彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中MYD88基因突變及其臨床病理相關(guān)性分析

于寶華，薛 田，張 巖，蔣翔男，朱曉麗，李小秋

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymohoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見(jiàn)、高度惡性的一種類型。近年來(lái)雖然DLBCL的治療取得了明顯改善，但部分患者仍有較高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，深入探討其發(fā)生機(jī)制、尋找新的分子靶點(diǎn)成為亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MYD88基因在DLBCL中有一定的突變率。MYD88基因編碼蛋白為銜接蛋白，可通過(guò)Toll-like受體活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）通路從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存［1］。MYD88最常見(jiàn)的突變形式是位于Toll-like受體結(jié)構(gòu)域L265P位點(diǎn)的體細(xì)胞突變。該基因在免疫隔離部位DLBCL中的突變率較高，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）、睪丸等［2］，但不同文獻(xiàn)報(bào)道的突變率從0%～94%不等；該突變與DLBCL臨床病理特征相關(guān)性的報(bào)道也較少［3］，且在中文文獻(xiàn)中罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)121例發(fā)生在不同部位DLBCL中的MYD88基因突變進(jìn)行探討，并分析其臨床病理相關(guān)性，旨在更好地了解MYD88 L265P突變?cè)贒LBCL中的意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2017年9月—2018年6月診斷的DLBCL患者121例，所有病例均有足夠量的高質(zhì)量組織標(biāo)本可供進(jìn)一步檢測(cè)。所有患者均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的淋巴造血組織?？撇±磲t(yī)師復(fù)核、確診。通過(guò)查閱電子病例檔案及電話隨訪獲得臨床資料。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

所有標(biāo)本均經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3～4 μm連續(xù)切片，H-E染色。采用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀BenchMark XT（美國(guó)Roche公司）染色。所用一抗包括CD20、CD3、CD5、Bcl-2及Ki-67（美國(guó)Roche Ventana公司），CD10、Bcl-6及MUM1抗體（丹麥Dako公司），以及MYC抗體（英國(guó)Abcam公司）。參考試劑盒說(shuō)明書和全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀標(biāo)準(zhǔn)流程操作。根據(jù)Hans分型法將DLBCL分為生發(fā)中心樣（germinal center B-cell-like，GCB）型和non-GCB型兩組［4］。同時(shí)滿足≥40%腫瘤細(xì)胞表達(dá)MYC蛋白及≥50%腫瘤細(xì)胞表達(dá)Bcl-2蛋白者視作雙表達(dá)［5］。

1.3 MYD88基因突變檢測(cè)

經(jīng)常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋的腫瘤組織樣本制備成4～6 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇去除二甲苯和流水水化。核酸提取按照DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）說(shuō)明書進(jìn)行。提純后的核酸模板加入PCR混合液，采用PCR擴(kuò)增MYD88基因。針對(duì)L265P位點(diǎn)突變的PCR引物序列為：上游引物5’-GGGG-ATGGCTGTTGTTAA-3’，下游引物5’-GCAGGGGTTGGT-GTAGTC-3’。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR純化試劑盒（QIA quick PCR purification kit，德國(guó)Qiagen公司）純化后，在ABI3730XL測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）上進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。具體操作參考儀器及配套試劑盒說(shuō)明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相應(yīng)的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)、Pearson檢驗(yàn)及Spearman檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MYD88突變及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性

121例DLBCL患者中，38例檢測(cè)到MYD88 L265P位點(diǎn)突變，突變率為31.4%（圖1）。MYD88突變患者中，男性50例，女性71例，男女比例為1.0∶1.4。年齡17～85歲，平均58.1歲（中位年齡60歲）。年齡≥60歲組MYD88突變率為40.3%（25/62），顯著高于＜60歲患者組（13/59，22.0%）（P=0.030）。男性患者中該基因突變率（17/50，34.0%）與女性患者中的突變率（21/71，29.6%）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.609，表1）。

本組患者中20例發(fā)生在結(jié)內(nèi)，98例發(fā)生在結(jié)外，其余3例原發(fā)灶不明。MYD88突變主要發(fā)生在結(jié)外部位，包括乳腺12例（12/13，92.3%）、男性生殖系統(tǒng)10例（10/11，90.9%；其中睪丸9/10，前列腺1/1）、女性生殖系統(tǒng)5例（5/6，83.3%；其中卵巢2/2、宮頸3/3、子宮體0/1）、CNS 4例（4/6，66.7%）、淋巴結(jié)2例（2/20，10%）、皮膚1例（1/2，50%）、口咽環(huán)1例（8.3%，其中口咽部1/3、扁桃體0/9）、腹膜后1例（1/1，100%）、鼻腔1例（1/2，50%）和原發(fā)不明1例（1/3，33.3%）。其余部位未檢測(cè)到MYD88突變，包括胃腸道（0/25）、脾（0/3）、縱隔及肺（0/6）、鼻咽（0/2）、腎上腺（0/1）、外陰及陰道（0/2）、眼眶（0/2）和骨及軟組織（0/4）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，MYD88基因突變與患者的發(fā)病部位顯著相關(guān)，結(jié)外者（35/98，35.7%）顯著高于結(jié)內(nèi)者（2/20，10%）（P=0.024，表1）。

