瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊胃腸道內(nèi)容物和血漿中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

趙 芳 陳 暉 王 根 高 超 趙國棟 馬 晨 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

褪黑素(melatonin，MT)除了可以在松果體中合成，腸道組織中也可合成大量的褪黑素[1]，且腸道組織中的褪黑素含量是松果體的400～500倍[2]。腸道組織中的褪黑素來自腸黏膜中的嗜鉻細(xì)胞[3]，腸黏膜中合成的褪黑素可分泌至腸道內(nèi)容物中[4]。腸道中褪黑素含量的分布存在明顯的種屬差異。豬胃腸道內(nèi)容物中褪黑素含量變化趨勢(shì)為：結(jié)腸>盲腸>回腸>空腸>胃；而牛胃腸道內(nèi)容物中褪黑素含量變化趨勢(shì)為：回腸、結(jié)腸、盲腸>瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃>空腸[5]。大鼠直腸內(nèi)容物中褪黑素含量較高，但在胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸內(nèi)容物中褪黑素含量較低[6]。豬在禁食30 h后進(jìn)行飼喂，除直腸外，各腸段組織、腸黏膜、內(nèi)容物中褪黑素含量均明顯升高，且內(nèi)容物中褪黑素含量均在進(jìn)食后5 h達(dá)峰值[5]。因此，禁食與采食、攝入褪黑素或褪黑素的前體物質(zhì)等均能影響動(dòng)物腸道組織或腸道內(nèi)容物中褪黑素的含量[7]。

腸黏膜中由色氨酸為前體物質(zhì)合成并分泌到腸道內(nèi)容物中的褪黑素在動(dòng)物腸道運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和組織健康維護(hù)中具有重要作用[2]，其中5-羥基色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)是色氨酸代謝為褪黑素過程中重要的中間產(chǎn)物之一，5-羥基色氨酸在芳香族氨基酸脫羧酶、5-羥色胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，轉(zhuǎn)化為褪黑素。褪黑素及其前體物質(zhì)如5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、5-羥基色氨酸等在綿羊腸道內(nèi)容物中的含量分布特點(diǎn)尚未見有研究報(bào)道，因此，本試驗(yàn)一方面研究褪黑素及其前體物質(zhì)如5-羥色胺、5-羥基色氨酸等在綿羊腸道內(nèi)容物中的含量分布特點(diǎn)，另一方面研究補(bǔ)喂褪黑素前體物質(zhì)——瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊腸道內(nèi)容物中褪黑素及其前體物質(zhì)如5-羥色胺、5-羥基色氨酸等含量的影響，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)褪黑素在綿羊等反芻動(dòng)物腸道運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和組織健康維護(hù)中的作用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2017年8月1至2017年8月16日在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊場(chǎng)進(jìn)行，采集血樣當(dāng)天日出時(shí)間為06:08，日落時(shí)間為22:04。

1.2 試驗(yàn)材料

5-羥基色氨酸購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，純度為98%；瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸是以5-羥基色氨酸為原料，由北京亞禾營養(yǎng)高新技術(shù)有限責(zé)任公司加工制成，其中5-羥基色氨酸有效含量為45.00%，過瘤胃率為88.60%。瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸過瘤胃率的測(cè)定過程為：準(zhǔn)確稱取10 g制成的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸于帶玻璃塞的錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，放入37 ℃、50 r/min的水浴搖床中，預(yù)孵4 h后取出錐形瓶，過濾后得5-羥基色氨酸溶液。使用高效液相色譜儀測(cè)定濾液中5-羥基色氨酸含量。

瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸的過瘤胃率(%)=[(瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸中5-羥基色氨酸含量-溶液中5-羥基色氨酸含量)/瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸中5-羥基色氨酸含量]×100。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取健康、平均體重為(47.79±3.70) kg的3歲哈薩克母羊15只，按體重分為3組，每組5只，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組。所有羊只飼喂同一營養(yǎng)水平的粉狀精料(購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司)，每天每只羊的粉狀精料飼喂量為體重的1.2%，玉米青貯飼喂量為0.9 kg，混合干草(苜?！名溄铡?∶1)自由采食，在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組羊只分別飼喂111、222 mg/kg BW的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸，飼喂量參考Namboodiri等[8]的研究結(jié)果。試驗(yàn)過程中使用的粉狀精料組成及營養(yǎng)水平見表1，玉米青貯、苜蓿、麥秸的營養(yǎng)水平見表2。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間，將每天每只羊的粉狀精料和青貯、瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸平均分為2份，分別于07:45、19:45飼喂，飼喂時(shí)將瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸與50 g粉狀精料混合后飼喂，待綿羊攝入完畢后再飼喂其他粉狀精料和玉米青貯。飼喂粉狀精料、玉米青貯時(shí)為單欄飼養(yǎng)，采食完畢后羊只在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中自由活動(dòng)。

1.5 樣品的采集與處理

于試驗(yàn)的第16天，早上采食后6 h進(jìn)行頸靜脈采血，制備血漿。血液采集后立即對(duì)綿羊宰殺，放血2 min后，將羊只放入手術(shù)臺(tái)上，腹部向上，使用手術(shù)刀、剪刀沿腹線將羊只腹腔打開，使用線繩在瘤胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、盲腸的腸結(jié)處結(jié)扎，剪斷結(jié)扎處后，立即將腸道內(nèi)容物捋至干凈的塑料燒杯中，混勻后分裝至凍存管中(瘤胃液使用60目尼龍袋過濾)，標(biāo)記好后立即放入液氮中保存。

表1 粉狀精料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

每千克預(yù)混料含有One kg of premix contained the following: VA 480 IU，VB1816 mg，VB2333 mg，VB649 mg，VD 70 IU，VE 21 333 IU，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酰胺 nicotinamide 485 mg，Cu (as copper sulfate) 11 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 35 mg，Mn (as manganese sulfate) 33 mg，Zn (as zinc sulfate) 31 mg，I (as potassium iodide) 2 mg，Se (as sodium selenite) 6 mg，Co (as cobalt chloride) 1 mg。

表2 玉米青貯、苜蓿、麥秸的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.6 樣品的測(cè)定

綿羊血漿中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素的含量均送至北京華英生物技術(shù)研究所進(jìn)行測(cè)定。5-羥基色氨酸、褪黑素含量測(cè)定使用放免法(XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，西安核儀器廠)，5-羥色胺含量測(cè)定使用酶免法(華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)。

腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺(N-acetylserotonin，NAS)、褪黑素、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA)含量使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-MS/MS)技術(shù)測(cè)定(高效液相：1290 Infinity series UHPLC System，購自Agilent公司；高分辨質(zhì)譜：Q Exactive Focus，購自Thermo Fisher Scientific公司)。使用超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離，以平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring，PRM)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。

樣品處理過程：稱取100 mg內(nèi)容物(1 mL瘤胃液)于Eppendorf管中，加入1 mL提取液(乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1)，旋渦混勻30 s，加入鋼珠，45 Hz研磨處理10 min，冰水浴條件下超聲10 min，12 000 r/min離心15 min(4 ℃)，取100 μL上清液用于UHPLC-MS/MS分析。流動(dòng)相、質(zhì)譜條件：液相色譜流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。柱溫箱溫度為40 ℃，樣品盤設(shè)為4 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL。質(zhì)譜條件：噴霧電壓=+3 500/-3 100 V，氣流量(N2)=40，輔助氣體流量(N2)=5，輔助氣體溫度=350 ℃，離子傳輸管溫度=320 ℃。色譜梯度見表3。

表3 色譜梯度

進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析之前，將目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液引入質(zhì)譜中。針對(duì)每個(gè)目標(biāo)化合物，對(duì)其PRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并選取其中響應(yīng)最好的

