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    包裝飲用水生產(chǎn)工藝中微生物風(fēng)險(xiǎn)分析

    2018-10-13 05:55:16陳玲楊小鵑陸永成尚建鋼羅之綱郭偉鵬吳清平張菊梅
    現(xiàn)代食品科技 2018年9期
    關(guān)鍵詞:銅綠鏈球菌單胞菌

    陳玲,楊小鵑,陸永成,尚建鋼,羅之綱,郭偉鵬,吳清平,張菊梅

    (1.華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物分析檢測中心,廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)(2.上??底R食品科技有限公司,上海 201100)

    微生物污染是引起食源性疾病的主要因素,長期以來,水傳播病原微生物污染一直是飲水安全的最大威脅,歷史上由水為媒介的傳染病霍亂、傷寒、脊髓灰質(zhì)炎、病毒性肝炎和寄生蟲病等曾奪去千百萬人的生命。盡管現(xiàn)代水消毒處理技術(shù)在一定程度上能夠控制飲水微生物污染,但微生物仍然是水質(zhì)控制的首要問題。包裝飲用水的微生物污染問題是長期困擾生產(chǎn)企業(yè)食品安全的質(zhì)量技術(shù)難題,同時也是每年各省市食品安全監(jiān)管部門重點(diǎn)監(jiān)督抽查的食品安全指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織制定的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第3版中明確提出,無論在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家,與飲用水有關(guān)的安全問題大多來自微生物。當(dāng)前,飲用水安全在世界各國都被擺在首位,隨著人們關(guān)注度的提高,相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新。2006年我國制定的生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749-2006)中,與GB 5749-1985版相比,水質(zhì)指標(biāo)由35項(xiàng)增至106項(xiàng),微生物指標(biāo)由2項(xiàng)增至6項(xiàng),新國標(biāo)符合國際飲用水標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和消費(fèi)者飲水習(xí)慣的改變,人們對包裝飲用水的需求量日益增長,對水質(zhì)要求也越來越高,這就要求企業(yè)生產(chǎn)過程中的各個環(huán)節(jié)必須保障飲用水安全,運(yùn)用多重屏障如臭氧、紫外線(UV)照射、反滲透(RO)、過濾及蒸餾等來保障產(chǎn)品微生物安全[1]。目前,國內(nèi)對于包裝飲用水生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的微生物(包括食源性致病菌),缺乏系統(tǒng)的調(diào)查分析和風(fēng)險(xiǎn)識別,本文以分布在A、B、C、D四個市的包裝飲用工廠生產(chǎn)工藝中各環(huán)節(jié)的水為研究對象,對原水、過程水(指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水)和成品水進(jìn)行微生物檢測,監(jiān)測項(xiàng)目包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù),以及銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。同時利用傳統(tǒng)和分子鑒定技術(shù),對分離到的優(yōu)勢菌進(jìn)行分類鑒定,以掌握背景資料,形成企業(yè)微生物分布圖譜,為產(chǎn)品中污染微生物的溯源和工廠生產(chǎn)過程中微生物質(zhì)量控制提供重要的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品來源

    圖1 包裝飲用水生產(chǎn)工藝及采樣點(diǎn)Fig.1 Production process and samples layout plans in packaged drinking water company

    根據(jù)GB/T 5750.2-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》進(jìn)行采樣。采集分布在A、B、C、D四個市的包裝飲用工廠內(nèi)的原水、過程水(指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水)、成品水共33份樣品。工廠生產(chǎn)工藝及采樣點(diǎn)見圖1,該包裝飲用水企業(yè)的原水為市政水,對其進(jìn)行多級凈化處理,最終獲得成品水。

    1.1.2 主要試劑與儀器

    微生物培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn),API生化鑒定試劑條及其配套試劑購自法國生物梅里埃公司,BIOLOG生化鑒定相關(guān)試劑購自美國BIOLOG公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑購自廣州東盛生物科技有限公司,真菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司,PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成。

    滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、PCR儀、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、生物安全柜。

    1.2 方法

    1.2.1 檢測方法

    菌落總數(shù)參照GB/T 5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》,霉菌和酵母計(jì)數(shù)參照 GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》,大腸菌群計(jì)數(shù)參照GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》,銅綠假單胞菌、糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌參照GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》。

    1.2.2 菌種鑒定

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[2]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3],分離的優(yōu)勢菌采用 API、BIOLOG生化鑒定系統(tǒng)和PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行菌種鑒定,其中分子方法具體操作步驟:

    1.2.2.1 基因組DNA提取

    選取樣品培養(yǎng)所得微生物菌落中的優(yōu)勢菌株分離純化后,根據(jù)相應(yīng)基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。

    1.2.2.2 細(xì)菌鑒定方法

    采用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rRNA基因,引物:F27 (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'),R1492 (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3');PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性,5 min;94 ℃變性,1 min;56 ℃退火,1 min;72 ℃延伸,2 min;共進(jìn)行30循環(huán);最后72 ℃終延伸,7 min。

    1.2.2.3 測序與分析

    擴(kuò)增產(chǎn)物交付北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行測序分析。最后將所得測序結(jié)果提交到GENBANK(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)進(jìn)行比對,分析其與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 生產(chǎn)工藝中微生物檢測結(jié)果

