降解不同牧草的瘤胃細菌群落多樣性研究

徐 俊 鄔 磊 陳慶隆 胡麗芳 侯玉潔 趙國琦 孫建勇 吳斯駿* 周瑤敏*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院，南昌330200；2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009；3.南昌市農(nóng)業(yè)科學院，南昌330008；4.新疆阿勒泰市第一牧場畜牧獸醫(yī)站，阿勒泰836500)

反芻動物瘤胃中棲息著大量細菌、真菌和原蟲等微生物，牧草纖維可在瘤胃微生物作用下降解為揮發(fā)性脂肪酸進而為機體供能，因此，深入研究纖維降解的微生物機制對于反芻動物高效利用牧草資源具有十分重要的意義。不同牧草的組織結構存在差異，其中豆科牧草(如苜蓿)主要由易降解的厚角組織、綠色組織和韌皮部組成，而禾本科牧草(如燕麥草和羊草)和稻草秸稈主要由厚壁組織、薄壁組織、維管束和韌皮部等組成，研究發(fā)現(xiàn)，微生物對細胞壁的吸附和降解與牧草組織結構及其類型密切相關[1]。在降解纖維的瘤胃微生物中，細菌在纖維降解過程中起決定性作用，尤其是與牧草緊密吸附的細菌[2]。黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens，R.flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus，R.albus)和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes，F(xiàn).succinogenes)是3種主要纖維降解菌[3-5]，有研究表明，細菌可以快速附著于黑麥草表面，且在薄壁組織和韌皮部中的細菌吸附量最多，尤其是黃色瘤胃球菌[6]。Akin等[7]通過電子顯微鏡技術發(fā)現(xiàn)降解羊茅草和鴨茅草的纖維降解菌中有70%是F.succinogenes和R.flavefaciens。Koike等[8]通過競爭性PCR研究了綿羊中3種主要纖維降解菌對鴨茅莖稈的吸附和降解情況，培養(yǎng)5 min后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).succinogenes和其他2種球菌(R.flavefaciens和R.albus)的數(shù)量可達莖稈干物質(zhì)(DM)含量的105和104個/g，24 h時F.succinogenes和R.flavefaciens的數(shù)量達到峰值，分別為莖稈DM含量的109和107個/g，而R.albus在48 h達到峰值，為莖稈DM含量的106個/g。然而，前人多集中在對幾種主要纖維降解菌數(shù)量變化的研究[9]，且研究手段多為顯微鏡技術和熒光定量PCR技術等，有關高通量測序手段對嵌在牧草細胞壁內(nèi)部的細菌群落結構多樣性的研究鮮有報道。因此，本文選擇我國奶牛場常用的苜蓿、燕麥草、羊草和稻草為研究對象，通過尼龍袋試驗，借助Miseq高通量測序技術從微生物群落結構多樣性的角度探究不同牧草中纖維降解菌的差異，為進一步深入探索飼草降解率差異形成的原因和飼糧對瘤胃菌群的形成機理提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)管理

選取3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的健康、干奶期荷斯坦奶牛[(600±15) kg]，根據(jù)NRC(2001)3倍維持需要的營養(yǎng)標準，飼喂主要由玉米、豆粕、玉米青貯和稻草秸稈組成的全混合日糧(TMR)，采集飼料樣品放入65 ℃烘箱中烘干48 h，測定初水分，然后過40目篩，測定樣品粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、有機物(OM)[10]、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)[11]含量，非纖維性碳水化合物(NFC)含量可通過計算[非纖維性碳水化合物(%)=100-(粗蛋白質(zhì)+中性洗滌纖維+粗脂肪+粗灰分)]得出。鈣(Ca)和磷(P)含量采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定[10]，飼糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示，采用拴系式飼養(yǎng)，日喂2次，自由飲水。

1.2 試驗材料

試驗選用試驗基地種植的長勢和株高相近的初花期紫花苜蓿、抽穗初期燕麥草和羊草以及收割后的稻草，從根部切割后去掉葉子和葉鞘，剝離出莖稈作為試驗材料。

1.3 試驗方法

將4種牧草樣品放入65 ℃烘箱中烘48 h，測定初水分，然后過40目篩，測定樣品粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、有機物、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，計算非纖維性碳水化合物含量。然后分別稱取3.0 g粉碎好的苜蓿、燕麥草、羊草和稻草樣品(2 mm篩)放入尼龍袋(8 cm×12 cm，網(wǎng)孔孔徑300目)中，每種牧草稱取6份，每頭牛2個重復，于晨飼前將24個尼龍袋分別投放到3頭奶牛瘤胃中，同時將尼龍繩栓在瘺管蓋上固定，降解24 h后取出所有尼龍袋，放入冰水中停止發(fā)酵，分別將相同牧草的2個重復樣品混合均勻，然后用冷水沖洗直到流出的水澄清為止，放入-80 ℃低溫冰箱(BCD-208K ACJN，青島海爾股份有限公司)保存。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1)每千克預混料含有 One kilogram of premix contained the following: VA 400 000 IU，VD 80 000 IU，VE 2 000 IU，Zn 5 000 mg，Se 40 mg，Mn 2 000 mg，F(xiàn)e 2 000 mg，Co 20 mg，Cu 1 200 mg，I 50 mg。

