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    南寧市1 027例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析

    2020-06-08 10:38:37廖旺李筱瑜王宗杰黃衛(wèi)彤
    關(guān)鍵詞:新生兒

    廖旺 李筱瑜 王宗杰 黃衛(wèi)彤

    【摘要】 目的:探討GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA四個(gè)耳聾基因在南寧市新生兒耳聾基因檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法:隨機(jī)選取2016年1月-2018年12月南寧市新生兒疾病篩查中心1 027例新生兒足跟血濾紙片,并提取DNA,應(yīng)用測(cè)序法檢測(cè)耳聾基因突變位點(diǎn),包括GJB2(c.35del G、c.176-191del16、c.235delC、c.299-300del AT、c.109G>A、c.11 G>A)、GJB3(c.538C>T)、SLC26A4(IVS 7-2A>G、c.2168A>G)和線粒體12SrRNA(1555A>G、1494C>T)共11個(gè)突變位點(diǎn)。結(jié)果:1 027例新生兒中檢出耳聾基因的突變者183例,占17.82%,其中GJB2基因突變176例,占17.14%,其中純合子突變23例(c.235del C 1例,c.109G>A 22例),占2.24%;雜合子突變153例(c.235del C 10例,c.299-300del AT 1例,c.109G>A 138例,c.11 G>A 4例),占14.90%。GJB3(c.538C>T)雜合子突變1例,占0.10%。SLC26A4(IVS 7-2A>G)雜合子突變3例,占0.29%。線粒體12SrRNA(1555A>G)均質(zhì)突變3例,占0.29%。本地區(qū)的GJB2和SLC26A4突變率與濟(jì)寧、東莞、珠海、紹興的突變率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:南寧市新生兒耳聾GJB2基因突變率比較高,GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變率較低。致病基因以GJB2 c.109G>A為主,通過(guò)測(cè)序方法才能檢測(cè)出基因突變位點(diǎn)比較多,有利于發(fā)現(xiàn)本區(qū)域的致病基因突變位點(diǎn)。

    【關(guān)鍵詞】 新生兒 基因檢測(cè) 突變率

    Analysis of Gene Screening Results in 1 027 Cases of Neonatal Deafness in Nanning/LIAO Wang, LI Xiaoyu, WANG Zongjie, HUANG Weitong. //Medical Innovation of China, 2020, 17(11): 0-073

    [Abstract] Objective: To explore the application value of GJB2, GJB3, SLC26A4 and mitochondrial 12SrRNA in the detection of deafness genes in newborn infants in Nanning. Method: 1 027 cases of neonatal heel blood from nanning neonatal disease screening center from January 2016 to December 2018 were randomly selected. DNA was extracted and the deafness gene mutation site was detected by sequencing, including GJB2 (C.35del G, c.176-191del16, c.235delC, c.299-300del AT, c.109G>A, c.11G>A), GJB3 (C.538C>T), SLC26A4 (IVS7-2A>G, c.2168A>G) and mitochondrial 12SrRNA (1555A>G, 1494C>T). Result: 183 cases (17.82%) of 1 027 newborns were found to have hearing loss, among which 176 cases (17.14%) had mutation of GJB2 gene. Among them,there were 23 cases (c.235del C 1 case, c.109G>A 22 cases) homozygous mutations, accounting for 2.24%; 153 cases (c.235 del C 10 cases, c.299-300del AT 1 case, c.109G>A 138 cases, c.11 G>A 4 cases) of heterozygous mutation accounted for 14.90%. 1 case (0.10%) of heterozygous mutation in GJB3 (c.538C>T); SLC26A4(IVS 7-2A>G) heterozygous mutation was found in 3 cases (0.29%). Mitochondrial 12SrRNA 1555A>G homogeneous mutation was found in 3 cases (0.29%). The mutation rates of GJB2 and SLC26A4 in this region were statistically significant compared with those of Jining, Dongguan, Zhuhai and Shaoxing (P<0.05). Conclusion: The mutation rate of GJB2 gene in newborns with deafness in Nanning is higher, while that of GJB3, SLC26A4 and mitochondrial 12SrRNA is lower. GJB2 c.109G>A is the main pathogenic gene, only by sequencing method can there be many mutation sites, which is helpful to find the mutation site of the pathogenic gene in this region.

