乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚生長性能、血漿生化指標及肝胰臟和腸道組織病理的影響

魏洪城 郁歡歡 陳曉明 晁 偉 鄒方起 陳 沛 鄭銀樺 吳秀峰 梁旭方 薛 敏，4*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，國家水產(chǎn)飼料安全評價基地，北京100081；2.北京首朗生物科技有限公司，北京100041；3.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢430070；4.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點開放實驗室，北京100081)

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，草魚(Ctenopharyngodonidllus)產(chǎn)量居水產(chǎn)養(yǎng)殖之首，年產(chǎn)量超過500萬t[1]。草魚屬于植物食性魚類，配合飼料中魚粉等動物性蛋白質的使用量很低，飼料中以豆粕、棉籽粕及菜籽粕等植物性蛋白質原料為主。相對于棉籽粕和菜籽粕而言，豆粕因其產(chǎn)量高、適口性好和消化率高，草魚腸道肝胰臟對豆粕的酶解消化能力優(yōu)于其他植物性蛋白質，應用最為廣泛[2-3]。但已有許多研究表明，對于魚類來說，植物性蛋白質存在必需氨基酸不平衡[4]、含有抗營養(yǎng)因子(如脲酶、胰蛋白酶等)[5-6]、產(chǎn)品質量不穩(wěn)定等問題[7-9]，并且豆粕中含蛋白酶抑制劑和大豆凝集素，會抑制魚類的消化酶活性[10-11]，導致其過量使用后不利于水產(chǎn)動物的生長和健康。雖然可以通過發(fā)酵、物理加工、多蛋白質源配伍、補充外源氨基酸等方法在一定程度彌補植物性蛋白質的一些缺陷，但是有報道表明，對于植物食性魚類來說，過量使用豆粕引發(fā)的腸道和肝胰臟病變等問題依然很難得到有效解決[12-13]，因此，尋找抗營養(yǎng)因子含量較低的非動物源性飼料蛋白質源，如單細胞蛋白質，對植物食性魚類消化系統(tǒng)的健康十分重要。

隨著微生物發(fā)酵技術逐步應用到飼料工業(yè)生產(chǎn)中，一些國家已經(jīng)建立了菌體蛋白產(chǎn)業(yè)(MBP)，菌體蛋白蛋白質含量高，且氨基酸組成相對齊全，富含維生素和多種微量元素[14]，還能使飼料具有一定鮮味從而改善其適口性[15]；同時，其具有生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)原料來源廣、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，目前已有相當部分菌體蛋白在畜禽和水產(chǎn)飼料中應用[16]。但菌體蛋白產(chǎn)品質量很大程度受非蛋白氮含量的影響，部分產(chǎn)品使用質量較差，例如味精菌體蛋白存在真蛋白質含量低、氨基酸不平衡和氨基酸消化率低等問題[17]。

乙醇梭菌蛋白是以乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)為發(fā)酵菌種生產(chǎn)的一種新型菌體蛋白。乙醇梭菌最早由Abrini等[18]從兔子糞便中分離得到，在生產(chǎn)工藝中以一氧化碳(CO)為原料，進行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心、干燥后獲得高蛋白質生物飼料原料乙醇梭菌蛋白。乙醇梭菌蛋白目前在水產(chǎn)飼料中還沒有明確的評估數(shù)據(jù)，為此，本試驗設計了乙醇梭菌蛋白替代豆粕的梯度添加試驗，研究其對草魚生長性能、血漿生化指標及肝胰臟和腸道組織病理的影響，為乙醇梭菌蛋白在水產(chǎn)飼料中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用乙醇梭菌蛋白為淡黃色粉末，由北京首朗生物科技有限公司提供，粗蛋白質含量為84.69%，胃蛋白酶消化率為90.2%。

1.2 試驗設計和試驗飼料

選擇初始體重為(25.70±0.03) g的草魚540尾，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復30尾魚。對照組(J0組)飼喂基礎飼料，試驗組分別用5%(J5組)和10%(J10組)的乙醇梭菌蛋白替代基礎飼料中27.5%和55.0%的豆粕。

