茶小綠葉蟬危害對金萱紅茶揮發(fā)性成分的影響

喬小燕，操君喜，黃華林，李波，陳棟

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

茶小綠葉蟬是茶園最為常見的茶樹害蟲，主要危害嫩梢嫩葉，新梢危害后，葉緣黃化、葉脈紅變，嚴(yán)重時(shí)枝梢紅褐焦枯[1,2]。茶樹在長期的進(jìn)化過程中，也形成一定的防御能力，茶樹葉表結(jié)構(gòu)、茶多酚和氨基酸等均可參與防御[3～6]，而且茶樹體內(nèi)次生代謝也會發(fā)生改變，產(chǎn)生具有趨避作用的揮發(fā)物，如β-羅勒烯、芳樟醇、香葉醇、β-紫羅酮和橙花叔醇等成分[7～9]。因此，在防御和抵抗害蟲的過程中，茶樹初生代謝和次生代謝均發(fā)生了變化，這為危害鮮葉的再利用提供了可能。產(chǎn)于臺灣省新竹、蛾眉及苗栗縣等地茶區(qū)的東方美人茶是蟲害危害后鮮葉創(chuàng)新利用的成功典范，將茶小綠葉蟬危害的青心大葉的嫩梢嫩葉加工成烏龍茶，成品茶滋味甘醇，花蜜香濃郁，已在廣東、廣西和福建等地成功推廣應(yīng)用。

茶小綠葉蟬是廣東茶園危害最重的害蟲，在正常年份，夏、秋兩季茶葉約損失10%～15%，而重災(zāi)年份茶葉損失高達(dá)50%以上[10]。發(fā)展生態(tài)有機(jī)茶園，生產(chǎn)有機(jī)高品質(zhì)茶是當(dāng)前茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，減少或不使用農(nóng)藥成為茶葉企業(yè)的必然選擇。因此，挖掘現(xiàn)有茶樹品種的潛力，利用茶小綠葉蟬危害新梢因勢利導(dǎo)的生產(chǎn)特色茶葉，避免茶區(qū)減產(chǎn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。金萱是臺灣烏龍茶品種，加工烏龍茶滋味甘醇濃厚，奶香味濃郁，在廣東省各大茶區(qū)均有大面積種植。近年來，創(chuàng)新紅茶受到市場追捧，許多茶葉生產(chǎn)者將烏龍茶、綠茶品種改制紅茶，增加產(chǎn)品種類，以適應(yīng)市場需求。加工實(shí)驗(yàn)證明，金萱改制紅茶品質(zhì)良好[11]，若茶小綠葉蟬危害后，加工的紅茶有濃郁的熟果香或蜜香[12]。揮發(fā)性成分不僅構(gòu)成茶葉香氣，也是茶樹趨避害蟲的重要成分。因此，在茶小綠葉蟬危害對新梢影響的研究中，揮發(fā)性成分一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)，但現(xiàn)有研究主要集中于揮發(fā)性成分在趨避害蟲方面的作用[13～15]，品質(zhì)影響方面鮮有報(bào)道[16]。本研究以金萱為材料，研究茶小綠葉蟬危害對鮮葉和紅茶揮發(fā)性成分的影響，為今后茶小綠葉蟬危害茶樹綜合利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年4月在廣東省韶關(guān)市新豐縣茶垌茶場開展，在自然生長的金萱茶園中選取樹齡相同，生長環(huán)境一致的地塊。采摘金萱一芽二葉鮮葉，并將其加工成紅茶，見表1。YC0、YC1和YC2采用微波殺青固樣，參數(shù)如下：100 g鮮葉，高火殺青3～5 min，攤涼后80 ℃烘干。DF0，DF1和DF2按照工夫紅茶加工工藝加工，參數(shù)如下：鮮葉鼓風(fēng)抽濕萎凋24 h，萎凋葉含水量達(dá)到55%左右；發(fā)酵室溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為 6～7 h；烘干采用兩步法，初烘溫度為100～120 ℃；足烘溫度為80 ℃。

表1 試驗(yàn)材料一覽表Table 1 The list of experiment materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)性成分測定

