PLK4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

蔣浩海，肖 鋒，顧春燕，周林森，高一飛，穆向明

1.鹽城市第一人民醫(yī)院普外科，江蘇 鹽城 224001；

2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226006

Polo樣蛋白激酶4（Polo-like kinases 4，PLK4）是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Polo樣蛋白激酶家族，但在結(jié)構(gòu)上與該家族其他成員有所不同，主要參與調(diào)控中心體的復(fù)制進(jìn)程［1］，過表達(dá)PLK4能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中心體擴(kuò)大、染色體不穩(wěn)定及腫瘤侵襲性增強(qiáng)［2-3］。PLK4在人結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）組織中的表達(dá)情況還缺乏相關(guān)研究。本研究旨在明確PLK4 mRNA和蛋白在CRC中的表達(dá)狀態(tài)，與CRC臨床病理指標(biāo)是否存在相關(guān)性，以及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院2012年1月—2015年12月經(jīng)手術(shù)切除的CRC患者標(biāo)本129例；均經(jīng)患者知情同意，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。組織常規(guī)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋。取上述129例CRC患者中的19例癌組織及相應(yīng)癌旁組織新鮮標(biāo)本，液氮凍存?zhèn)溆?。本組CRC患者年齡31～89歲；其中男性86例，女性43例。術(shù)后通過電話隨訪本組患者至2017年8月，隨訪時(shí)間3～66個(gè)月，129例患者中共113例成功隨訪，16例失訪，隨訪頻率為2～3個(gè)月/次。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，PLK4、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，兔抗人PLK4多克隆抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗及免疫組織化學(xué)試劑盒購自基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)

按TRIzol說明書抽提組織總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度并定量，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。PLK4上游引物5’-AATCAAGCACTCTCCAATC-3’，下游引物5’-TGTGTCCTTCTGCAAATC-3’；GAPDH上游引物5’-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3’，下游引物5’-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3’。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色采用Envision二步法，參照試劑盒說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定12 h，常規(guī)組織學(xué)方法處理，4 μm厚連續(xù)切片，設(shè)陽性和陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用“雙盲”法進(jìn)行評(píng)定。采用半定量積分法對(duì)癌細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。將染色強(qiáng)度分為4級(jí)：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占的百分比：每張切片在400倍放大光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞陽性率，無陽性細(xì)胞為0分，1%～10%陽性細(xì)胞為1分，11%～50%陽性細(xì)胞為2分，51%～80%陽性細(xì)胞為3分，81%～100%為4分。將兩組評(píng)分相乘所得值，分為2個(gè)等級(jí)：0～6分為低表達(dá)組；7～12分為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用x±s 表示，率的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)；免疫組織化學(xué)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)分析，各組之間比較采用Spearman秩相關(guān)分析；對(duì)隨訪資料用Log-rank檢驗(yàn)并繪制Kaplan-Meier生存曲線，應(yīng)用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估對(duì)生存影響的獨(dú)立因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK4 mRNA在CRC組織、癌旁組織中的表達(dá)

PLK4 mRNA在CRC組織中表達(dá)較高，在癌旁組織中表達(dá)較低（圖1）。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，CRC組織中PLK4的相對(duì)表達(dá)量為1.60±0.78，顯著高于癌旁組織（0.85±0.29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖 1 RTFQ-PCR顯示PLK4 mRNA在19例CRC組織中的表達(dá)高于癌旁組織Fig. 1 RTFQ-PCR showed that the expression of PLK4 mRNA in 19 cases of CRC tissues was higher than that in adjacent normaltissues***: P＜0.01, CRC tissues compared with paracancerous normal tissues

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)PLK4蛋白在腸癌組織中的水平及細(xì)胞定位

運(yùn)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步檢測(cè)PLK4蛋白在129例CRC組織中的水平，結(jié)果顯示，PLK4蛋白陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核（圖2）。PLK4蛋白在129例CRC組織中低度陽性62例，高度陽性67例；PLK4蛋白在CRC組織中的水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，表1）。

圖 2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)PLK4在CRC組織中的水平和定位（Envision二步法）Fig. 2 Immunohistochemical analysis of PLK4 expression andlocalization in CRC tissues (Envision two step method)A: PLK4 was detected in the cytoplasm and part of nuclei in CRC cells,staining displayed high expression level (×50); B: Local amplification of graph A (×200); C: PLK4 staining displayed low expression level(×50); D: Local amplification of graph C (×200). It was found that the expression of PLK4 in poorly differentiated CRC (upper right) was higher than that in moderately dierentiated CRC (lower left)

表 1 PLK4蛋白在CRC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的水平Tab. 1 Expression of PLK4 protein in CRC tissues and adjacent normal tissues

2.3 PLK4表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系

PLK4蛋白水平與CRC分化程度（P=0.001 1）、N分期（P=0.000 0）、M分期（P=0.035 8）和TNM分期（P=0.000 0）呈正相關(guān)。PLK4水平與CRC患者年齡、性別、大小、部位及T分期均無顯著相關(guān)性（表2）。