2.2 MYD88突變與病理參數(shù)的相關(guān)性

本組患者形態(tài)均為DLBCL，非特指性（圖2）。118例有分型信息的患者中，55例為GCB型，63例為non-GCB型。Non-GCB型DLBCL患者中，MYD88突變率為39.7%（25/63），顯著高于GCB型（10/55，18.2%）（P=0.010）。發(fā)生于結(jié)外的DLBCL患者中，MYD88基因在non-GCB型中的突變率為47.1%（24/51），顯著高于GCB型（8/44，18.2%）（P=0.003）；而結(jié)內(nèi)DLBCL患者中，MYD88基因突變與免疫分型沒(méi)有顯著相關(guān)性（P=0.776，表1）。

Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性組中MYD88突變率為39.0%（30/77），Bcl-2陰性組中為12.5%（5/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。Bcl-2/MYC蛋白雙表達(dá)組中MYD88突變率（19/46，41.3%）顯著高于非雙表達(dá)組（16/70，22.9%）（P=0.034，表1）。Ki-67增殖活性與MYD88基因突變顯著相關(guān)，高增殖活性組（Ki-67指數(shù)≥80%）中MYD88突變率高達(dá)38.8%（33/85），而低增殖活性組中僅為6.3%（2/32）（P＜0.001）。但該基因突變與MYC蛋白及CD5表達(dá)均無(wú)相關(guān)性（P=0.581，P=0.759，表1）。

圖 1 MYD88 L265P位點(diǎn)突變Fig.1 MYD88 L265P mutation in DLBCLA CTG (leucine) codon was changed to a CCG (proline) codon (arrow)

表 1 121例DLBCL患者中MYD88 L265P突變與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab. 1 The correlation between MYD88 L265P mutation and clinicopathological parameters in 121 cases of DLBCL[n (%)]

圖 2 1例有MYD88 L265P突變的宮頸原發(fā)DLBCL，同時(shí)伴有MYC/Bcl2雙表達(dá)Fig. 2 A representative case of primary cervical DLBCL harboring MYD88 L265P mutation and MYC/Bcl2 doubleexpressionA: Large atypical lymphoid cells were diusely infiltrated (H-E, ×400).B and C: Immunohistochemical stainings for both MYC (B) and Bcl2 protein (C) were positive (EnVision, ×400)

3 討論

DLBCL是一組臨床和生物學(xué)上均具有異質(zhì)性的腫瘤。雖然相當(dāng)一部分患者可獲得較好的療效，但仍有部分患者發(fā)生耐藥或復(fù)發(fā)。對(duì)于預(yù)后較差的患者，深入探討其分子生物學(xué)機(jī)制具有重要的臨床意義。近來(lái)有學(xué)者根據(jù)DLBCL基因型、表觀遺傳學(xué)及臨床特征的不同將其分為4型，其中一型（MCD型）以MYD88和CD79B基因突變?yōu)橹饕卣?，提示MYD88基因突變?cè)贒LBCL發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后評(píng)估中可能具有重要作用［6］。既往文獻(xiàn)報(bào)道，MYD88基因在DLBCL中的突變率有較大差異（0%～90%），該差異可能與患者選擇、所用檢測(cè)技術(shù)不同以及是否僅檢測(cè)L265P突變還是檢測(cè)外顯子3～5所有突變有關(guān)［7-8］。Lee等［3］通過(guò)Meta分析表明，2 736例DLBCL患者中，該基因突變率約29.0%。

DLBCL中MYD88基因突變與發(fā)病部位顯著相關(guān)，尤其好發(fā)于免疫隔離部位如CNS及睪丸等，另外乳腺、女性生殖系統(tǒng)及原發(fā)皮膚者也有較高的突變率［3，9-10］。本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道大致相似，女性生殖系統(tǒng)、睪丸、乳腺及CNS均顯示較高的突變率（66.7%～92.3%）。Zheng等［8］認(rèn)為，CNS中高突變率可能與腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境相關(guān)。具有MYD88突變的DLBCL患者可能在其外周血單核細(xì)胞中也有低頻的相同突變，提示MYD88突變陽(yáng)性的癌前細(xì)胞可能起源于CNS之外，并且在經(jīng)過(guò)適應(yīng)CNS環(huán)境的額外基因異常打擊之后發(fā)展成CNS淋巴瘤［8］。原發(fā)淋巴結(jié)內(nèi)DLBCL中該基因突變率非常低，文獻(xiàn)報(bào)道為0%～38%（中位值為10%），本研究結(jié)果（10%）在該范圍內(nèi)［3，11］。大部分文獻(xiàn)報(bào)道胃腸道DLBCL中MYD88基因罕見(jiàn)或無(wú)突變［7，12］，但個(gè)別文獻(xiàn)也曾報(bào)道有較高的突變率（11%）［2］；本組數(shù)據(jù)中，25例胃腸道DLBCL中均未檢測(cè)到突變，與大部分文獻(xiàn)報(bào)道相似。另外，縱隔、脾臟等部位突變情況均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本組患者中均未檢出突變；但由于病例數(shù)較少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。MYD88基因突變?cè)诓煌课籇LBCL中的差異提示這些部位的DLBCL可能具有不同的發(fā)病機(jī)制，至少一定程度上與組織微環(huán)境相關(guān)［13］。

