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    糖皮質(zhì)激素對雞胚肝細胞脂肪和膽汁酸代謝相關基因表達的影響

    2018-10-17 10:48:04周華金楊家昶王繼光郝洋洋宋志剛
    動物營養(yǎng)學報 2018年10期
    關鍵詞:膽汁酸皮質(zhì)激素肝細胞

    周華金 楊家昶 張 輝 王繼光 郝洋洋 杜 鵬 宋志剛

    (山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/動物醫(yī)學院,泰安271018)

    應激導致家禽能量代謝異常,闡明糖皮質(zhì)激素影響肝臟脂肪、膽汁酸合成的途徑對揭示應激機理、制定防控策略意義重大。糖皮質(zhì)激素參與機體脂肪代謝,肥胖糖尿病小鼠模型和一些胰島素抵抗患者體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平升高,并與脂肪肝和高血糖的發(fā)生相關[1-2]。合成的和天然的糖皮質(zhì)激素都能夠高度調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝,在小鼠原代肝細胞上的研究表明,地塞米松(dexamethasone,DEX)促進蛋白質(zhì)依賴性脂肪酸的攝取,增加三酰甘油和鞘脂的積累[3]。此外,糖皮質(zhì)激素參與膽汁酸代謝,小鼠肝臟特異性敲除糖皮質(zhì)激素受體基因后,膽囊中膽汁酸的含量降低[4];糖皮質(zhì)激素通過誘導膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase, CYP7A1)的活性來調(diào)節(jié)大鼠肝細胞中膽汁酸的合成[5]。肉雞飲水中添加地塞米松抑制了三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化,促進了肉雞肝臟脂肪酸從頭合成[6]。目前,有關應激調(diào)控家禽肝臟代謝的研究多基于活體試驗,所得結(jié)果是糖皮質(zhì)激素、胰島素等多個因素的共同影響,尚需通過體外試驗探究糖皮質(zhì)激素的直接效應。因此,本試驗使用不同濃度的地塞米松處理雞胚肝細胞,通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術對脂肪、膽汁酸合成相關基因進行定量,以揭示糖皮質(zhì)激素的單一影響,為深入研究應激影響家禽能量代謝的機制奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    地塞米松注射液(5 mg/mL)購自山東魯抗晨欣藥業(yè)有限公司,RNA提取試劑盒購自康為試劑生物有限公司(CW0584),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(編號:4897030001)購自羅氏公司,Real Time PCR試劑盒(編號:4913914001)購自羅氏公司。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1C)、肝臟X受體(liver X

    receptor,LXR)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)100、脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1(fatty acid transport protein 1,FATP-1)、CYP7A1、法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)、膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)和膽汁酸攝取相關基因Na+/?;悄扄}共轉(zhuǎn)運體(Na+/taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP)基因的引物序列見表1,由上海生工生物技術有限公司合成。采用2-ΔΔCT法[7]定量目標基因的mRNA相對表達水平,以β-肌動蛋白(β-actin)作為參照基因進行校準。

    表1 引物序列

    F:上游 forward;R:下游 reverse。

    1.2 試驗設計

    選取19胚齡的無特定病原體(SPF)雞蛋,原代培養(yǎng)雞胚肝細胞,細胞以1×106個/mL密度接種于6孔板中,每個孔作為1個重復,常規(guī)(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng),每24 h更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后根據(jù)試驗處理不同分別加入0(對照)、200、500和1 000 nmol/L的地塞米松,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別收集細胞上清液、肝細胞,利用RT-PCR技術進行基因定量。

    1.3 基因定量

    反轉(zhuǎn)錄條件為:55 ℃,30 min(反轉(zhuǎn)錄反應);85 ℃,5 min(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應)。兩步法熒光定量PCR反應條件為:第1步95 ℃變性10 s,1個循環(huán),第2步95 ℃延伸5 s,60 ℃退火34 s,40個循環(huán)。

    1.4 統(tǒng)計分析

    使用SAS 9.0軟件中GLM程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA),平均值采用Tukey’s HSD法進行多重比較,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié) 果