表 2 PLK4表達(dá)與CRC臨床病理特征之間的相關(guān)性Tab. 2 Correlation of PLK4 expression with clinicopathological features of CRC patients(n)

2.4 PLK4蛋白水平與預(yù)后的關(guān)系

將CRC患者分為PLK4低表達(dá)組和高表達(dá)組，應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，PLK4低表達(dá)組中位生存時(shí)間為27個(gè)月，高表達(dá)組中位生存時(shí)間為12個(gè)月，組間總生存率（overall survival，OS）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PLK4高表達(dá)組OS明顯低于PLK4低表達(dá)組（χ2=13.476，P=0.000，圖3）。應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估PLK4高表達(dá)對(duì)生存的影響，結(jié)果顯示，PLK4高表達(dá)組與低表達(dá)組的風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）為0.532（95%CI：0.213～1.327，P=0.176，表3），PLK4高表達(dá)不是CRC的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖 3 PLK4高表達(dá)組和低表達(dá)組的CRC患者生存曲線Fig. 3 Survival curve of PLK4 high expression group and PLK4low expression group in CRC patientsOS rates of patients with PLK4 high expression group is significantly lower than that of patients with PLK4 low expression group (Log-rank test, P＜0.001)

表 3 多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析CRC獨(dú)立相關(guān)因子Tab. 3 Analysis of independent correlation factors of CRC prognosis with multivariate COX proportional hazards model

3 討論

PLK4在細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用，包括參與調(diào)節(jié)中心體復(fù)制、細(xì)胞伸展、運(yùn)動(dòng)和胞質(zhì)分裂。在細(xì)胞周期G1早期，PLK4通過自身磷酸化調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制，同時(shí)通過負(fù)反饋環(huán)導(dǎo)致自身降解來限制每次循環(huán)中心體只復(fù)制1次［4-5］。在S期，PLK4通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2、CP110和PLK4下游調(diào)節(jié)分子紡錘體組裝6同源物相互作用，進(jìn)而啟動(dòng)和催化中心粒的復(fù)制和延伸［6］。然而，調(diào)控PLK4基因表達(dá)的相關(guān)因素沒有得到充分的明確。有研究結(jié)果表明，SAPK通路和P53的協(xié)同作用能抑制PLK4活性［7］，而這兩條途徑往往是在惡性腫瘤中失活的。另有研究顯示，NF-κB能調(diào)控PLK4的表達(dá)，PLK4可能是一個(gè)新的NF-κB靶基因，為進(jìn)一步的NF-κB調(diào)控中心體復(fù)制提供了一個(gè)直接的聯(lián)系［8］。

PLK4在胃癌、肝癌和乳腺癌中的表達(dá)狀態(tài)此前已有報(bào)道［2，9-10］。然而，PLK4表達(dá)狀態(tài)在不同癌癥中有所不同。PLK4在胃癌和乳腺癌中過表達(dá)，而在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平較低。也有一些報(bào)道表明，PLK4在CRC組織中高表達(dá)［11］，但在CRC中PLK4的作用還缺乏深入的研究。

本研究中，我們?nèi)嫜芯苛薖LK4 mRNA及蛋白在CRC組織中的表達(dá)狀態(tài)，并明確了PLK4表達(dá)與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及對(duì)CRC的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，結(jié)果表明，PLK4 mRNA和蛋白在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，并且與CRC組織學(xué)分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期高相關(guān)。此外，Kaplan Meier生存分析顯示，高表達(dá)PLK4的CRC患者OS低，是不利的預(yù)后因素，多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，PLK4高表達(dá)不是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果表明，PLK4可能在CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，PLK4高表達(dá)提示CRC預(yù)后差，但不是獨(dú)立預(yù)后因素。

Kazazian等［12］最新的研究結(jié)果顯示，體外癌細(xì)胞的遷移和侵襲，以及體內(nèi)的癌癥異體移植模型中腫瘤的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移都依賴于PLK4的激酶活性，PLK4表達(dá)缺失不僅可抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)性生物學(xué)行為，并且誘導(dǎo)分化差的乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)上皮表型（提示分化趨向成熟）。這與本研究關(guān)于PLK4高表達(dá)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)、PLK4在分化差的CRC組織中高表達(dá)的結(jié)果是一致的。Sredni等［13］的研究結(jié)果表明，發(fā)生于兒童的髓母細(xì)胞瘤過表達(dá)PLK4，而惡性橫紋肌樣腫瘤的瘤細(xì)胞增殖高度依賴于PLK4，進(jìn)一步的研究提示，運(yùn)用靶向小分子抑制劑抑制PLK4可能作為一種新的治療策略治療惡性橫紋肌樣腫瘤和其他胚胎腦腫瘤［14］。靶向抑制CRC中PLK4的表達(dá)能否作為新的治療方式有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PLK4在CRC組織中高表達(dá)，可能參與CRC的侵襲、轉(zhuǎn)移過程，檢測(cè)CRC組織中PLK4的表達(dá)可以提示預(yù)后。進(jìn)一步明確PLK4在CRC中的作用機(jī)制，將有助于更深入地認(rèn)識(shí)CRC，也為臨床尋找新的治療靶點(diǎn)提供思路。