早在2011年，Ngo等［1］首次報(bào)道MYD88 L265P突變?cè)诨罨疊細(xì)胞樣（activated B-cell -like，ABC）型DLBCL中高達(dá)29%，而在其他亞型DLBCL中非常罕見(jiàn)。該突變可導(dǎo)致IRAK4激酶活化、IRAK1磷酸化、NF-κB通路及JAK/STAT3通路活化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存，提示MYD88信號(hào)通路可能是ABC型DLBCL發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中不可或缺的重要因素［1］。隨后多數(shù)研究證實(shí)，MYD88突變與DLBCL分子分型呈顯著相關(guān)，但陽(yáng)性率報(bào)道不一，在ABC型DLBCL中突變率為21.6%～31.2%，而在GCB型中突變率主要集中在6.0%～9.7%范圍內(nèi)［2］。本研究結(jié)果顯示，non-GCB型DLBCL中MYD88突變高于GCB亞型，與大部分文獻(xiàn)報(bào)道相似，尤其是在結(jié)外DLBCL中；GCB型DLBCL中MYD88突變率為18.2%，高于既往多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，但與Rovira等［7］的結(jié)果（18%）相似。

MYD88與DLBCL中MYC、Bcl-2蛋白表達(dá)關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道極少。Rovira等［7］報(bào)道MYD88突變型DLBCL中MYC/Bcl-2雙表達(dá)率顯著低于野生型，而Dubois等［14］認(rèn)為ABC型DLBCL中MYC/Bcl-2蛋白雙表達(dá)及MYC單一基因表達(dá)與MYD88突變均不相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MYD88突變型中MYC/Bcl-2雙表達(dá)率（54.3%）顯著高于野生型（33.3%）。該結(jié)果雖然與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不符，但與MYC/Bcl-2雙表達(dá)者常見(jiàn)于ABC亞型且預(yù)后較差等相一致［15-16］。另外，本研究結(jié)果顯示，單一Bcl-2蛋白表達(dá)也與MYD88基因突變顯著相關(guān)，而單一MYC蛋白表達(dá)與該基因突變并無(wú)相關(guān)性。Dubois等［14］曾報(bào)道ABC型DLBCL中Bcl-2過(guò)表達(dá)更多見(jiàn)于MYD88突變者中，具有MYD88突變的GCB型DLBCL也傾向于Bcl-2過(guò)表達(dá)，與本研究結(jié)果大致相符。MYD88突變與MYC、Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性及其內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究探討。

約10%的DLBCL中有CD5蛋白表達(dá)，CD5+DLBCL具有較高的臨床侵襲性和較高的CNS復(fù)發(fā)頻率［17］。Takeuchi等［17］報(bào)道40例CD5+DLBCL中MYD88突變率為33%。本組CD5+患者中該突變率為30.8%，但CD5表達(dá)并未顯示出與MYD88突變的相關(guān)性。由于本組患者中CD5+者較少，有待積累更多病例進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)于MYD88基因突變?cè)贒LBCL中預(yù)后價(jià)值的研究報(bào)道較少且存在爭(zhēng)議。部分研究認(rèn)為該基因突變與DLBCL患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性，包括原發(fā)乳腺及CNS的DLBCL［8，10，17-19］。但也有研究認(rèn)為MYD88基因突變者預(yù)后較差，并且可以作為原發(fā)皮膚DLBCL（腿型）的獨(dú)立預(yù)后因子［7，9，19］。2017版造血與淋巴組織腫瘤世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分類中也指出原發(fā)皮膚DLBCL（腿型）中MYD88突變與預(yù)后差相關(guān)［5］。本組患者隨訪時(shí)間較短，需要積累更多病例并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步分析MYD88突變與DLBCL患者預(yù)后的相關(guān)性。

MYD88突變型DLBCL可能對(duì)抑制NF-κB或JAK/STAT通路的靶向藥物具有較高的敏感性，目前正在研究中的藥物包括布魯頓酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）和PI3K抑制劑，具有MYD88突變的ABC型DLBCL患者對(duì)BTK選擇性抑制劑依魯替尼反應(yīng)較好［20］。因此，MYD88突變狀態(tài)可能是一項(xiàng)較好的DLBCL患者治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素［3，7］。

綜上所述，MYD88 L265P突變好發(fā)于年齡≥60歲、ABC（non-GCB）起源及特殊結(jié)外部位（包括乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等）的DLBCL，并且具有較高的增殖指數(shù)及MYC/Bcl-2蛋白雙陽(yáng)性率；其預(yù)后價(jià)值有待積累更多病例進(jìn)一步分析。MYD88基因突變有望為揭示DLBCL發(fā)病機(jī)制、靶向治療提供理論依據(jù)，并且可能成為靶向治療反應(yīng)的有效預(yù)測(cè)因子。