豆粕中缺乏蛋氨酸，富含精氨酸，而乙醇梭菌蛋白與之相反，因此隨著乙醇梭菌蛋白添加量增加，飼料中DL-蛋氨酸(DL-Met)的添加量逐步減少，而L-精氨酸(L-Arg)的添加量逐步增加。各飼料原料按照添加量從小到大的順序逐級攪拌混勻，采用雙螺桿干法膨化機制成粒徑2 mm的擠壓膨化浮性顆粒飼料(TSE65型，北京現(xiàn)代洋工機械科技發(fā)展有限公司)。3組飼料等氮等能且必需氨基酸均滿足草魚需求[19]。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，試驗飼料氨基酸組成見表2。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items組別 Groups J0J5J10磷脂油 Phospholipid oil1.001.001.00合計 Total100.00100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels粗蛋白質 Crude protein31.5731.7131.31粗脂肪 Crude lipid6.257.916.10水分 Moisture12.3211.3712.19粗灰分 Crude ash7.307.267.07總能 Gross energy/(MJ/kg)18.1918.6818.09

1)乙醇梭菌蛋白營養(yǎng)水平 Nutrient levels ofClostridiumautoethanogenumprotein：粗脂肪 crude lipid 0.16%，水分 moisture 6.90%，粗蛋白質 crude protein 84.69%，粗灰分 ash 6.80%，總能 gross energy 22.04 MJ/kg，賴氨酸 Lys 8.70%，蛋氨酸 Met 2.29%，蘇氨酸 Thr 4.02%,牛磺酸 Tau 0.02%，磷 P 0.92%，精氨酸 Arg 3.40%。

2)依據(jù)魚類理想蛋白質模式[20]，草魚飼料中蛋氨酸和精氨酸水平約占飼料粗蛋白質水平的2%和5%進行氨基酸平衡。According to the ideal protein pattern of fish[20], made the amino acid balance based on dietary methionine and arginine levels ofCtenopharyngodonidllusaccount for about 2% and 5% dietary crude protein level.

3)預混料為每千克飼料提供 Premix provided the following per kg of diets: VA 20 mg,VB110 mg,VB215 mg,VB615 mg,VB128 mg,VE 400 mg,VK320 mg,VD310 mg,煙酸胺 niacinaminde 100 mg,維生素C磷酸酯L-ascorbate-2-monophosphate 1 000 mg,肌醇200 mg,泛酸鈣 calcium pantothenate 40 mg, 生物素 biotin 2 mg,葉酸 folic acid 10 mg,氯化膽堿 choline chloride 3 000 mg,玉米蛋白粉 corn protein powder 150 mg,CuSO4·5H2O 10 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 300 mg, ZnSO4·H2O 220 mg,MnSO4·H2O 25 mg,KIO33 mg,Na2SeO35 mg,CoCl2·6H2O 5 mg,MgSO42 000 mg，沸石粉 zeolite 332 mg。

表2 試驗飼料氨基酸組成

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗正式開始前，試驗魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間投喂對照組飼料。試驗在北京南口國家水產(chǎn)飼料安全評價基地室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，水源為曝氣井水，流量為9.64 L/min。用2%食鹽水消毒試驗魚及養(yǎng)殖系統(tǒng)后，隨機挑選體質健康、個體均勻的草魚，分配到容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖試驗從2016年9月26日到2016年12月4日，共10周。

試驗期間每天表觀飽食投喂4次，投喂時間分別為08：00、11:00、15:00、19:00。定期檢測水質，條件保持在溶氧濃度>7.0 mg/L；總氨氮濃度<0.3 mg/L；pH 7.5～8.5；水溫(22±1) ℃，自然光照。

1.4 樣品采集及檢測分析

1.4.1 樣品采集

試驗開始時，取12尾魚作為初始全魚樣品，每4尾作為1個混合樣品。試驗結束時，每桶魚饑餓24 h后稱重，每桶取3尾魚做終末全魚樣品，每桶再隨機取3～4尾魚，用80 mg/L三氯叔丁醇(上海國藥集團化學試劑有限公司)麻醉后，分別測量其體長(自吻端至椎骨末端的長度)、體重，之后尾部取血，加入30 μL/mL抗凝劑(2%NaF+4%草酸鉀)，在4 ℃、4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清血漿保存于-80 ℃的冰箱中待測。每桶隨機取2尾魚的肝胰臟(膽管連接部位)和后腸(距離肛門10 mm)經(jīng)4%多聚甲醛液中固定24～48 h，經(jīng)脫水，包埋，連續(xù)切片6 μm，后經(jīng)脫蠟并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微觀察。