揮發(fā)性成分測定采用 HS-SPME-GC-MS進(jìn)行分析，方法參照賴幸菲等[17]，并做一些調(diào)整。萃取方法：樣品粉碎后稱取10.0 g于500 mL萃取瓶中，加入100 mL沸水后密封，50 ℃水浴加熱，讓萃取瓶內(nèi)的香氣物質(zhì)達(dá)到平衡，5 min后插入萃取頭（DVB/CAR/PDMS-50/30 μm，美國Supleco公司）吸附80 min，結(jié)束后采用GC-MS進(jìn)行分析。GC條件：采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，ID×0.25 μm膜厚）；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；升溫程序：50 ℃保持 5 min，以 2 ℃/min 升至 180 ℃，保持 l min，再以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%），流速 1 mL/min；進(jìn)樣后于230 ℃解吸5 min。MS條件：電離方式為EI；離子源溫度為230 ℃；電子能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍：50～650 u；電子倍增管電壓為1800 V，總離子流強(qiáng)度為100 mA。揮發(fā)性成分根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和GC/MS標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果定性；根據(jù)離子流峰面積歸一化法計(jì)算各組分在總揮發(fā)物中的相對含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

用PAST 20.0軟件對揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分和聚類分析。消除不同指標(biāo)變量間的量綱關(guān)系，計(jì)算各變量的載荷值、特征向量和方差貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分及相對含量分析

由表2可知，在鮮葉（或萎凋葉）和紅茶中共鑒定出72種揮發(fā)性成分，主要為醇類，其次是醛類，再次是酮類和酯類，在YC0、YC1和YC2中沒檢測到雜環(huán)化合物。鮮葉（或萎凋葉）和紅茶中檢測到不同的酚類化合物，2,4-二特丁基苯酚在YC0、YC1和YC2中檢測到，而2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚則在DF0、DF1和 DF2中檢測到，2,4-二特丁基苯酚含量（1.93%～2.95%）高于 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（0.20%～0.43%）。

萜醇是醇類中主要揮發(fā)性成分，YC0在茶小綠葉蟬危害后，萜醇含量降低（YC1），萎凋24 h后降低到40.21%（YC2），紅茶含量高于YC0（56.11%）。橙花醇是萜醇的主要成分，YC0和YC1橙花醇含量在28.28%～30.86%之間，萎凋 24 h后降低到 8.68%（YC2）。脂肪醇和芳香醇在醇類中只占很小的一部分，茶小綠葉蟬危害后，含量增加（YC1），萎凋24 h后芳香醇降低（YC2），加工前后含量差異不大。YC0中萜酮、脂肪酮、酯類和碳水化合物在茶小綠葉蟬危害后含量增加（YC1），而萜烯和酸類含量降低（YC1），萎凋24 h后均有增加（YC2），紅茶中萜酮、脂肪酮和碳水化合物含量低于YC0，萜烯和酸類含量基本低于YC1。醛類在YC1和YC2中含量低于YC0，但在DF0和DF1中含量高于YC0。DF1和DF2中醇類（萜醇、脂肪醇）、酮類（萜酮、脂肪酮）、烴類和酸類含量均低于DF0。β-芳樟醇和橙花醇是萜醇的主要成分DF1(2.32%、28.05%)和DF2(5.30%、31.14%)含量低于DF0。脫氫芳樟醇則相反，DF1和DF2含量高于DF0，分別為 20.82%（DF1）和 9.60%(DF2)。酯類在 DF1和DF2中含量高于DF0，其中DF2最高，為18.19%，水楊酸甲酯是酯類中最主要的揮發(fā)性成分，從 1.63%（DF0）增加到16.86%（DF2）。

表2 金萱揮發(fā)性成分及相對含量（%）Table 2 Composition and relative contents of the volatiles of Jin xuan (%)

