氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜結(jié)合聚類分析在薄荷香精風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)定性分析中的應(yīng)用

陸智

（無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510665）

薄荷，唇形科芳香作物，其主要成分包括揮發(fā)油、黃酮和酚類等[1,2]，具有抗菌、抗炎和抗氧化等作用[3～5]，常以薄荷香精的形式添加到產(chǎn)品中。薄荷香精具有純正的薄荷風(fēng)味，涼感強(qiáng)勁，香氣清新透澈，廣泛應(yīng)用于牙膏、飲料、糕點(diǎn)、日用化妝品和煙酒等產(chǎn)品[6～10]。薄荷香精是一種較為復(fù)雜的化學(xué)體系，分為天然薄荷香精和人工合成薄荷香精。天然香精比較昂貴且不易獲得，普遍被人工合成香精代替。

為了對(duì)薄荷香精的質(zhì)量以及其在加香產(chǎn)品中添加量等指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確控制，需要對(duì)其成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，并需對(duì)批次間樣品的風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。目前對(duì)香精質(zhì)量控制主要依靠品香師的經(jīng)驗(yàn)和簡單的理化指標(biāo)，信息量少，無法達(dá)到準(zhǔn)確控制目的。薄荷香精中的揮發(fā)性成分是薄荷香精的主要成分，故可用作薄荷香精質(zhì)量控制的靶標(biāo)物質(zhì)。常用的香精中揮發(fā)性成分的檢測方法有氣相色譜[11～13]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[14～17]等。馬永昆等[18]人利用 GC-MS 方法檢測天然蘋果香精中乙酸乙酯等11種特征香氣成分；綦艷梅[21]等人采用同時(shí)蒸餾萃取法結(jié)合GC-MS分鑒定出牛肉香精中 64種揮發(fā)性香氣成分；劉更濤[22]利用GC-MS檢測了牡丹香精中22種化學(xué)成分。常用的香精中揮發(fā)性成分的提取方法有頂空固相微萃取、溶劑萃取、超臨界液體萃取等[19,20]；但是這些提取方法比較耗時(shí)且樣品消耗量大，現(xiàn)普遍探索滿足于儀器分析條件的直接進(jìn)樣方式，簡便快捷，且能更好地反映香精成分的真實(shí)情況。香精風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)定性可利用揮發(fā)性成分指紋圖譜的共有峰率和相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并可利用主成分分析和聚類分析等方法做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

本研究擬采用GC-MS結(jié)合內(nèi)標(biāo)法分析薄荷香精中主要揮發(fā)性成分，通過組分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及相似度等指標(biāo)評(píng)價(jià)5個(gè)不同批次薄荷香精的一致性，進(jìn)一步結(jié)合聚類分析方法對(duì)薄荷香精批次間品質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以為薄荷香精的質(zhì)量控制提供便捷、直觀的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鄰二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪，色譜純，購自Sigma公司；甲醇、丙酮均為色譜純，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

安捷倫7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜儀（配有EI源，自動(dòng)進(jìn)樣裝置），美國Agilent公司；漩渦振蕩器（VORTEX-5），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；分析天平（FA2014），上海良平儀器儀表有限公司等。

1.2 樣品及前處理

同一公司的5個(gè)不同批次的薄荷香精由某香精公司提供。

稱取薄荷香精1 mL于進(jìn)樣小瓶，直接進(jìn)樣，供GC-MS分析。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-Innowax極性色譜柱：60 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣為氦氣，純度≥99.999%；流速：0.8 mL/min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積：0.2 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～550 u。檢測方式：全掃描和SIM碎片掃描。

本研究對(duì)升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)比6個(gè)氣相色譜升溫程序的分析效果，以化合物解析數(shù)量為指標(biāo)確定最優(yōu)升溫程序。

升溫程序（1）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：20：1。

升溫程序（2）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃，保持 5 min。分流比：50：1。

升溫程序（3）：40 ℃，6 min；5 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃，保持 10 min。分流比：20：1。

升溫程序（4）：40 ℃，6 min；5 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃。分流比：10：1。