子離子用于定量分析，其他子離子用于目標(biāo)化合物定性分析，PRM參數(shù)優(yōu)化見表3。

表4 PRM參數(shù)優(yōu)化

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行初步整理，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，各組間多重比較采用Duncan氏法。

2 結(jié) 果

2.1 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊瘤胃液中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表5可知，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組瘤胃液中5-羥基色氨酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組瘤胃液中5-羥色胺含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；對(duì)照組瘤胃液中褪黑素含量顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)，而對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組相比差異不顯著(P>0.05)；各組間瘤胃液中N-乙酰-5-羥色胺、5-羥基吲哚乙酸含量無顯著差異(P>0.05)。

2.2 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)十二指腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表6可知，十二指腸內(nèi)容物中，試驗(yàn)Ⅱ組5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰5-羥色胺含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組褪黑素和5-羥基吲哚乙酸含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)空腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表7可知，空腸內(nèi)容物中，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組5-羥基色氨酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組5-羥色胺、N-乙酰5-羥色胺、褪黑素含量極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)，對(duì)照組5-羥基吲哚乙酸含量極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.01)。

2.4 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)回腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表8可知，回腸內(nèi)容物中，5-羥基色氨酸含量的變化為試驗(yàn)Ⅱ組>試驗(yàn)Ⅰ組>對(duì)照組，各組間差異極顯著(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組5-羥色胺含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅱ組N-乙酰-5-羥色胺含量極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)；各組間褪黑素、5-羥基吲哚乙酸含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊瘤胃液中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表6 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊十二指腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

表7 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊空腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

2.5 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)盲腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表9可知，盲腸內(nèi)容物中，對(duì)照組5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺含量極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組(P<0.01)，且試驗(yàn)Ⅱ組5-羥基色氨酸、N-乙酰-5-羥色胺含量均極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)；各組間褪黑素含量無顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組5-羥基吲哚乙酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表8 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊回腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

表9 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊盲腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

2.6 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表10可知，結(jié)腸內(nèi)容物中，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺、褪黑素、5-羥基吲哚乙酸含量均高于對(duì)照組；其中，試驗(yàn)Ⅱ組5-羥基色氨酸含量極顯著高于對(duì)照組(P<

0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組褪黑素含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組5-羥基吲哚乙酸含量顯著或極顯著高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。

2.7 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

由表11可知，綿羊早上采食瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后6 h，血漿中5-羥基色氨酸含量增加，且試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組血漿中5-羥基色胺含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組血漿中褪黑素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表11 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

3 討 論

3.1 綿羊胃腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量的分布特點(diǎn)

目前，關(guān)于綿羊腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素、N-乙酰5-羥基色氨酸、5-羥基吲哚乙酸含量分布的研究報(bào)道較少。在本試驗(yàn)中，綿羊各腸段內(nèi)容物中5-羥基色氨酸含量分布特點(diǎn)有很大差異，表現(xiàn)為盲腸>空腸、結(jié)腸>瘤胃液、十二指腸、回腸。腸道內(nèi)容物中的5-羥基色氨酸可能來自腸道中微生物以飼糧中的色氨酸為底物經(jīng)羥化后形成[9]。5-羥基色氨酸是5-羥色胺的重要前體物質(zhì)，但導(dǎo)致綿羊胃腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸含量分布的差異及其是否還有其他生理功能尚不明確。5-羥色胺主要存在于腸黏膜的嗜鉻細(xì)胞中[10]。大鼠腸組織中5-羥色胺含量變化為：空腸<胃部<回腸<結(jié)腸[11]。在本試驗(yàn)中，對(duì)照組綿羊腸道內(nèi)容物中5-羥色胺含量在結(jié)腸中最高，腸道內(nèi)容物中5-羥色胺含量變化為：瘤胃液<十二指腸<空腸<回腸<盲腸<結(jié)腸，與大鼠腸組織中5-羥色胺分布情況基本一致。而在梅花豬腸組織中，5-羥色胺在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中均有分布，但在十二指腸中含量最高[12]，這可能與豬、綿羊消化系統(tǒng)差異性及采食的飼糧中色氨酸的水平有關(guān)[13]。N-乙酰-5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸均是5-羥色胺的代謝產(chǎn)物，其中N-乙酰-5-羥色胺是褪黑素形成過程中重要的中間產(chǎn)物。大鼠腸道內(nèi)容物中5-羥基吲哚乙酸含量變化為：胃部、回腸<空腸<結(jié)腸[11]，本試驗(yàn)中，對(duì)照組綿羊瘤胃液和結(jié)腸內(nèi)容物中N-乙酰-5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸含量較高。

