6.1所確定的無機鋅濃度，其余條件與1.6.1相同。

1.6.3 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

設置5個培養(yǎng)時間，分別為48、66、72、84和96 h，每個處理2重復，培養(yǎng)溫度為1.6.2所確定的培養(yǎng)溫度，其余條件與1.6.2相同。

1.6.4 菌液接種量的優(yōu)化

設置5個菌液接種量，分別為1%、2%、3%、4%和5%，每個處理2重復，培養(yǎng)時間為1.6.3所確定的培養(yǎng)時間，其余條件與1.6.3相同。

1.7 目標菌種培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)設計,對無機鋅濃度(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時間(C)和菌液接種量(D)4因素進行3水平正交優(yōu)化，進一步確定其將無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的最佳組合條件，每個處理3個重復。各因素水平為：無機鋅濃度分別為1.5、2.0和2.5 mg/L，培養(yǎng)溫度分別為27.5、28.0和28.5 ℃，培養(yǎng)時間分別為66、72和78 h，菌液接種量分別為2%、3%和4%。

1.8 無機鋅轉(zhuǎn)化微生物鋅的轉(zhuǎn)化率計算

微生物轉(zhuǎn)化后菌體中的含鋅量與培養(yǎng)基中添加的無機鋅含量的百分比即為無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率，其計算公式為：

轉(zhuǎn)化率(%)=100×微生物轉(zhuǎn)化后菌體中的含鋅量/為培養(yǎng)基中添加的無機鋅含量。

1.9 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

將20只健康的18周齡的海蘭褐公雞隨機分4組，即2個對照組和2個試驗組，每組5個重復，每個重復1只，單籠飼養(yǎng)，各組間體重差異不顯著(P>0.05)。對照組1和對照組2飼喂無機鋅(ZnSO4·7H2O)，飼糧鋅含量分別為60和90 mg/kg；試驗組1和試驗2組飼喂酵母鋅(為上述菌種轉(zhuǎn)化的富鋅酵母菌)，飼糧鋅含量也分別為60和90 mg/kg。預試期和正試期各5 d，每只雞日定量飼喂100 g，于08:00和16:00分2次飼喂。采用全收糞法[19]測定飼糧鋅的表觀代謝率，進而計算出酵母鋅中的鋅相對于硫酸鋅中鋅的相對生物學效價。試驗在安徽農(nóng)業(yè)大學動物代謝室進行，采用玉米-豆粕型飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，微量元素預混料組成見表2。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

每千克復合維生素含 Per kg multi-vitamin contained: VA 7 000 IU，VD38 000 IU，VE 30 IU，VC 5 mg，VB113 mg，VB230 mg，VB63 mg，葉酸 folic acid 3 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg。

表2 微量元素預混料組成

酵母鋅中鋅含量 Zinc content of yeast zinc：11.396 mg/g。

鋅的相對生物學效價的有關公式為：

每日鋅食入量(g)=每日采食量×飼糧中鋅含量；每日糞尿鋅排出量(g)=每日糞尿排出量×糞尿中鋅含量；每日鋅存留量(g)=每日鋅食入量-每日糞尿鋅排出量；對照組食入鋅增量(g)=對照組2食入鋅量-對照組1食入鋅量；對照組鋅存留增量(g)=對照組2鋅存留增量-對照組1鋅存留增量；試驗組食入鋅增量(g)=試驗組2食入鋅量-試驗組1食入鋅量；試驗組鋅存留增量(g)=試驗組2鋅存留增量-試驗組1鋅存留增量；鋅生物學利用率(%)=100×鋅存留增量/食入鋅增量；鋅的相對生物學效價(%)=100×試驗組鋅生物學利用率/對照組鋅生物學利用率。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)先用Excel 2007進行整理，再用SPSS 20.0進行分析。單因素試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析及極差分析。所有試驗結(jié)果均用平均值±標準差表示，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從表3中可以看出，58號菌種(釀酒酵母菌)轉(zhuǎn)化無機鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達到了52.68%。因此，以58號菌種進行后續(xù)的研究，以下皆稱該菌種為釀酒酵母菌。