1.4.2 檢測分析

分別采用105 ℃常壓干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、酸水解粗脂肪測定法(GB/T 6433—2006)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—2007)、過濾法(GB/T 17811—2008)測定原料、飼料和魚體的水分、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量及胃蛋白酶消化率；總能的檢測方法參照ISO-9831:1998[21]采用氧彈儀測定；飼料中氨基酸含量采用國標(GB/T 18246—2000)方法進行測定。每個樣品至少測定2個重復。

血漿生化指標包括：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(Glu)、免疫球蛋白M(IgM)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-1α(IL-1α)、丙二醛(MDA)含量及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，試驗所用TC和TG試劑盒購自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，其余試劑盒購自南京建成生物工程研究所，檢測使用酶標儀(Bio-Tek，Burlington，美國)法。

生長性能和形體指標各指標計算公式如下：

存活率(survival rate,SR,%)=100×Nt/N0；增重率(weight gain rate, WGR, %)=100×(Wt-W0+Wd)/W0；特定生長率(specific growth rate, SGR, %/d)=100×(lnFBW-lnIBW)/t；飼料系數(shù)(feed conversion ratio, FCR)=C/(Wt+Wd-W0)；攝食率(feeding rate, FR, %)=100×C/[(W0+Wt+Wd)/2]/t；蛋白質沉積率(produced protein value, PPV, %)=100×(Wt×Bpt-W0×Bp0)/(C×Dp)；肥滿度(condition factor, CF, %)=100×平均體重(g)/[平均體長(cm)]3；臟體比(viscera-somatic index, VSI, %)=100×內(nèi)臟重(g)/全魚重(g)；肝胰指數(shù)(hepato-somatic index, HSI, %)=100×肝胰臟重(g)/全魚重(g)；脾臟指數(shù)(spleen-somatic index, SSI, %)=100×脾臟重(g)/全魚重(g)。

式中：Nt為終末魚數(shù)(尾)；N0為初始魚數(shù)(尾)；IBW為魚體初始均重(g)；FBW為終末均重(g)；W0為魚體初始總重(g)；Wt為魚體終末總重(g)；Wd為死亡魚體總重(g)；C為攝食量(g)；Bpt為終末魚體蛋白質含量(%)；Bp0為初始魚體蛋白質含量(%)；Dp為飼料蛋白質含量(%)；t為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(mean±SE)表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏多重比較法檢驗差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚生長性能和形體指標的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚生長性能和形體指標的影響見表3。J5組末均重、增重率和特定生長率均顯著高于對照組(P<0.05)；J10組末均重、增重率和特定生長率低于J5組，高于對照組，但均沒有顯著差異(P>0.05)。J5和J10組飼料系

數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)，J5組最低。各組攝食率雖然沒有顯著差異(P>0.05)，但隨著乙醇梭菌蛋白添加量的增加有提高趨勢。各組蛋白質沉積率沒有顯著差異(P>0.05)。J10組存活率顯著低于對照組(P<0.05)。J5組肝胰指數(shù)顯著低于J10組(P<0.05)，但二者均與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。各組臟體比、肥滿度和脾臟指數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚生長性能和形體指標的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。表4和表5同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 and Table 5.

2.2 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚血漿生化指標的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚血漿生化指標的影響見表4。J5和J10組血漿TC含量顯著低于J0組(P<0.05)；J10組血漿Glu含量顯著高于J0組(P<0.05)；J10組血漿AST活性顯著高于J5組(P<0.05)，J5組顯著高于J0組(P<0.05)；J10組血漿ALT活性顯著低于J0和J5組(P<0.05)。雖然各組血漿AST和ALT活性均低于文獻報道的正常范圍值，但J10組血漿AST/ALT劇烈升高，顯著高于J0和J5組(P<0.05)。