腸道中含有大量的褪黑素[14]，腸道中的褪黑素主要在腸黏膜中的嗜鉻細(xì)胞中合成[15]。腸嗜鉻細(xì)胞主要以L-色氨酸為底物，經(jīng)過羥化、脫羧、轉(zhuǎn)氨基后合成褪黑素，且腸道中褪黑素的分布與腸道中嗜鉻細(xì)胞的密度有關(guān)[16-17]，腸道內(nèi)容物中的褪黑素可能有3種來源：腸黏膜[18]、飼糧[7]、腸道微生物[9]。此外，哺乳動(dòng)物膽汁中含有較高含量的褪黑素[19]。因此，廣泛存在的肝腸循環(huán)也可能是腸道中褪黑素的來源之一。本試驗(yàn)中，胃腸道內(nèi)容物中的褪黑素含量分布特點(diǎn)是：十二指腸>瘤胃、空腸>回腸、盲腸>結(jié)腸。牛的胃腸道內(nèi)容物中褪黑素含量變化為：回腸、盲腸、結(jié)腸>瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃>空腸[13]。西班牙斗牛食管、胃部、腸道前端、腸道后端內(nèi)容物中褪黑素含量分別為73、78、20、152 pg/g[20]。本試驗(yàn)測(cè)定的腸道內(nèi)容物褪黑素含量分布與前人的研究結(jié)果有所不同，可能的原因是：1)與腸道的消化吸收、采食控制有關(guān)，尤其是后腸中的褪黑素含量可能受到腸道內(nèi)容物含量、食糜蠕動(dòng)速度影響[21]；2)采樣時(shí)間的差異，牛胃腸道中內(nèi)容物是在牛采食后立即采集，而本試驗(yàn)是在綿羊采食后6 h才采集樣品。由此看來，動(dòng)物腸道中的褪黑素含量受采食時(shí)間、采食飼糧的營養(yǎng)水平、消化道特點(diǎn)等多種因素的影響。

3.2 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊胃腸道內(nèi)容物5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

Namboodiri等[8]通過腹腔注射的方式給綿羊分別注射了20、200 mg/kg BW的5-羥基色氨酸，腹腔注射可直接進(jìn)入血液循環(huán)，而在飼糧中添加5-羥基色氨酸則會(huì)經(jīng)過胃腸道的代謝，且5-羥基色氨酸能否在瘤胃中降解尚不明確。因此，本試驗(yàn)選擇的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸的添加量為111、222 mg/kg BW。在本試驗(yàn)中，綿羊攝入不同水平瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后，瘤胃液中5-羥基色氨酸、5-羥色胺含量增加，可能是由于本試驗(yàn)飼喂的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸在瘤胃的蠕動(dòng)、飼糧的擠壓下，部分瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸的包衣破裂，使5-羥基色氨酸釋放出來，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為5-羥色胺。瘤胃液中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺含量增加，而褪黑素含量則降低，可能本試驗(yàn)飼喂的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)N-乙酰-5-羥色胺轉(zhuǎn)化為褪黑素過程中的羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶未起到調(diào)控作用。目前關(guān)于瘤胃中的褪黑素來源尚不明確，可能是反芻動(dòng)物唾液中含有褪黑素[22]，在綿羊反芻、采食過程中，含有褪黑素的部分唾液進(jìn)入了瘤胃。