    2.1 地塞米松對雞胚肝細胞脂肪代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

    由圖1-A、圖1-C、圖1-D可知,與對照組相比,500和1 000 nmol/L地塞米松處理分別顯著降低了雞胚肝細胞FATP-1、APOB100和LXR的mRNA相對表達水平(P<0.05);由圖1-B可知,200、500、1 000 nmol/L地塞米松處理均顯著降低了雞胚肝細胞SREBP-1C的mRNA相對表達水平(P<0.05)。

    數(shù)據(jù)柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

    Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

    圖1地塞米松對雞胚肝細胞脂肪代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

    Fig.1 Effects of DEX on mRNA relative expression levels of fat metabolism related genes in chicken embryo hepatocyte

    2.2 地塞米松對雞胚肝細胞膽汁酸代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

    由圖2-A、圖2-B可知,與對照組相比,200 nmol/L地塞米松處理顯著提高了雞胚肝細胞CYP7A1和FXR的mRNA相對表達水平(P<0.05);由圖2-C可知,500和1 000 nmol/L地塞米松處理顯著降低了雞胚肝細胞NTCP的mRNA相對表達水平(P<0.05);由圖2-D可知,200、500和1 000 nmol/L地塞米松處理均顯著提高了雞胚肝細胞BSEP的mRNA相對表達水平(P<0.05)。

    3 討 論

    3.1 糖皮質(zhì)激素與雞胚肝細胞脂肪代謝

    在禽類,脂肪酸的合成反應與哺乳動物相同,脂肪酸和甘油三酯的合成主要在肝臟,并受多種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。有研究表明,糖皮質(zhì)激素與脂肪代謝密切相關,大鼠按0.05 mg/kg劑量每天灌服地塞米松7周后,肝臟脂肪含量下降,脂肪合成相關基因:脂肪酸結(jié)合蛋白-1(FABP-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GPAT)基因在肝臟中的mRNA相對表達水平下降[8],提示地塞米松具有抑制脂肪合成的作用。在肝臟,脂肪酸可以通過脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(fatty acid transport protein,F(xiàn)ATP)家族介導的主動吸收穿越質(zhì)膜,其中FATP-1可以促進長鏈脂肪酸進出細胞的通量,此外,F(xiàn)ATP-1可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂肪酸?;饔枚绊懠毎麅?nèi)脂肪酸代謝和脂質(zhì)蓄積[9-10]。在本研究中,高劑量地塞米松處理顯著降低了雞胚肝細胞FATP-1的mRNA相對表達水平,表明糖皮質(zhì)激素對肝細胞脂肪酸合成具有抑制作用。

    圖2 地塞米松對雞胚肝細胞膽汁酸代謝相關mRNA相對表達水平的影響

    LXR和SREBP-1C同樣在脂肪合成過程中發(fā)揮關鍵作用。LXR是膽固醇水平的感受器,并能調(diào)節(jié)與膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運、流出、排泄有關的一系列基因,其過度表達會使脂肪合成相關酶的基因轉(zhuǎn)錄明顯加強。在朗德鵝上的研究發(fā)現(xiàn),LXRα的mRNA相對表達水平增加可促進鵝肝臟脂肪沉積[11]。在甘油三酯的合成中,脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A(ACC)是限速酶。FAS和ACC的表達受SREBP-1C的調(diào)控[12]。當細胞內(nèi)膽固醇含量過高,LXRs激活SREBP-1C,后者可增加油酸的合成,增多的不飽和脂肪酸與過多的膽固醇酯化,從而促進膽固醇的儲存;而減少LXRs的激活可抑制SREBP-1C的轉(zhuǎn)錄,從而減少脂肪形成和甘油三酯合成。在本研究中,高劑量地塞米松處理顯著降低了LXR和SREBP-1C的mRNA相對表達水平,同樣表明糖皮質(zhì)激素對脂肪合成具有抑制作用。