各組血漿特異性免疫指標IgM、IL-8和IL-1α含量沒有顯著差異(P>0.05)。J5組血漿MDA含量顯著低于J0和J10組(P<0.05)。各組血漿T-SOD活性沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚體成分的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚體成分的影響見表5。J10組的全魚水分含量顯著高于J5組(P<0.05)，但各組的全魚粗灰分、粗蛋白質和粗脂肪含量沒有顯著差異(P>0.05)。

2.4 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚肝胰臟和腸道組織病理的影響

各組草魚肝胰臟組織切片結果見圖1，肝胰臟組織病理診斷分析結果見表6。各組草魚肝胰臟均出現(xiàn)一定比例的輕微病理現(xiàn)象，其中J0組肝胰臟11個樣本中，9尾正常(圖1-A)，1尾出現(xiàn)細胞空泡，疑似脂肪肝現(xiàn)象(圖1-B)，1尾出現(xiàn)細胞核增加聚集、肝細胞結節(jié)現(xiàn)象(圖1-C)；J5組11個樣本中,8尾正常，1尾出現(xiàn)細胞空泡，2尾出現(xiàn)細胞核增加聚集、肝細胞結節(jié)現(xiàn)象；J10組11個樣本中，7尾正常，1尾輕出現(xiàn)微脂肪肝，3尾出現(xiàn)肝細胞結節(jié)現(xiàn)象。以上結果說明，乙醇梭菌蛋白添加量增加有逐步加劇肝細胞核聚集、細胞致密化的趨勢，結合J10組血漿中陡增的AST/ALT，推測該組肝組織損傷程度較J0、J5組較高。

表4 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚血漿生化指標的影響

表5 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對草魚體成分的影響

A：正常細胞；B：細胞空泡化，脂肪肝癥狀(黑色箭頭)；C：細胞結節(jié)化，核聚集(黑色箭頭)。

A: normal cells; B: vacuoles cells, fatty liver symptom (black arrow); C: nodular cells, nucleus aggregation (black arrow).

圖1 肝胰臟組織切片

各組草魚后腸組織切片結果見圖2，后腸組織病理診斷分析結果見表7。各組均出現(xiàn)不同程度地后腸組織損傷，其中J0組后腸11個樣本中，6尾正常(圖2-A)，4尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細胞減少或消失癥狀(圖2-B)；J5、J10組腸道結構均稍有改善，11個樣品中均有8尾正常，J5組2尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細胞減少或消失癥狀癥狀，1尾出現(xiàn)絨毛高度變淺、肌層變薄現(xiàn)象(圖2-C)；J10組3尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細胞減少或消失癥狀癥狀。

表7 后腸組織病理診斷分析

3 討 論

乙醇梭菌蛋白由乙醇梭菌經(jīng)生物發(fā)酵而得，乙醇梭桿菌細胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，嚴格厭氧生長，兼性化能自養(yǎng)，與環(huán)境隔離，性狀穩(wěn)定，對氯霉素、青霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素敏感[18]，目前已經(jīng)獲得了比較完整的基因組序列，無有毒基因的報道[26-27]。乙醇梭菌利用CO和二氧化碳(CO2)作為碳源生長，發(fā)酵CO或者CO2和氫氣(H2)生成乙醇或乙酸鹽，在生產(chǎn)工藝中以鋼鐵工業(yè)煤氣(轉爐煤氣、高爐煤氣)中的CO為碳源，以氨水為氮源，培養(yǎng)基由磷酸(H3PO4)、氫氧化鉀(KOH)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸亞鐵(FeSO4)及少量維生素(維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6、維生素B12、煙酸、葉酸及生物素)組成，經(jīng)氣體預處理、發(fā)酵、蒸餾脫水、菌體分離、噴霧干燥及污水處理5個流程，最后得到乙醇等清潔能源及菌體蛋白，每生產(chǎn)1萬t乙醇，大約可以獲得1 500 t菌體蛋白，具有巨大的開發(fā)潛能。乙醇梭菌蛋白作為鋼鐵工業(yè)煤氣發(fā)酵制燃料乙醇的附屬產(chǎn)品，極大促進工業(yè)廢棄物轉化再利用，減少了有害氣體的排放，與傳統(tǒng)植物源性蛋白質相比，不含抗營養(yǎng)因子，而相對于動物源性蛋白質，具有較低的沙門氏菌、生物胺等，乙醇梭菌蛋白的生產(chǎn)具有綠色、節(jié)能、環(huán)保的特性。但是由于乙醇梭菌蛋白屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)品，且乙醇梭桿菌尚未進入我國飼料添加劑目錄，因此針對乙醇梭桿菌菌種的生物安全性的全面評估需要進一步深入研究。