綿羊攝入不同水平的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后，十二指腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸含量增加，表明綿羊攝入的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸在瘤胃蠕動(dòng)、擠壓和腸道消化酶的作用下釋放。十二指腸內(nèi)容物中，5-羥色胺、N-乙酰-羥色胺含量隨瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸攝入量的增加而增加，但腸道內(nèi)容物中褪黑素含量則隨瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸攝入量的增加而降低，這也進(jìn)一步證實(shí)羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶是褪黑素合成過程中的限速酶[23]，可能由于綿羊十二指腸中pH較低[24]，腸腔中含有大量的食物抗原、共生微生物以及膽酸鹽、胰腺分泌物等營養(yǎng)因子[25]，影響了褪黑素合成過程中酶活力或表達(dá)的調(diào)節(jié)，故瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊十二指腸褪黑素合成的調(diào)節(jié)并未有顯著影響。犬口服5-羥基色氨酸(0.5 mg/kg BW)后，十二指腸內(nèi)容物中5-羥基吲哚乙酸含量在采食后0.5 h開始增加[26]。而本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組十二指腸內(nèi)容物中5-羥基吲哚乙酸含量降低，這與上述的試驗(yàn)結(jié)果有所不同，這可能是與狗、綿羊消化系統(tǒng)特點(diǎn)、采食飼糧組成和營養(yǎng)水平不同有關(guān)。

補(bǔ)喂瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后，綿羊空腸、回腸內(nèi)容物5-羥基色氨酸含量高于對(duì)照組，但試驗(yàn)Ⅰ組空腸、回腸內(nèi)容物中5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺含量低于對(duì)照組，同時(shí)，褪黑素和5-羥基吲哚乙酸含量也低于對(duì)照組。本試驗(yàn)未能夠?qū)δc道內(nèi)容物中的這幾個(gè)關(guān)鍵酶活力進(jìn)行測(cè)定。但從5-羥基色氨酸代謝為褪黑素的過程來看，5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺是褪黑素合成過程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，本試驗(yàn)的結(jié)果可能與5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的變化有關(guān)。綿羊白天時(shí)松果體中5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的活力分別為1.1、0.14 nmol/(min·mg prot)，夜晚時(shí)的活力分別為3.10、0.29 nmol/(min·mg prot)，但其他合成酶的活力并未產(chǎn)生顯著變化[23]。222 mg/kg BW瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸顯著增加了空腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺、褪黑素、5-羥基吲哚乙酸含量，可能是由于222 mg/kg BW瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸達(dá)到了調(diào)節(jié)空腸中褪黑素合成酶活力的底物含量，促進(jìn)了5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺、褪黑素、5-羥基吲哚乙酸的合成，而111 mg/kg BW瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)未空腸內(nèi)容物中褪黑素合成過程中酶活力或表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，綿羊攝入不同水平瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后，盲腸內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺含量降低，5-羥基吲哚乙酸含量增加。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因有3個(gè)方面：1)從盲腸的生理特點(diǎn)來看，盲腸是各腸段中長(zhǎng)度最短的一段[27]，本試驗(yàn)是在綿羊早上采食后6 h采集的腸道內(nèi)容物樣品，外源性的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸及其代謝產(chǎn)物可能已經(jīng)通過了該腸段；2)5-羥基色氨酸的代謝產(chǎn)物5-羥色胺具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的功能，可能促進(jìn)了腸道的蠕動(dòng)[28]，使食糜在盲腸中停留的時(shí)間縮短；3)盲腸內(nèi)容物中5-羥基吲哚乙酸含量隨瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸的攝入量增加而增加，推測(cè)盲腸內(nèi)容物中的5-羥基色氨酸增加了單胺氧化酶的活力或表達(dá)，使5-羥色胺轉(zhuǎn)化為5-羥基吲哚乙酸，而不是N-乙酰-5-羥色胺和褪黑素，但具體的原因有待于進(jìn)一步研究。