2)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

測樣時將牧草在冰上解凍，利用OMEGA試劑盒(M2327-02)提取總DNA，取經(jīng)液氮粉碎的植物組織放入1.5 mL滅菌離心管中，立即加入己內(nèi)酰胺(CPL)緩沖液渦旋，然后放入65 ℃水浴孵育15 min，加入氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，高速渦旋后高速離心，吸取上清液，依次加入核糖核酸酶、CXD緩沖液、無水乙醇，渦旋15 s后轉入吸附柱中離心，然后丟棄收集管和收集液，將吸附柱轉入第2個新的收集管中，加入無水乙醇稀釋、離心，再加入無水乙醇沖洗緩沖液、離心，將吸附柱轉入一個新的1.5 mL離心管中，加入預先預熱的雙蒸水孵育，離心3 min，將DNA洗脫后收集。對提取好的DNA樣品用核酸蛋白分析儀(DU640，美國Backman公司)測定260和280 nm處的吸光度值以及DNA濃度，用1%的瓊脂糖凝膠通過電泳儀(DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠)進行DNA質(zhì)量檢測。

根據(jù)細菌16S rDNA的V3區(qū)保守序列，設計通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)，PCR擴增采用25 μL反應體系：2.5 μL10×PCR Buffer，各1 μL引物(各10 μmol/L)，2 μL dNTP Mix(2.5 mmol/L)，0.125 μL DNA聚合酶(5.0 U/μL)，20 ng DNA模板，ddH2O補齊。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行21個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，結束后4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后使用Axygen DNA膠回收純化試劑盒(Axy Prep DNA Gel Extration kit，AP-GX-500)對V3區(qū)擴增產(chǎn)物進行切膠回收純化，經(jīng)Biotek酶標儀(FLX800，美國伯騰儀器有限公司)對純化好的PCR產(chǎn)物進行定量，為防止多樣品混合測序容易產(chǎn)生不均一現(xiàn)象，需按測序要求將每一個待測樣品進行等量混勻形成均一混合物，PCR混合物經(jīng)質(zhì)量控制后，采用標準的Illumina TruSeq DNA文庫制備流程構建Illumina測序文庫，最后按照Illumina Miseq平臺上機進行Barcoded Illumina Miseq測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對原始序列數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制得到有效序列，丟棄長度短于120 bp、含有模糊堿基、引物堿基含2個以上的錯配信息、單個堿基重復數(shù)超過6個的序列，獲得優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)序列相似度為97%的原則，將序列歸為多個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，并對序列進行聚類分析。

對生成的OTU信息進行細菌群落豐富度和多樣性分析，其中豐富度指數(shù)用Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)表示，多樣性指數(shù)用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。在屬水平上做聚類Heatmap圖，同時對微生物群落進行UniFrac分析，比較不同牧草間的群落差異性。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，結果采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件的PDIFF模塊進行方差分析和顯著性檢驗，以P<0.05和P<0.01作為差異顯著和極顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 牧草營養(yǎng)水平

表2所示為4種牧草的營養(yǎng)水平，結果表明不同牧草的營養(yǎng)水平存在一定的差異，4種牧草的干物質(zhì)和有機物含量相當，但是苜蓿的粗蛋白質(zhì)含量則遠遠高于燕麥草、羊草和稻草，而苜蓿的中性洗滌纖維和粗纖維含量則比禾本科的燕麥草、羊草和稻草要低。

表2 牧草營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

2.2 菌群結構豐富度和多樣性

測序后，本研究12個測試樣品共產(chǎn)生591 378條有效序列，經(jīng)質(zhì)量控制后得到562 727條高質(zhì)量序列，平均序列長度為161 bp。不同牧草降解過程中的菌群結構豐富度和多樣性結果如表3所示。物種豐富度指數(shù)Chao指數(shù)為5 603～729 3，Ace指數(shù)為7 455～9 792，各組間Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。不同牧草對物種多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，且苜蓿的Simpson指數(shù)最高，極顯著高于其他牧草(P<0.01)；羊草的Simpson指數(shù)最低，極顯著低于其他牧草(P<0.01)。這表明附著在不同牧草上的細菌多樣性不同，且羊草物種多樣性最高，苜蓿最低。各組文庫覆蓋率均在94%以上，說明每個樣品測序量合理，可以很好地反映牧草中細菌群落種類和結構多樣性。