乙醇梭菌蛋白的粗蛋白質含量高達80%以上，且易于動物消化吸收，富含多種微量元素，不含抗營養(yǎng)因子，同時富含18種氨基酸，總氨基酸占蛋白質的含量≥85%，其中賴氨酸和含硫氨酸含量相對較高，但精氨酸相對缺乏。蛋白質是魚類最主要的營養(yǎng)和能量來源，魚類對蛋白質的需求實際是對必需氨基酸的需求，蛋白質營養(yǎng)平衡實際上是氨基酸平衡，必須氨基酸的缺乏，往往會導致魚類的一些營養(yǎng)性疾病和癥狀的產(chǎn)生[28]。

A：正常腸道組織結構；B：微絨毛(V)脫落，固有層(LP)疏松，杯狀細胞(GC)消失；C：絨毛高度變淺，肌層(Ms)變薄。

A: normal intestinal tissue structure; B: microvillus (V) drop, lamina propria (LP) failure, and goblet cell (GC) lose; C: villus height short, muscularis (Ms) thinning.

圖2后腸組織切片

Fig.2 Histological sections of posterior intestine

蛋氨酸在機體代謝中有著十分重要的作用，是魚類所必需而植物性蛋白質含量不足的限制性氨基酸，特別是豆類原料的第一限制性氨基酸。有研究表明，飼料中蛋氨酸缺乏會顯著降低動物血漿胰島素樣生長因子1(IGF-1)含量[29]，動物的攝食受到IGF-1的調(diào)節(jié)[30]，因此，蛋氨酸的促生長作用可能與提高了生長中期草魚血漿IGF-1含量有關，具體機制還有待深入研究。王勝[31]和唐炳榮等[32]報道，提高飼料中蛋氨酸水平能提高草魚幼魚和生長中期草魚的增重、攝食量、飼料效率、特定生長率和蛋白質效率；廖英杰[33]在團頭魴幼魚對蛋氨酸需要量的研究中也得到了相同的結論，同時王勝[31]還發(fā)現(xiàn)增重率、特殊生長率、飼料效率、蛋白質效率等還受飼料精氨酸水平影響。豆粕為飼料主要蛋白質源，相對于魚類飼料理想蛋白模式以蛋氨酸/粗蛋白質約2%、精氨酸/粗蛋白質約5%來計，豆粕中缺乏蛋氨酸，而乙醇梭菌蛋白中的缺乏精氨酸，因此本試驗補充了相應的限制性氨基酸，但草魚屬于無胃魚，可能對晶體氨基酸的利用能力不足，無法同步吸收外源晶體氨基酸，鄭宗林等[34]和譚芳芳[35]都曾有草魚對晶體氨基酸利用效率相對不高的相關報道。本試驗中，隨著乙醇梭菌蛋白添加量的增加，豆粕添加量的減少，J5組飼料中的內(nèi)源性結合態(tài)蛋氨酸高于J0組，這可能是J5組增重率、末均重、特定生長率和飼料效率高于J0組的原因，但J10組生長性能和J0組差異不顯著，這可能是由于J10組內(nèi)源性精氨酸缺乏引起氨基酸不平衡所致。