    [Key words] Newborn Genetic testing Mutation rate

    First-authors address: Nanning Maternal and Child Health Hospital, Nanning 530011, China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2020.11.017

    在我國(guó)每年有30 000例先天性聽(tīng)力損失的嬰兒出生,在語(yǔ)前聾患者中,60%為遺傳性耳聾,自從1997年Kelsell發(fā)現(xiàn)第一個(gè)人類耳聾基因,先天性聾作為遺傳疾病已越來(lái)越清楚,至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了接近145個(gè)耳聾基因[1]。由于耳聾基因檢測(cè)技術(shù)的廣泛使用,檢測(cè)時(shí)間也越來(lái)越快,耳聾基因檢測(cè)將會(huì)變得越來(lái)越普遍,這對(duì)我國(guó)實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育,提高人口質(zhì)量提供了很大幫助。本研究主要采用測(cè)序方法對(duì)2016年1月-2018年12月南寧市新生兒疾病篩查中心1 027例新生兒足跟血濾紙片進(jìn)行基因檢測(cè)分析,旨在了解南寧市新生兒耳聾基因突變情況,為新生兒篩查提供遺傳咨詢提供依據(jù)。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 對(duì)象 隨機(jī)選取2016年1月-2018年12月南寧市新生兒疾病篩查中心1 027例新生兒的足跟血濾紙片,對(duì)其耳聾基因包括GJB2(c.35del G、c.176-191del 16、c.235del C、c.299-300del AT、c.109G>A、c.11 G>A)、GJB3(c.538C>T)、SLC26A4(IVS 7-2A>G、c.2168A>G)和線粒體12SrRNA(c.1555A>G、c.1494C>T)共11個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)廣西全民健康信息平臺(tái)查看新生兒基本信息、聽(tīng)力初篩、聽(tīng)力損失確診等資料并跟蹤隨訪。

    1.2 試劑和儀器 (1)試劑盒:DNA提取試劑為北京天根生化科技有限公司,測(cè)序試劑為TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2(寶日生物技術(shù)工程有限公司)。(2)主要儀器:基因擴(kuò)增儀(ABI 2720)、熒光定量PCR儀(ABI 7500)、測(cè)序儀(Miniseq)。

    1.3 DNA提取方法 用血片打孔器將血斑打孔得到6 mm直徑的干血斑,經(jīng)萃取后,用全血基因組DNA提取試劑提取DNA,用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度,其最低工作濃度應(yīng)≥5 ng/μL。

    1.4 GJB2基因測(cè)序方法 (1)文庫(kù)構(gòu)建:PCR擴(kuò)增。(2)文庫(kù)純化。(3)文庫(kù)質(zhì)檢:參照KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms TDS對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量。(4)測(cè)序:將文庫(kù)pooling變性最終以1.8pM的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。(5)數(shù)據(jù)分析方法:采用fastQC對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,移除接頭污染以及平均質(zhì)量值低于20測(cè)序數(shù)據(jù),對(duì)于總數(shù)據(jù)量低于1.2M的樣品或者平均測(cè)序深度低100X的樣品予以重新測(cè)序。運(yùn)用bwa軟件的mem模型將測(cè)序數(shù)據(jù)與人數(shù)參考基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)后,通過(guò)Picard和GATK等軟件對(duì)樣品的SNV和indel進(jìn)行檢測(cè),檢出的基因突變采用snpEff軟件進(jìn)行基因注釋和功能,通過(guò)SnpSift軟件和dbNSFP3數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。(6)生物信息學(xué)分析:利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn);利用Snpeff工具注釋SNP,最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD等數(shù)據(jù)庫(kù)、clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋和比較分析。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較采用字2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 1 027例新生兒4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因中11個(gè)突變位點(diǎn)情況 1 027例新生兒耳聾基因突變183例,占17.82%,其中GJB2基因突變176例,占17.14%,其中純合子突變23例(c.235del C 1例,c.109G>A 22例),占2.24%,經(jīng)過(guò)廣西全民健康信息平臺(tái)查看新生兒基本信息、聽(tīng)力初篩等資料證實(shí)該23例(c.235del C 1例,c.109G>A 22例)純合突變均為致聾基因。雜合子突變153例(c.235del C 10例,c.299-300del AT 1例,c.109G>A 138例,c.11 G>A 4例),占14.90%。GJB3(538C>T)雜合子突變