    APOB是極低密度脂蛋白(VLDL)的組成成分,是脂蛋白合成、分泌、運輸?shù)墓羌艿鞍?,對能量轉(zhuǎn)運、代謝等有顯著作用。VLDL將甘油三酯從肝臟運送到外周組織,肝細胞內(nèi)過量合成APOB導致血漿中VLDL和低密度脂蛋白(LDL)含量升高,可引發(fā)動脈粥樣硬化等心腦血管疾病,還可導致肝臟細胞內(nèi)脂質(zhì)積累,引發(fā)脂肪肝[13]。此外,雞APOB基因SNP(T123G)對腹脂和腹脂率有顯著影響[14-15]。在本研究中,高劑量地塞米松處理顯著下調(diào)了肝細胞APOB100的mRNA相對表達水平,提示糖皮質(zhì)激素具有抑制脂蛋白組裝轉(zhuǎn)運的作用。

    3.2 糖皮質(zhì)激素與雞胚肝細胞膽汁酸代謝

    膽汁酸在肝臟實質(zhì)細胞中由膽固醇合成,CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶[16]。研究表明,糖皮質(zhì)激素對膽汁酸合成具有劑量依賴性刺激作用,50 nmol/L地塞米松處理大鼠肝細胞發(fā)現(xiàn),第2天和第3天膽汁酸的合成水平分別上升了3倍和7倍;1 μmol/L地塞米松處理2 d后,肝細胞膽汁酸合成水平上升了2.2倍[17]。糖皮質(zhì)激素通過誘導CYP7A1活性調(diào)節(jié)大鼠肝細胞膽汁酸合成[5]。地塞米松和甲狀腺素聯(lián)合作用能顯著提升人和大鼠肝細胞中總膽汁酸的合成,使膽酸的含量提高了23%,二羥膽酸的含量提高了77%,CYP7A1的活性也提高,在培養(yǎng)的肝細胞上,27-羥化酶mRNA并不自然出現(xiàn),培養(yǎng)液中添加地塞米松72 h后,27-羥化酶mRNA出現(xiàn),說明地塞米松可提高CYP7A1和固醇27羥化酶的活性,從而調(diào)節(jié)膽汁酸合成[18]。與前人研究相似,本研究中低水平地塞米松處理促進了CYP7A1的mRNA相對表達水平,證實了糖皮質(zhì)激素可促進膽汁酸的合成。

    NTCP位于肝細胞基底膜,是攝取膽汁酸的主要轉(zhuǎn)運體。有報道證明,地塞米松是大鼠肝臟中BSEP的強效誘導劑,大鼠肝細胞在100 nmol/L地塞米松的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,BSEP具有較強的功能活性[17],這與本研究中地塞米松誘導BSEP的mRNA相對表達水平上升的結(jié)果相一致。

    有研究表明,CYP7A1受到FXR的負反饋調(diào)控,在肝臟中,F(xiàn)XR通過激活下游靶基因SHP抑制CYP7A1的表達,減少了膽汁酸的合成[19-20]。此外,肝臟中的FXR被膽汁激活后,下調(diào)了NTCP的基因表達,提高了膽汁酸外流轉(zhuǎn)運體BSEP的基因表達[21-22]。在本研究中,200 nmol/L地塞米松處理促進了雞肝細胞CYP7A1和FXR的mRNA相對表達水平,500和1 000 nmol/L地塞米松處理抑制了NTCP的mRNA相對表達水平,提高了BSEP的mRNA相對表達水平,提示低水平糖皮質(zhì)激素可以促進雞胚肝細胞膽汁酸的合成和排出,高水平糖皮質(zhì)激素抑制膽汁酸攝取。

    4 結(jié) 論

    高劑量糖皮質(zhì)激素對雞胚肝細胞的脂肪合成、轉(zhuǎn)運和膽汁酸的攝取具有抑制作用;低劑量糖皮質(zhì)激素可以促進膽汁酸的合成和排出,部分反應具有劑量依賴性。

    致謝:

    感謝山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院趙景鵬老師對論文撰寫的指導。

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