在結(jié)腸內(nèi)容物中，5-羥基色氨酸、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺、褪黑素和5-羥基吲哚乙酸均隨瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸攝入量的增加而增加，表明不同水平瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸可能調(diào)節(jié)了結(jié)腸內(nèi)容物中褪黑素合成過程中的每個(gè)步驟中酶的活力或表達(dá)。研究表明，腸道微生物可以合成褪黑素[9]。在綿羊的腸道微生物中，結(jié)腸中的微生物豐富度較高[29]，本試驗(yàn)給綿羊飼喂的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸可能為結(jié)腸微生物提供了更多的褪黑素合成底物，進(jìn)而增加了結(jié)腸內(nèi)容物中褪黑素含量。其次，本試驗(yàn)是在綿羊早上采食后6 h采集的腸道內(nèi)容物樣品，此時(shí)，十二指腸、空腸、回腸、盲腸中的食糜可能通過腸道蠕動(dòng)到達(dá)了結(jié)腸，結(jié)腸中的5-羥基色氨酸及其代謝產(chǎn)物可能來自于“上游”腸段。本試驗(yàn)添加的瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸可增加綿羊胃腸道中5-羥色胺、褪黑素含量，這2種物質(zhì)在維持胃腸道生理功能中發(fā)揮了重要的作用，但是否會(huì)影響綿羊的消化代謝值得進(jìn)一步研究。

3.3 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸對(duì)綿羊血漿中5-羥基色氨酸、褪黑素含量的影響

在本試驗(yàn)中，綿羊攝入瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸后6 h，血漿中5-羥基色氨酸、5-羥色胺含量增加，這一結(jié)果與在人[30-31]、犬[32]、綿羊[33]分別使用腹腔注射、口服攝入5-羥基色氨酸后血漿中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量增加的結(jié)果基本一致。

在本試驗(yàn)中，2個(gè)試驗(yàn)組綿羊血漿中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量增加，結(jié)合綿羊腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量的變化，綿羊血漿中5-羥色胺、褪黑素含量可能來源于綿羊胃腸道。對(duì)豬采食后24 h內(nèi)動(dòng)脈、腔靜脈、門靜脈血液中褪黑素含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腸道吸收的褪黑素再經(jīng)過肝臟代謝后，在頸靜脈中仍有較高含量的褪黑素[21]，說明腸道中的褪黑素含量可影響血液中的褪黑素含量。給切除松果體的雞飼喂色氨酸后，雞血漿中褪黑素含量也有所增加[34]，提示雞血漿中的褪黑素可能是以色氨酸為前體物質(zhì)，在腸道中褪黑素合成酶的作用下轉(zhuǎn)化而來，本試驗(yàn)結(jié)果也與該結(jié)果一致。以上研究結(jié)果說明，血漿中的褪黑素可能來源于胃腸道，且給動(dòng)物飼喂褪黑素的前體物質(zhì)可通過胃腸道吸收的方式增加血漿中褪黑素的含量。

4 結(jié) 論

① 綿羊胃腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸含量的分布特點(diǎn)是：盲腸>空腸、結(jié)腸>瘤胃液、十二指腸、回腸；褪黑素含量的分布特點(diǎn)是：十二指腸>瘤胃、空腸>回腸、盲腸>結(jié)腸。

② 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸補(bǔ)喂量為222 mg/kg BW時(shí)能提高胃腸道內(nèi)容物中5-羥基色氨酸含量，但對(duì)5-羥色胺、褪黑素含量的影響在各胃腸段表現(xiàn)不同。

③ 瘤胃保護(hù)性5-羥基色氨酸補(bǔ)喂量為111、222 mg/kg BW時(shí)均能提高綿羊血漿中5-羥基色氨酸、5-羥色胺、褪黑素含量。