2.2 單因素優(yōu)化

2.2.1 無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率隨著無機鋅濃度的增加而逐漸降低，當無機鋅濃度為2 mg/L時，轉(zhuǎn)化率最高，達到了64.48%，顯著高于其他各組(P<0.05)。這說明無機鋅濃度為2 mg/L時，釀酒酵母菌的富鋅能力最好。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率先逐漸升高再逐漸降低。28 ℃時轉(zhuǎn)化率最高，為76.87%，與26和30 ℃時差異顯著(P<0.05)，與27和29 ℃組差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇28 ℃作為釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的培養(yǎng)條件。

2.2.3 培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，培養(yǎng)時間為72 h時，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達到78.18%，顯著高于48和66 h(P<0.05)，然后隨著培養(yǎng)時間的增加，轉(zhuǎn)化率差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的培養(yǎng)時間為72 h。

2.2.4 菌液接種量對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著菌液接種量的增加，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率先逐漸升高后降低，菌液接種量為4%時，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達到了78.57%，顯著高于菌液接種量為1%和2%時(P<0.05)。隨后再增加菌液接種量，釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率不再增加，但與菌液接種量為3%時差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的菌種接種量為4%。

由單因素試驗設計結(jié)果可得知，釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的最佳條件為：無機鋅濃度2 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間72 h，菌液接種量4%。

表3 16株飼用微生物菌種轉(zhuǎn)化無機鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率

表4 無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和菌液接種量對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3 正交優(yōu)化

從表5中可以看出，影響試驗結(jié)果因素的先后順序為：A>B>D>C，即影響釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的因素依次為無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、菌液接種量和培養(yǎng)時間。由K值可得出最佳組合為：A1B2C1D3，即無機鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間66 h，菌液接種量4%。在此最優(yōu)條件下進行正交的驗證，其結(jié)果為無機鋅的轉(zhuǎn)化率達98.01%，高于所有正交試驗的所有組合，證明該組合即為釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的最優(yōu)組合條件。

從表6中可以看出，無機鋅濃度、培養(yǎng)時間和菌液接種量對轉(zhuǎn)化率有極顯著的影響(P<0.01)，培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化率有顯著的影響(P<0.05)，各因素3水平之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

從表7中可以看出，酵母鋅中鋅的生物學利用率比硫酸鋅高10.33%，其相對于硫酸鋅中鋅的相對生物學效價為114.83%，表明該酵母鋅是優(yōu)于硫酸鋅的一種鋅添加劑。

表5 正交試驗設計結(jié)果的極差分析

表6 Duncan氏多重比較結(jié)果

**表示因素各水平多重比較時差異極顯著(P<0.01)，*表示因素各水平多重比較時差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

** indicated extremely significant differences at each level of multiple comparisons (P<0.01), * indicated significant differences at each level of multiple factor comparisons (P<0.05), and values the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

表7 酵母鋅中鋅的相對生物學效價

3 討 論

3.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同的微生物對微量元素的吸附機制和吸附能力不同，所以在選用微生物轉(zhuǎn)化無機微量元素來改善微量元素的利用率時，菌種的選擇就顯得尤為重要，常常要根據(jù)吸附的元素不同來選擇不同的微生物進行轉(zhuǎn)化微量元素。與此同時，微量元素的濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌液接種量等也對微生物轉(zhuǎn)化無機微量元素的能力有著重要的影響[20]。

3.1.1 無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的能力有較大的影響，本試驗最佳的無機鋅濃度為1.5 mg/L，此條件下轉(zhuǎn)化率達到了98.01%。無機鋅濃度主要影響釀酒酵母菌的活力，當無機鋅濃度過高，可能影響酵母菌的繁殖力，這是因為金屬元素能與釀酒酵母菌中的蛋白質(zhì)結(jié)合，使其變性失活，破壞蛋白質(zhì)的正常生理功能[19]，從而抑制了釀酒酵母菌的生長；無機鋅濃度過低時，不能滿足釀酒酵母菌的營養(yǎng)需要，使其生長延長[21]。楊靖鵬[22]研究表明，無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率為69.25%，低于本試驗的轉(zhuǎn)化率，這可能是因為本試驗的無機鋅濃度較低，有利于釀酒酵母菌將無機鋅盡可能多的轉(zhuǎn)化為微生物鋅，提高無機鋅的利用率，減少無機鋅對環(huán)境的污染。