    1例,占0.10%。SLC26A4(IVS 7-2A>G)雜合子突變3例,占0.29%。線粒體12SrRNA(c.1555A>G)均質(zhì)突變3例,占0.29%。c.35del G、c.176-191del 16、c.2168A>G和c.1494C>T位點(diǎn)未檢出。見(jiàn)表1。

    2.2 4個(gè)耳聾基因突變率與其他地區(qū)在2013-2017年的突變率比較 本地區(qū)的GJB2和SLC26A4突變率與濟(jì)寧、東莞、珠海、紹興的突變率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

    3 討論

    本研究表1顯示,南寧市新生兒耳聾基因突變以GJB2基因突變?yōu)橹?,突變位點(diǎn)c.109G>A最多,其次是c.235del C突變、c.11 G>A、c.299-300del AT,未見(jiàn)c.35del G、c.176del16突變。表2中顯示本地區(qū)的GJB2和SLC26A4突變率與濟(jì)寧、東莞、珠海、紹興市的突變率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明本地區(qū)的GJB2突變率比這四個(gè)地方的突變率明顯偏高,而SLC26A4突變率比這四個(gè)地方的明顯偏低。高儒真等[6]在北京市23 836例新生兒GJB2基因篩查及聽(tīng)力隨訪的意義的研究中報(bào)道主要以c.235del C突變?yōu)橹?,?例c.35del G雜合子突變。李振安等[7]在佛山市40 672例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析中也是以c.235del C突變?yōu)橹?,但未?jiàn)c.35del G突變。GJB2基因的突變類型具有種族特異性,c.35del G是北歐、土耳其、美國(guó)等人群中最常見(jiàn)的突變[8]。趙富倫等[9]對(duì)黔西南州少數(shù)民族地區(qū)7 074例新生兒耳聾基因篩查中,該地區(qū)主要以c.235del C、IVS 7-2A>、c.299-300del AT、538C>T基因突變?yōu)橹?。說(shuō)明不同區(qū)域人群致聾突變位點(diǎn)有區(qū)域性差別。王美蘭等[10]和孫菲菲等[11]對(duì)耳聾基因位點(diǎn)109G>A的研究中都表明該基因位點(diǎn)會(huì)引起聽(tīng)力損傷。本研究經(jīng)過(guò)廣西全民健康信息平臺(tái)查看新生兒基本信息、聽(tīng)力初篩等資料證實(shí)該23例(c.235del C l例,c.109G>A 22例)純合突變均引起了新生兒耳聾。因此說(shuō)明c.235del C和c.109G>A位點(diǎn)純合突變?cè)诒镜貐^(qū)屬于致聾基因位點(diǎn),此位點(diǎn)突變?cè)诙@基因篩查中有著重要的意義。

    GJB3突變可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征耳聾,與高頻聽(tīng)力下降有關(guān)[3]。阮宇等[12]在北京地區(qū)75 649例新生兒耳聾基因篩查及確診者隨訪結(jié)果分析中耳聾基因突變主要以GJB2基因、SLC26A4、c.235del C和c.919-2A>G為主,孫詩(shī)雨等[13]在膠東地區(qū)非綜合征型耳聾患者研究中分別以GJB2 c.235del C、SLC26A4 c.IVS7-2A>G為主,本地區(qū)以GJB2 c.109G>A為主,GJB3 c.538C>T突變僅為1/1 027(0.10%),由此可見(jiàn)本地區(qū)由GJB3突變c.538C>T引起新生兒耳聾發(fā)病的概率很低,這也說(shuō)明了各地區(qū)耳聾基因突變位點(diǎn)各有不同,但由GJB3基因突引起的耳聾都非常低。GJB3基因538C>T突變的新生兒雖然聽(tīng)力篩查正常,但可能出現(xiàn)后天聽(tīng)力下降,仍需高度重視并定期跟蹤隨訪[14]。