表3 不同牧草降解過程中的菌群結構豐富度和多樣性結果

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 細菌組成和群落結構

在屬水平上，序列比對得到的91個菌屬中共有11個菌屬的相對含量大于0.1%(表4)，而其他鑒定出的菌屬相對含量均較低，這表明吸附在牧草中的細菌含有很多相對豐度較低的菌屬。在相對含量大于0.1%的菌屬中，不同牧草中均以丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和密螺旋體屬(Treponema)為優(yōu)勢菌屬，且Butyrivibrio和Prevotella所占比例較高，分別占總序列的8.88%～12.30%和7.01%～9.29%，不同牧草對上述菌屬相對含量存在極顯著影響(P<0.01)。

表4 基于細菌屬水平相對含量大于0.1%(序列所占比例)的不同牧草比較分析

2.4 組間的相似性分析

通過顏色梯度及相似程度來反映不同牧草組在各分類水平上群落組成的相似性和差異性，圖例不同顏色代表不同牧草組OTU的相對豐度比例，由圖1可知，12個樣品共分成了2大簇，每個大簇下面又有4小簇，每小簇均為同一牧草的3個樣品，這說明相同牧草3個平行樣附著的細菌群落結構十分相似，可以很好地聚在一起，而不同牧草間群落結構存在明顯差異。

WA：苜蓿 Alfalfa；WB：燕麥草 Oat hay；WC：羊草 Leymus chinensis；WD：稻草 Rice straw。

圖1屬水平下12個牧草樣品聚類分析熱圖

Fig.1 Cluster analysis heat map under genus level of 12 forage samples

在本研究中，我們利用UniFrac的加權主坐標分析(PCoA)對降解不同牧草的細菌群落結構差異進行了研究，它是通過系統(tǒng)進化距離來衡量樣品間距離，用于表征細菌群落結構的差異大小，PCoA可以將這種差異顯示在二維或三維空間的PCoA圖上，因此，圖中距離越近的點表示2個樣品的菌群結構越相似。由圖2可知，基于UniFrac的PCoA其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為52.89%和19.43%，不同牧草間細菌群落結構差異明顯，但相同牧草的3個樣品可以很好地聚在一起，菌群相似度很高。

圖2 97%相似性水平下12個牧草樣品菌群結構Unifrac的加權主坐標分析圖

通過統(tǒng)計不同牧草組中共有和獨有的OTU數(shù)目，在97%相似性水平下，4個組共產(chǎn)生8 997個OTU，如圖3所示，其中苜蓿、燕麥草、羊草和稻草中OTU數(shù)目分別為5 778、6 984、5 220和6 018，4種牧草共享了2 913個OTU，占細菌總OTU數(shù)目的32.38%，苜蓿、燕麥草、羊草和稻草中獨有的OTU數(shù)目分別為6.07%、10.61%、4.85%和6.88%，其順序為燕麥草>稻草>苜蓿>羊草。由此可見，吸附在不同牧草上的細菌共享了約1/3的OTU，且不同牧草中存在一定比例獨有的OTU。

圖3 不同牧草組細菌群落共享和獨有的OUT數(shù)目的Venn圖分析

3 討 論

序列比對后發(fā)現(xiàn)，Butyrivibrio、Prevotella、Treponema和Fibrobacter是牧草中的優(yōu)勢菌屬，這與飼喂上述4種牧草的奶牛其瘤胃液中的優(yōu)勢菌屬種類相一致[12]。盡管不同牧草的優(yōu)勢菌屬在種類上沒有差異，但不同牧草組間細菌相對含量存在顯著或極顯著差異，這主要是因為不同牧草的營養(yǎng)組分、組織結構和吸附的微生物種類不同造成的，不同微生物會對不同底物產(chǎn)生不同的響應[12-13]。Butyrivibrio是厚壁菌門(Firmicutes)中主要的纖維分解菌屬，它們在纖維分解中發(fā)揮了重要作用，研究表明Butyrivibrio可以利用纖維素、淀粉和其他多聚糖為發(fā)酵底物，且苜蓿顯著高于其他3種牧草，這可能與苜蓿中可發(fā)酵碳水化合物含量高于禾本科的燕麥草、羊草和稻草密切相關。Prevotella中擁有高活性的半纖維素分解菌[14]，并對植物非纖維多糖和蛋白質(zhì)的降解至關重要[15]，Butyrivibrio加上Prevotella在苜蓿(21.59%)中所占的比例明顯高于燕麥草(16.45%)、羊草(18.05%)和稻草(18.96%)，這可能與苜蓿中的蛋白質(zhì)和可發(fā)酵碳水化合物含量高有關，但這有待于進一步開展研究證實。盡管Ruminococcus和Fibrobacter在瘤胃中豐度低于Butyrivibrio和Prevotella，但它們在牧草纖維的降解中也發(fā)揮了重要作用。除此之外，本研究中還發(fā)現(xiàn)多達80種低豐度菌屬，盡管豐度較低，但分泌的纖維素酶活或許很高，如真桿菌屬(Eubacterium)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)和顫螺旋菌屬(Oscillibacter)等菌屬，它們在纖維降解過程中發(fā)揮著重要作用[16]。