3.1.2 培養(yǎng)溫度對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

培養(yǎng)溫度影響微生物的生長，酵母在25～32 ℃均可生長，但在不同的溫度下其生長的速度和合成的有機物不同，因此要根據(jù)轉(zhuǎn)化的微量元素選擇合適的溫度。在富集轉(zhuǎn)化的過程中，溫度過高會使釀酒酵母菌中的磷脂分子在膜內(nèi)進行快速的側(cè)向擴散，增加膜脂的流動性，破壞膜的完整性，從而導致釀酒酵母菌的存活率下降[23]。本試驗所篩選的培養(yǎng)溫度與康毅等[24]所研究的釀酒酵母菌需要的溫度條件是相同的。

3.1.3 培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的能力有較大的影響，培養(yǎng)時間會影響微生物的生長及其對無機鋅富集轉(zhuǎn)化量的多少，培養(yǎng)時間過短，釀酒酵母菌未生長完全；培養(yǎng)時間過長，釀酒酵母菌會產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而抑制其增長。本試驗篩選出的培養(yǎng)時間與Chreptowicz等[25]所篩選酵母所需的培養(yǎng)時間是一樣的。

3.1.4 菌液接種量對釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅能力的影響

菌液接種量主要影響無機鋅向微生物鋅轉(zhuǎn)化的速率，菌液接種量過低，微生物生長緩慢，雜菌污染率增加，轉(zhuǎn)化時間延長；菌液接種量過高，微生物生長迅速，在短時間內(nèi)積聚大量代謝副產(chǎn)物，抑制微生物活性物質(zhì)的合成[26]。本試驗的菌液接種量為4%，低于孔林[27]研究的菌液接種量，可能的原因是本試驗的菌液濃度高于其菌液濃度。

3.2 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

在集約化飼養(yǎng)的模式下，動物在生產(chǎn)過程中會集中排泄大量的糞便和尿液，給環(huán)境造成了巨大污染，其中微量元素的大量排出對環(huán)境造成不可逆的損害，不僅如此，對動物本身和周圍植物也造成了一定程度的損傷。其中鋅在動物生產(chǎn)中的排放不僅僅與飼糧中添加水平密切相關[28]，也與動物自身對鋅的利用率有關，即與鋅的生物學效價有密切的關系[29]。因此，提高鋅的利用率對動物本身和環(huán)境均有益。本研究篩選出的富鋅酵母不僅對無機鋅具有較高的轉(zhuǎn)化率，并且其飼喂雞可以顯著提高雞對鋅的生物學利用率，減少糞中鋅排放，其鋅相對于無機硫酸鋅中鋅的相對生物學效價高達114.83%，這一結(jié)果與其他微生物鋅的結(jié)果一致[30-31]，與索海青[31]測得的微生物鋅中鋅的相對硫酸鋅中鋅的相對生物學效價為115%高度一致。

本試驗中酵母鋅的利用率高于硫酸鋅，可能的原因是鋅被釀酒酵母菌富集在胞內(nèi)，以胞內(nèi)鋅的形式進入動物消化道，其結(jié)構穩(wěn)定，不易解離，并且能抵抗與其他配體如銅鋅結(jié)合蛋白等的干擾作用，以一種完整的結(jié)構形式運輸?shù)叫∧c的吸收部位，所以酵母鋅較硫酸鋅對動物具有更高的生物學利用率，這可能符合有機鋅的內(nèi)源吸收假說[8]。大量研究表明，蛋氨酸鋅較硫酸鋅不但具有更高的生物利用率，而且還同時具有免疫和抗氧化活性[32-33]，但酵母鋅是否像蛋氨酸鋅一樣也具有免疫和抗氧化活性呢？這尚待進一步研究。

4 結(jié) 論

① 釀酒酵母菌對無機鋅的轉(zhuǎn)化率最高，可達52.26%。

② 釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機鋅的最優(yōu)條件為：無機鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間66 h，菌液接種量4%。該條件下，可將98.01%的無機鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅。

③ 以釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化的酵母鋅飼飼喂雞，相對與硫酸鋅中鋅，其鋅的利用率是114.83%。