正己醛 Q13 C6H12O 醛類 0.28 0.33 0.44 0.70 0.49 0.61 2-苯基丁烯2-醛 Q14 C10H10O 醛類 - - - 0.38 0.39 0.21 3-甲基丁醛 Q15 C5H10O 醛類 - - - 0.26 0.18 0.14 5-甲基-2-苯基己烯-2-醛 Q16 C13H16O 醛類 - - - 0.41 0.37 0.18糠醛 Q17 C5H4O2 醛類 - - - 0.05 1.13 0.20順-2-壬烯醛 Q18 C9H16O 醛類 - - - 0.19 0.28 0.20醛類 14.51 14.24 13.10 16.29 16.12 11.57 2,3-環(huán)氧-β-紫羅酮 C13H20O2 萜酮 0.51 1.01 0.67 0.43 0.17 0.16 3,4-脫氫-β-紫羅蘭酮 C13H18O 萜酮 - - - 0.23 0.20 0.09 α-紫羅酮 C13H20O 萜酮 1.22 1.53 2.63 0.63 0.29 0.21 β-達(dá)馬烯酮 C13H18O 萜酮 - - - 0.79 0.60 1.22 β-紫羅酮 C13H20O 萜酮 2.75 4.26 3.36 2.91 1.19 0.90順-茉莉酮 C11H16O 萜酮 0.22 0.36 2.23 0.32 0.53 0.47香葉基丙酮 C13H22O 萜酮 0.99 1.30 1.46 0.74 0.54 0.38紫羅酮 C13H20O 萜酮 - - - 0.11 0.33 0.06 5,6-環(huán)氧-β-紫羅酮 C13H20O2 萜酮 0.52 0.63 1.21 - - -小計(jì) 6.19 9.09 11.57 6.15 3.86 3.47 2-庚酮 C7H14O 脂肪酮 - - - 0.07 0.17 0.11 3,5-辛二烯-2-酮 C8H12O 脂肪酮 1.04 1.76 1.43 0.32 0.65 0.27甲基庚烯酮 C8H14O 脂肪酮 1.57 2.15 3.04 0.79 0.45 0.26酮類 8.82 13.00 16.03 7.34 5.12 4.13苯甲酸甲酯 Z1 C8H8O2 酯類 - - - 0.22 0.13 0.05二氫獼猴桃內(nèi)酯 Z2 C11H16O2 酯類 1.09 1.27 1.79 0.61 0.10 0.07己酸己酯 Z3 C12H24O2 酯類 0.53 0.92 0.68 0.19 0.29 0.79水楊酸甲酯 Z4 C8H8O3 酯類 3.18 2.18 2.58 1.63 4.04 16.86順-己酸-3-己烯酯 Z5 C12H22O2 酯類 1.07 1.91 1.94 0.19 0.17 0.21乙酸香葉酯 Z6 C12H20O2 酯類 - - - 0.24 0.26 0.13棕櫚酸甲酯 Z7 C17H34O2 酯類 0.48 0.36 0.48 0.13 0.10 0.08反-丁酸-3-己烯酯 Z8 C10H18O2 酯類 0.29 1.00 0.77 - - -反-己酸-2-己烯酯 Z9 C12H22O2 酯類 0.38 0.83 0.59 - - -酯類 7.03 8.47 8.84 3.21 5.09 18.19 2-菠烯 C10H16 萜烯 - - - 0.35 1.16 0.35 D-檸檬烯 C10H16 萜烯 0.99 0.81 2.86 0.55 0.53 0.30 L-菖薄烯 C15H22 萜烯 - - - 0.24 0.28 0.23 δ-杜松烯 C15H24 萜烯 1.06 0.95 2.12 0.38 0.38 0.45順-β-羅勒烯 C10H16 萜烯 1.15 1.21 1.54 0.19 0.28 0.20小計(jì) 3.20 2.97 6.52 1.72 2.63 1.52對異丙基甲苯 C10H14 芳香烴 0.75 0.49 2.03 0.34 0.43 0.12甲苯 C7H8 芳香烴 - - - 0.67 0.45 0.12 4-乙烯基-1,2-二甲基苯 C10H12 芳香烴 0.52 0.63 1.21 - - -萘 C10H8 芳香烴 - - - 0.13 0.17 0.53 2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯 C10H14 烯烴 0.47 0.62 0.59 - - -十四烷 C14H30 烷烴 0.64 0.77 1.63 - - -