升溫程序（5）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：30：1。

升溫程序（6）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：20：1。

1.4 定性和定量分析

將C5-C24的正構(gòu)烷烴標(biāo)樣進(jìn)入GC-MS分析，計(jì)算檢測物質(zhì)的保留指數(shù)（RI）。利用質(zhì)譜圖，比對(duì)數(shù)據(jù)庫（NIST/WILEY）中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖，采用匹配度大于80%的鑒定結(jié)果，并與文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而確定該物質(zhì)。

本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，選擇對(duì)比四個(gè)物質(zhì)：鄰二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪，確定最終內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

1.5 相似度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

相似度可反映指紋圖譜之間的相似程度，可用于樣品的甄別[23]。本研究采用夾角余弦法[24]計(jì)算5個(gè)薄荷香精香氣指紋圖譜間的相似度。

本研究采用Excel計(jì)算5個(gè)薄荷香精揮發(fā)性物質(zhì)含量間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

1.6 聚類分析

聚類分析可用于衡量不同圖譜間的相似性，以及把數(shù)據(jù)源分類到不同的簇中[25]。本研究采用SPSS軟件中的Ward法結(jié)合平方Euclidean距離對(duì)5個(gè)薄荷香精進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 升溫程序優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)升溫程序條件下薄荷香精中的揮發(fā)性物質(zhì)均得到較好的分離，峰形差異不明顯。6個(gè)升溫程序分別分離得到148個(gè)、84個(gè)、116個(gè)、104個(gè)、101個(gè)和153個(gè)出峰。通過解析化合物數(shù)量多少的對(duì)比，選擇 40 ℃，6 min；3 ℃/min 至 100 ℃；5 ℃/min至230 ℃，保持20 min，分流比：20：1作為色譜升溫程序，色譜圖見圖1。

圖1 最優(yōu)升溫程序條件下的薄荷香精色譜譜圖Fig.1 Chromatogram of peppermint flavor under optimal temperature program

2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)比四個(gè)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：鄰二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪。結(jié)果表明，2-甲氧基-3-甲基吡嗪出峰位置為30.96 min左右，與薄荷香精成分出峰位置無重疊，且響應(yīng)豐度良好，用作內(nèi)標(biāo)，其色譜圖見圖2。

圖2 內(nèi)標(biāo)2-甲氧基-3-甲基吡嗪色譜譜圖Fig.2 Chromatogram of 2- methoxy -3- methylpyrazine used as internal standard

2.3 薄荷香精成分分析結(jié)果

采用優(yōu)化好的色譜升溫程序?qū)Ρ『上憔煞诌M(jìn)行分析，并對(duì)5個(gè)薄荷香精的揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果見表1。

表1 5個(gè)薄荷香精樣品共同揮發(fā)性成分及含量Table 1 Volatile compounds in the 5 peppermint flavors