    SLC26A4基因又稱PDS基因,位于人類染色體7q31,編碼含有780個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成,是一種跨膜蛋白。SLC26A4基因某一位點(diǎn)的突變導(dǎo)致Pendrin功能障礙,引起Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)障礙或耳內(nèi)淋巴液流動(dòng)異常,引起前庭水管擴(kuò)大(enlarged vestibular aqueduct,EVA)和內(nèi)淋巴管內(nèi)壓升高,內(nèi)耳毛細(xì)胞受損和聽(tīng)神經(jīng)萎縮,從而導(dǎo)致聽(tīng)力下降[1]。本研究1 027例新生兒中SLC26A4突變以IVS 7-2A>G雜合突變?yōu)橹?,?.29%(3/1 027),未見(jiàn)c.2168A>G 位點(diǎn)突變。SLC26A4基因突變攜帶率比濟(jì)寧、東莞、珠海、紹興市這四個(gè)地區(qū)的攜帶率明顯偏低。錢根才等[15]在浙江省長(zhǎng)興縣2 108例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析中報(bào)道該地區(qū)基因突變中以GJB2突變?yōu)橹?,其次為SLC26A4基因突變。劉璟等[1]在大連地區(qū)語(yǔ)前聾患者與耳聾高危人群中的檢測(cè)分析研究中,語(yǔ)前聾患者IVS 7-2A>G突變攜帶率為18.57%(143/770),SLC26A4基因被認(rèn)為僅次于GJB2突變引起遺傳性感音神經(jīng)性聾的遺傳學(xué)病因[16],說(shuō)明南寧市新生兒耳聾基因中以IVS 7-2A>G突變發(fā)生率比其他地區(qū)少。

    氨基糖苷類抗生素毒性耳聾與線粒體12SrRNA基因突變密切相關(guān),部分患者對(duì)氨基糖苷類抗生素有易感性,對(duì)線粒體12SrRNA基因突變新生兒禁止使用耳毒性藥物[17]。因此,新生兒篩查線粒體12SrRNA基因突變,可預(yù)防藥物性耳聾的發(fā)生。攜帶線粒體12SrRNA 1555A>G突變的個(gè)體在世界范圍內(nèi)均有發(fā)現(xiàn),但存在一定的地域偏向,以亞洲人群為主,其中中國(guó)人群占世界總?cè)藬?shù)的72.6%,(1 736/2 390)(在亞洲人群中則占85.3%),亞洲以外的其他國(guó)家對(duì)線粒體12SrRNA 1555A>G突變報(bào)道的較少,占14.9%(355/2 390)[18]。本研究顯示南寧市新生兒線粒體12SrRNA 1555A>G突變攜帶率僅為0.29%,未見(jiàn)c.1494C>T位點(diǎn)突變。線粒體12SrRNA基因突變攜帶率與濟(jì)寧、東莞、珠海、紹興市比較無(wú)明顯差別。據(jù)報(bào)道12SrRNA基因突變的患者約有50%為先天性耳聾,其余50%為耳毒性抗生素誘發(fā),發(fā)病期的平均年齡為5歲[19]。所以攜帶12SrRNA基因的患者很容易因藥物的影響,而引起聽(tīng)力損傷,甚至耳聾,因此值得高度重視。

    綜上所述,本地區(qū)新生兒耳聾基因攜帶以GJB2基因突變?yōu)橹?,其?09G>A位點(diǎn)純合突變是引起本地區(qū)新生兒聽(tīng)力受損的主要耳聾基因之一。由于基因芯片法檢測(cè)不出GJB2基因中109G>A、11G>A兩個(gè)位點(diǎn),而測(cè)序法除了能夠檢測(cè)出和基因芯片法一致的基因位點(diǎn)外,還能檢測(cè)出此兩個(gè)位點(diǎn),說(shuō)明測(cè)序法比基因芯片法在耳聾基因檢測(cè)方面更全面,能為臨床提供更多的診斷依據(jù),所以測(cè)序法比基因芯片法更適合用于臨床篩查耳聾基因。新生兒耳聾基因和聽(tīng)力聯(lián)合篩查可以有效地提高聽(tīng)力障礙及高危兒的檢出率[20]。所以有了好的檢測(cè)方法還需要與聽(tīng)力篩查相結(jié)合,這樣才能更好地幫助臨床醫(yī)生做出臨床診斷和干預(yù)措施。

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    (收稿日期:2020-02-08) (本文編輯:張爽)

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