碳水化合物 2.36 2.50 5.47 1.15 1.05 0.77香葉酸 C10H16O2 酸類 1.94 1.86 1.10 2.89 2.52 0.99棕櫚酸 C16H32O2 酸類 1.92 1.02 4.30 0.19 0.08 0.06酸類 3.86 2.88 5.40 3.08 2.61 1.05 2,4-二特丁基苯酚 C14H22O 酚類 1.93 2.52 2.95 - - -2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 C15H24O 酚類 - - - 0.20 0.43 0.20酚類 1.93 2.52 2.95 0.20 0.43 0.20苯乙腈 C8H7N 雜環(huán)類 - - - 0.21 0.73 1.22 1-乙基-2-甲酰吡咯 C7H9NO 雜環(huán)類 - - - 0.61 0.96 0.22雜環(huán)類 - - - 0.82 1.69 1.44

2.2 主成分和聚類分析

圖1 金萱揮發(fā)性成分主成分（a）和聚類分析（b）Fig.1 Principal component (a) and cluster (b) analysis of the volatiles of Jin xuan

以萜醇、萜酮、酯類、醛類、萜烯、酸類和酚類等7類揮發(fā)性成分為變量進(jìn)行主成分分析，由表3可知，特征值大于1的前2個(gè)變量方差貢獻(xiàn)率為94.06%，基本可以代表7個(gè)變量的絕大部分變異信息。第一主成分PC1解釋了總變異信息的63.12%，萜醇在PC1上載荷值最高（0.9997），對 PC1貢獻(xiàn)最大，將 PC1稱之為萜醇因子；第二主成分PC2解釋了總變異信息的30.94%，酯類在PC2上載荷值最高（0.9849），對PC2貢獻(xiàn)最大，將PC2稱為酯類因子。

主成分分析顯示（圖 1A），YC0、YC1和 YC2位于縱坐標(biāo)軸PC2右側(cè)，PC1對3點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為正，且貢獻(xiàn)率差異較大，因此，萜醇因子（PC1）是引起YC0、YC1和YC2分散于坐標(biāo)軸上的主要原因。由表2可知，YC0、YC1和YC2中有低含量萜醇、高含量酯類，其中 YC0有較高含量萜醇、較低含量酯類；YC1和YC2則酯類含量基本相同，萜醇含量差異大。DF0，DF1和DF2位于縱坐標(biāo)軸PC2左側(cè)，PC1對3點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為負(fù)，但PC2對3點(diǎn)的貢獻(xiàn)率差異遠(yuǎn)大于PC1，因此，酯類因子（PC2）是引起 DF0，DF1和DF2分散于坐標(biāo)軸的主要原因。DF0，DF1和DF2含有高含量萜醇、低含量酯類，DF0，DF1和DF2中萜醇含量接近，但酯類差異大（見表2）。

結(jié)合審評結(jié)果可知（見表1），DF1香氣最佳，其萜醇含量為61.66%、酯類為5.09%。聚類結(jié)果顯示（圖1B），YC（YC0、YC1 和 YC2）、DF（DF0，DF1 和DF2）各自聚為一類，與主成分分析結(jié)果一致，在加工前后茶葉揮發(fā)性成分輪廓發(fā)生變化。