23 25.5891 反式乙位羅勒烯 109.4 106.9 114.3 113.9 125.6 6.282 0.884 24 25.71 3-辛酮 66.5 64.2 82.0 63.8 73.1 11.026 0.728 25 26.562 對(duì)傘花烴 4977.8 4967.8 5358.0 5323.9 5336.8 3.876 1.000 26 26.9083 2-甲基丁酸-2-甲基丁酯 50.4 44.0 61.4 55.4 52.5 12.132 0.571 27 27.0941 4-蒈烯 351.5 335.9 344.4 373.7 397.3 6.892 0.986 28 27.3931 正辛醛 44.6 42.0 52.8 56.0 50.9 11.749 0.529 29 27.6284 戊酸-2-甲基丁酯 54.3 51.8 53.6 49.6 53.7 3.627 0.565 30 29.129 3-甲基環(huán)己酮 144.2 139.5 179.1 156.5 152.6 9.947 0.915 31 29.8711 正己醇 49.9 52.4 76.7 55.0 60.7 18.140 0.567 32 30.799 己酸烯丙酯 2915.1 2891.1 3868.2 3077.2 3139.3 12.580 1.000 33 31.1596 葉醇 95.2 108.9 119.9 116.1 114.7 8.679 0.826 34 31.4377 3-辛醇 1694.4 1649.2 2146.0 1756.9 1786.1 10.912 0.999 35 31.6829 壬醛 26.7 27.1 40.0 30.7 30.6 17.333 0.345 36 33.3374 2,4-二甲基苯乙烯 114.7 111.0 123.7 117.1 122.3 4.494 0.826 37 33.3693 順式氧化芳樟醇 90.7 96.5 108.7 119.3 108.1 10.706 0.783 38 33.4562 異戊酸己酯 279.9 277.9 142.2 97.1 115.8 48.957 0.872 39 33.6377 (-)-Α-蓽澄茄油烯 141.0 140.5 83.9 176.8 154.8 24.627 0.844 40 34.063 順式水合檜烯 518.8 490.7 613.7 534.5 551.0 8.484 0.990 41 34.373 薄荷酮 50514.9 49169.4 71048.8 53665.4 58726.3 15.650 1.000 42 34.4595 醋酸辛酯 94.7 85.5 90.3 81.0 82.0 6.647 0.698 43 34.6403 丙位欖香烯 1768.0 1506.6 1591.4 1428.0 1478.8 8.569 0.999 44 34.7468 2-乙基己醇 306.2 262.6 381.4 336.5 307.4 13.730 0.970 45 34.8031 甲位古巴烯 53.9 1974.4 252.9 13.8 21.7 183.532 0.163 46 34.8711 異戊酸葉醇酯 925.1 898.9 1135.9 995.6 1020.8 9.350 0.997 47 34.9447 薄荷呋喃 5230.4 5731.3 6656.6 4908.7 5639.9 11.722 1.000 48 35.2339 杜松-3,5-二烯 105.2 94.1 159.9 153.3 102.6 25.219 0.801 49 35.3636 1,3-二氯苯 421.0 325.8 344.1 308.7 319.7 13.076 0.973 50 35.54 異薄荷酮 18311.7 19006.1 20075.1 18013.6 18654.8 4.241 1.000 51 36.0397 乙位波旁烯 1189.2 1180.9 1380.5 1150.0 1158.3 7.896 0.998 52 36.2026 乙酸異薄荷酯 757.7 766.4 362.4 316.3 311.5 47.226 0.980 53 36.3512 甲位-古蕓烯 568.3 21.5 52.8 20.4 21.1 176.620 0.126 54 36.5432 芳樟醇 10250.3 9925.5 13354.1 10647.9 10825.1 12.375 1.000 55 36.7197 反式水合檜烯 121.3 145.8 142.5 136.2 138.0 6.909 0.840 56 36.8477 1-辛醇 349.4 341.0 401.9 335.4 378.9 7.799 0.974 57 36.9225 乙酸芳樟酯 2788.8 2830.0 8091.7 3748.1 3658.9 52.288 1.000 58 37.2467 乙酸薄荷酯 18732.6 18018.6 24740.0 19379.2 19701.7 13.249 1.000 59 37.5183 異胡薄荷醇 9949.3 6586.5 5453.7 9082.7 4535.7 32.628 1.000 60 37.6507 乙位古巴烯 1262.9 1527.0 1612.9 1647.3 1498.8 9.986 0.998 61 37.9977 1,2-丙二醇 47726.1 47520.2 61754.2 59734.7 48063.6 13.491 1.000 62 38.0845 BETA-環(huán)檸檬醛 134.8 173.4 158.4 144.3 156.5 9.575 0.859 63 38.0986 乙位欖香烯 94.3 122.7 100.8 120.4 124.4 12.374 0.759 64 38.1543 新薄荷醇 4548.2 4211.8 4463.1 4084.9 4376.8 4.334 1.000 65 38.4078 石竹烯 8313.9 3675.0 3376.1 4376.3 7079.6 41.082 1.000