氨基酸也是保證腸道組織緊密連接和結構完整的重要營養(yǎng)素[36]，特別是蛋氨酸和精氨酸對維持腸道健康具有重要作用。精氨酸在精氨酸酶(arginase)的作用下生成鳥氨酸，鳥氨酸經(jīng)鳥氨酸脫羧酶的作用生成多胺(精胺、腐胺、精胺)，多胺不僅對腸道上皮細胞的生長、分化和成熟起著重要作用，還對腸黏膜發(fā)育和腸道形態(tài)修復具有不可替代的作用[37]，Cheng等[38-39]在雜交條紋鱸(Moronechrysops×Moronesaxatilis)、美國紅魚(Sciaenopsocellatus)和遲淑艷等[40]在斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)試驗中均證實精氨酸對腸道健康具有重要意義。同樣，在腸道組織中，蛋氨酸通過轉甲基可生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM脫去羧基可生成5′-腺苷甲基硫丙胺，該物質將氨丙基轉移給腐胺或亞精胺也生成多胺[41]，蛋氨酸還通過轉硫作用生成谷胱甘肽的底物半胱氨酸，因此蛋氨酸可以調(diào)控細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量及細胞存活，而GSH也具有保護腸上皮細胞等重要作用[42]。彭艷等[43]研究證實，蛋氨酸可促進幼建鯉腸道發(fā)育及增加皺壁高度。本試驗中對照組和試驗組均有一定比例的腸道損傷現(xiàn)象，對照組的腸道損傷可能與飼料中豆粕含量較高，飼料中大豆抗原的水平較J5和J10組高[44]，并且內(nèi)源蛋氨酸相對缺乏有關；J10組的腸道損傷可能是由于內(nèi)源精氨酸缺乏所致，而乙醇梭菌蛋白替代豆粕后降低了飼料中的抗營養(yǎng)因子水平，所以緩減了J5和J10組后腸組織損傷程度。

然而，當隨著乙醇梭菌蛋白添加量增加，草魚肝胰臟組織病變的比例呈升高趨勢，J10組血漿AST/ALT異常升高。彭艷等[43]發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸對幼建鯉肝胰臟生長發(fā)育具有促進作用；Li等[45]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸可能通過降低肝促炎性細胞因子和自由基的釋放來保護肝臟。本試驗中由于草魚可能對外源添加氨基酸的吸收利用能力不足[46]，導致各組實際吸收利用的蛋氨酸和J10組實際吸收利用的精氨酸不足，從而各組均有肝臟損傷狀況出現(xiàn)[47-48]，并且本研究用乙醇梭菌蛋白為新開發(fā)蛋白質源，在開發(fā)過程中可能存在潛在未知因素，導致肝胰臟病變的比例隨乙醇梭桿菌蛋白添加量增加而升高，Kiessling等[49]在菌體蛋白部分替代魚粉飼喂虹鱒的試驗中有過類似報道，目前相關報道較少，需要經(jīng)進一步研究及生產(chǎn)工藝的不斷改進才能明確其具體原因。唐炳榮[50]報道，蛋氨酸能夠降低血清中的ALT活性，同時提高肝胰臟中的AST、ALT活性；魏祥云[51]研究表明，肝臟受損時，AST從線粒體大量釋入血。本試驗中，J0、J5、J10組內(nèi)源性結合態(tài)蛋氨酸遞增，可能是血漿ALT活性逐漸降低的原因，導致J10組血漿AST/ALT異常升高，提示肝胰臟功能有可能受損，這可能是導致J10組存活率下降的主要原因。此外，肝臟代謝障礙，也可能與高蛋白質含量的乙醇梭菌蛋白替代豆粕后導致J10組中淀粉含量增加有關。

此外，廖英杰等[52]報道，適量范圍內(nèi)增加精氨酸含量可以提高團頭魴幼魚血細胞呼吸爆發(fā)活性,同時降低感染嗜水氣單胞菌后累計死亡率；趙紅霞等[53]也研究表明，軍曹魚幼魚的存活率在一定范圍類隨飼料中精氨酸含量升高而升高。這說明J10組內(nèi)源精氨酸缺乏可能也是直接導致其存活率低另一個原因。

4 結 論

飼料中添加5%乙醇梭菌蛋白替代27.5%的豆粕可以有效提高飼料效率、增重率和特定生長率，降低血漿TC、MDA含量，改善脂肪代謝和抗氧化能力，同時有利于腸道組織健康，從而提高生長性能，在此范圍內(nèi)使用安全有效;而進一步提高乙醇梭菌蛋白添加量至10%則造成肝細胞損傷，肝臟功能受損，存活率降低。本試驗中，建議乙醇梭菌蛋白在草魚飼料中添加量為5%。