表3 主成分載荷矩陣與特征向量Table 3 Loading matrix and eigenvectors of principal components

2.3 金萱特征性揮發(fā)成分分析

由表3可知，萜醇在PC1的載荷絕對值最大，酯類和醛類在PC2上載荷絕對值較大，是影響PC1和PC2的主要揮發(fā)性成分，因此對萜醇、醛類和酯類揮發(fā)性成分分別編號，進(jìn)行主成分分析。由圖2可知，YC0、YC1和YC2，DF0，DF1和DF2分別位于坐標(biāo)軸的三個(gè)象限，香氣輪廓差異顯著，且此差異能在構(gòu)建的平面上充分展示。圖2中，每個(gè)編號對應(yīng)某一揮發(fā)性成分，距原點(diǎn)的距離基本可表示該成分對鮮葉（萎凋葉）或紅茶整體香氣輪廓的貢獻(xiàn)程度。由圖2可知，β-芳樟醇（C2）、橙花醇（C1）、順-氧化芳樟醇 II（C4）、順-氧化芳樟醇 I（C5）、香葉醇（C7）、α-萜品醇（C10）和苯乙醛（Q7）是YC0的特征性成分。YC1中苯甲醛（Q6）、順-檸檬醛（Q12）、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛（Q3）、2-甲基丁醛（Q2）和環(huán)氧芳樟醇（C6）是特征性成分，YC2中脫氫芳樟醇（C3）、4-甲基-2-苯基戊烯-2-醛（Q4）、反-橙花叔醇（C11）、反-2-反-4-庚二烯醛（Q9）、α-雪松醇（C8）、α-萜品醇（C10）、癸醛（Q10）和壬醛（Q11）為特征性成分。β-芳樟醇（C2）、橙花醇（C1）、香葉醇（C7）、橄欖醇（C12）、苯甲酸甲酯（Z1）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（Z2）和棕櫚酸甲酯（Z7）是DF0的特征性成分。DF1中水楊酸甲酯（Z4）和橙花醇（C1）是特征性成分。DF2中以順-氧化芳樟醇II（C4）、順-氧化芳樟醇I（C5）、環(huán)氧芳樟醇（C6）、橄欖醇（C12）、水楊酸甲酯（Z4）和順-己酸-3-己烯酯（Z5）為特征性成分。因此，YC0以萜醇（β-芳樟醇、橙花醇、順-氧化芳樟醇II、順-氧化芳樟醇 I、香葉醇）為主，茶小綠葉蟬危害后，萜醇減少，醛類（β-環(huán)檸檬醛、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯甲醛）增加。DF1和DF2是茶小綠葉蟬危害鮮葉加工的紅茶，其特征成分與DF0差別較大，其中DF1花蜜香濃度持久，香氣最佳，其特征成分水楊酸甲酯和橙花醇對形成花蜜香有重要作用。

圖2 金萱特征揮發(fā)性成分分析結(jié)果Fig.2 Principal component analysis of volatile flavor compounds of Jin xuan

3 結(jié)論

3.1 金萱在茶小綠葉蟬危害前或危害后，鮮葉（或萎凋葉）和紅茶主要揮發(fā)性成分均為醇類，且以萜醇為主。茶小綠葉蟬危害鮮葉后，醇類和醛類含量降低；

脂肪醇、芳香醇、萜酮、脂肪酮、酯類和烷類增加。與王敏[16]研究結(jié)果不同，王敏認(rèn)為醇類和醛類含量增加，酯類、烷類減少。加工成紅茶后，萜醇和醛類含量高于鮮葉（或萎凋葉），并有苯乙腈和 1-乙基-2-甲酰吡咯等雜環(huán)類化合物產(chǎn)生，這與前人的研究結(jié)果基本一致[11,17]。2,6-二甲基-3,7-辛二烯-二醇被認(rèn)為是茶小綠葉蟬危害后新梢產(chǎn)生的特殊揮發(fā)性成分，也是東方美人的重要醇類物質(zhì)[7,18]。在本研究中鮮葉（萎凋葉）和紅茶中并沒檢測到2,6-二甲基-3,7-辛二烯-二醇，這可能與鮮葉處理方法不同有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中鮮葉采用微波殺青后檢測其揮發(fā)性成分。

3.2 醇類、醛類、酮類、碳水化合物和酯類等5類物質(zhì)對茶葉氣味起主要作用[19,20]。茶小綠葉蟬危害前后鮮葉（或萎凋葉）和紅茶均以醇類為主，這與東方美人茶中揮發(fā)性成分基本一致（香葉醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、β-芳樟醇、反式-氧化芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ），芳樟醇系成分含量較高[21]，這可能與東方美人加工偏重發(fā)酵（發(fā)酵程度可達(dá)70%）有關(guān)[22]，因而在香氣組成上與紅茶類似。萜醇和酯類對區(qū)分茶小綠葉蟬危害的鮮葉及其紅茶有重要意義，未受到危害的鮮葉中萜醇（β-芳樟醇、橙花醇、順-氧化芳樟醇II、順-氧化芳樟醇 I、香葉醇、α-萜品醇）為主，茶小綠葉蟬危害后，萜醇減少，醛類（β-環(huán)檸檬醛、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯甲醛）。紅茶中酯類和萜醇類特征性成分差異較大，形成不同香氣特征。