109 44.9116 香葉醛丙二醇縮醛P2 241.0 239.2 240.6 236.4 249.0 1.945 0.918 110 45.0183 苯甲醇 13.7 29.1 42.8 15.2 14.3 55.459 0.536 111 45.8175 苯乙醇 84.6 82.9 122.7 92.0 82.7 18.351 0.582 112 46.1506 甲位去二氫菖蒲烯 11.8 12.3 34.0 29.1 16.8 48.851 0.606 113 46.3485 去氫檸檬醛 70.1 73.8 117.4 83.7 84.7 21.738 0.529 114 46.6354 茉莉酮 410.4 431.6 591.8 463.2 465.5 14.928 0.975 115 47.6974 石竹烯氧化物P2 429.4 364.4 649.0 496.1 452.5 22.292 0.973 116 48.1328 反式橙花叔醇 37.4 43.9 82.3 53.9 63.1 31.388 0.331 117 48.4813 對(duì)甲氧基苯甲醛 2410.0 2402.5 3321.4 5174.9 5239.4 38.207 0.999 118 49.4872 綠花白千層醇 122.1 115.0 146.3 128.8 138.6 9.607 0.715 119 50.1842 斯巴醇 131.5 131.3 175.0 157.6 155.9 12.468 0.764 120 50.9901 丁香酚 3662.3 3664.8 5030.0 20.8 4113.5 58.068 0.377 121 51.0604 百里香酚（麝香草酚） 12734.0 12521.4 16538.9 17249.6 13747.9 15.088 1.000 122 53.1888 香芹酚 40.3 36.5 825.6 55.0 60.5 170.871 0.204 123 54.2563 薄荷內(nèi)酯 88.7 88.4 132.9 57.8 105.5 28.979 0.469

由表1結(jié)果可知，5個(gè)薄荷香精樣品具有123種揮發(fā)性香氣成分。其中，薄荷腦是薄荷香精中主要特征揮發(fā)性香氣成分，具有涼的、清鮮的、愉快的薄荷特征香氣，其它主要成分包括茴香腦、香芹酮、薄荷酮、異薄荷酮、桉葉油素、乙酸薄荷酯和 1,2-丙二醇等。其中香芹酮為留蘭香型，桉葉油素具有清涼尖刺的類似樟腦樣的藥草香，薄荷酮、異薄荷酮、乙酸薄荷酯具有清涼的薄荷香氣，木香底蘊(yùn)。

五個(gè)薄荷香精的123種揮發(fā)性物質(zhì)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相關(guān)系數(shù)如表 2所列。其中，2-蒎烯、2-甲基丁酸乙酯、乙位蒎烯、檜烯等40種物質(zhì)的相似度高于0.99，這 40個(gè)峰可用作薄荷香精的特征指紋峰。40種特征指紋峰中，RSD＜10%的有 9種，10%～20%之間的有12種，RSD＞20%的有19種，說明不同批次間的樣品質(zhì)量會(huì)有一定的波動(dòng)。

2.4 聚類分析

圖3 5個(gè)薄荷香精樣品的系統(tǒng)聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis for the 5 peppermint flavors

本研究采用聚類分析對(duì)5個(gè)薄荷香精樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，從而對(duì)比5個(gè)薄荷香精樣品間的相似性和差異性，結(jié)果見圖3。

系統(tǒng)聚類分析樹狀圖中橫坐標(biāo)表示臨界值，即平方Euclidean距離（E值），臨界值越小，則表明相似度越高；縱坐標(biāo)為樣品名。在圖3中可知，當(dāng)E值為1時(shí)，樣品4和樣品5就已經(jīng)表現(xiàn)出了較高的相似度，說明樣品4和樣品5之間存在相同的質(zhì)量品質(zhì)；當(dāng)E值為4時(shí)，樣品1和樣品2相似度較高，品質(zhì)相同，同時(shí)區(qū)別于樣品4和樣品5的品質(zhì)；當(dāng)E值為8時(shí)，樣品1和樣品4表現(xiàn)出相似度；當(dāng)E值為25時(shí)，樣品3和樣品5才表現(xiàn)出相似性，證明3號(hào)樣品與其他四個(gè)樣品相似度最差，即品質(zhì)差異度最高。

3 結(jié)論

本研究用優(yōu)化的GC-MS方法分析薄荷香精中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)，結(jié)果顯示：所分析的5個(gè)同公司不同批次的薄荷香精樣品，其共同成分有123種；其中，薄荷腦、大茴香腦、香芹酮、薄荷酮為主要香氣物質(zhì)。相似度分析得到2-蒎烯等40種物質(zhì)可用作薄荷香精的特征指紋峰。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析結(jié)合聚類分析表明不同批次間的樣品質(zhì)量會(huì)有一定的波動(dòng)。本研究采用的GC-MS結(jié)合聚類分析方法可以對(duì)薄荷香精的品質(zhì)穩(wěn)定性可以進(jìn)行有效且明顯的區(qū)分控制。