微生物可以快速吸附于細胞壁表面，但細胞壁降解速率及其程度受微生物與底物黏附程度、飼料理化特性和瘤胃消化動力學等因素的影響[17]。對不同底物(黑麥草葉、黑麥草莖和稻草秸稈)在山羊瘤胃24 h內(nèi)微生物吸附的研究表明，吸附在不同纖維底物上的微生物在瘤胃降解前6 h無顯著差異，細菌總數(shù)在6 h后逐漸穩(wěn)定；變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜表明，底物在降解12和24 h后的微生物群落結構與降解6 h后的微生物群落結構存在顯著差異，這充分說明不同底物吸附的微生物會隨時間的不同發(fā)生改變[18]。對吸附的微生物進行克隆文庫的研究還發(fā)現(xiàn)Treponema只在苜蓿樣品中發(fā)現(xiàn)，在果園草中未發(fā)現(xiàn)[8]，然而，本研究中苜蓿等4種牧草中均能發(fā)現(xiàn)存在Treponema，該結果與果園草中的結論存在差異，這可能與本試驗中使用的牧草品種、試驗動物和飼喂飼糧等因素不同有關。研究發(fā)現(xiàn)細菌可在15 min內(nèi)快速吸附于黑麥草細胞壁中，且黃色瘤胃球菌更喜歡吸附在黑麥草葉的表皮、薄壁組織和韌皮部邊緣[19]。以羊茅草和鴨茅草為底物的研究表明，吸附在牧草中的微生物大多是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌[7, 20]，它們占細菌總數(shù)的0.1%～6.6%和1.3%～2.9%[21-23]，上述結果與本研究中禾本科草(燕麥、羊草和稻草)的瘤胃球菌屬含量均高于豆科草(苜蓿)的結果相一致，這可能與禾本科草中的纖維素含量高于苜蓿有關，研究發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬可發(fā)酵纖維素及其水解產(chǎn)物纖維二糖，而苜蓿草中的纖維素含量僅占22.65%，均低于燕麥草、羊草和稻草。定植不同底物中的微生物細菌形態(tài)相似，但微生物數(shù)量顯著不同，微生物數(shù)量在24 h時達到峰值，其中以桿球菌(Rodcocci)，雙球菌(Diplococci)和螺旋體門(Spirochaetes)含量最多[24]，這也是本研究中選擇牧草降解24 h后取出進行微生物群落結構研究分析的原因。

從不同牧草細菌群落結構相似性的研究結果表明，12個樣品在聚類分析熱圖中分為兩大簇，4組不同牧草的3個樣品又聚成小簇，由此可見，相同牧草的3個重復樣品之間的微生物降解菌的群落結構十分相似，而不同牧草之間存在明顯差異，這與細菌在屬水平上各組間存在顯著或極顯著差異的結果相一致。與此同時，同為禾本科草的燕麥草和羊草最終聚成一大簇，這說明降解禾本科草的細菌群落結構更相似，這可能與燕麥草和羊草的細胞壁結構組成和營養(yǎng)成分相似有密切關系[25-26]，由表2中可以發(fā)現(xiàn)，燕麥草和羊草的粗蛋白質(zhì)(5.89% vs. 5.54%)、中性洗滌纖維(67.58% vs. 69.25%)和粗纖維(28.14% vs. 29.36%)含量均相近，營養(yǎng)組分和細胞壁結構的相近可能是導致燕麥草和羊草中細菌群落結構相似的主要原因[12]。苜蓿和稻草聚成了一大簇，它們之間的細菌群落結構更相似，這與先前通過掃描電鏡和干物質(zhì)降解率的研究發(fā)現(xiàn)苜蓿和稻草的降解存在相似性的結論相吻合[1,27]。在考慮物種豐度的UniFrac的PCoA圖中，4組牧草樣品能夠很好地分隔開，這與聚類分析熱圖的結果相一致。

4 小 結

通過高通量測序技術對降解4種牧草中的細菌群落結構差異性研究表明，4種不同牧草在相同降解時間下附著的微生物群落結構多樣性存在明顯差異。在屬水平上，降解纖維的優(yōu)勢菌屬主要是Butyrivibrio、Prevotella、Fibrobacter和Treponema。