    共采集33份樣品(A市10份,B市9份,C市和D市各7份),進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù),以及銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測。所有樣品霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群檢出值均<1 CFU/mL;砂濾水、碳濾水的菌落總數(shù)檢出值較高,次之為UV水。33份樣品中除了B市的RO水檢出銅綠假單胞菌(檢出值為6 CFU/250 mL)、A市的碳濾水檢出糞鏈球菌(檢出值為 10 CFU/250 mL);其他樣品銅綠假單胞菌和糞鏈球菌檢出值均為0 CFU/250 mL、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出值均為0 CFU/50 mL。過程水(指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水)具體檢測結(jié)果見表1,銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果見表2。

    由結(jié)果可知,四個工廠原水、超濾水以及成品水的微生物總體風(fēng)險(xiǎn)較低,其中經(jīng)過臭氧工藝后的成品水所檢測的微生物指標(biāo)均未檢出。而碳濾水菌落總數(shù)檢出值較高,水體作為營養(yǎng)物質(zhì)、顆粒物和微生物的載體,在其流動的過程中,微生物利用水體中的有機(jī)物進(jìn)行生長繁殖,最終粘附在管壁上,隨著時間推移,有可能形成生物膜?;钚蕴渴欠N多孔性含炭物質(zhì),由于它具有發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)和巨大的比表面積,故能有效去除水中有機(jī)污染物,同時為微生物的棲息提供了場所[4]。越來越多研究表明,活性炭出水中微生物的數(shù)量會增加,主要是由于活性炭床上附著大量微生物,這些微生物從炭床脫落進(jìn)入出水,從而使得活性炭出水中的微生物普遍高于其他單元出水的微生物?;钚蕴砍鏊募?xì)菌常與細(xì)小的活性炭顆粒一并流出,受炭粒的保護(hù),該類細(xì)菌對不良環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性[5]。各種微生物可認(rèn)為是以顆粒狀態(tài)存在,建議工廠采用在線的顆粒計(jì)數(shù)儀定量檢測出水中的顆粒物,通過控制各類顆粒的數(shù)量,保障水的微生物安全性。除此以外,應(yīng)適當(dāng)增加對活性炭的清洗消毒頻率,定期更換活性炭,以免因吸附飽和失去功效。相比碳濾水檢測結(jié)果,UV水菌落總數(shù)檢出值略低,但其帶來的微生物風(fēng)險(xiǎn),會對后續(xù)水處理工藝中RO膜增加負(fù)荷,降低使用壽命,應(yīng)引起關(guān)注。而在水處理工藝的末端添加了微濾(孔徑≤1 μm)可去除細(xì)菌等顆粒污染物,降低了水體進(jìn)入灌裝區(qū)的微生物風(fēng)險(xiǎn)。

    表1 過程水檢測結(jié)果Table 1 Microbiological detection of supply-water

    RO水AS7 7 <1 <1 BS7 <1 <1 <1 CS7 <1 <1 <1 DS7 <1 <1 <1

    表2 致病菌檢測結(jié)果Table 2 Microbiological detection of pathogenic bacteria

    2.2 菌種鑒定

    從四個工廠分離出34株菌株進(jìn)行鑒定,均鑒定為細(xì)菌,未分離到真菌,結(jié)果見表3。分離的34株細(xì)菌中,共包括3個門,16個屬,21個種,4株未鑒定到種,優(yōu)勢種群為食酸菌屬(主要分離自碳濾水和 UV水)、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬和分枝桿菌屬(主要分離自超濾水和UV水)。從屬的水平分析,分離的細(xì)菌主要由食酸菌屬(18.2%)、假單胞菌屬(12.1%)、分枝桿菌屬(12.1%)、芽胞桿菌屬(9.1%),其他占一小部分。分離的34株細(xì)菌中條件致病細(xì)菌有:乙酸鈣不動桿菌(分離自砂濾水)、偶發(fā)分枝桿菌(分離自RO水和超濾水)、銅綠假單胞菌(分離自RO水)、糞鏈球菌(分離自碳濾水),其中不動桿菌屬是非發(fā)酵條件致病菌,當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時可引起各種感染如腦膜炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等[6],偶發(fā)分枝桿菌屬是革蘭氏陽性桿菌,細(xì)胞壁含有分枝菌酸,為胞內(nèi)寄生菌,能引起長期慢性感染,其中偶發(fā)分枝桿菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)力、容易引起傷口反復(fù)腐爛[7]。B市工廠的RO水中檢出銅綠假單胞菌,銅綠假單胞菌是一種重要的水源性致病菌,廣泛存在于各類型水中,該菌的生長對營養(yǎng)要求不高,對紫外線、消毒劑、干燥等物理因素及不良環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力,不易被殺死[8,9];它能產(chǎn)生抗藥性,增加感染患者的死亡風(fēng)險(xiǎn),作為條件致病菌,可能引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥等疾病[10]。本研究團(tuán)隊(duì)魏磊等[11]對全國36家水廠的108份樣本進(jìn)行該菌的檢測,結(jié)果顯示全國山泉水水源水、活性碳過濾后水污染率較高,分別為66.7%、83.3%。除了銅綠假單胞菌,糞鏈球菌在水中的檢出率也很高,Wei L等[12]在314份水中有48份樣品檢出糞鏈球菌,其中碳濾后水的糞鏈球菌污染率最高,為34.5%。本文A市工廠的碳濾水同樣檢出糞鏈球菌,對于如何監(jiān)控分析此類條件致病菌污染原因并進(jìn)行有效控制已成為包裝飲用水生產(chǎn)廠家密切關(guān)注的問題。

    表3 菌種鑒定結(jié)果Table 3 Identification of the predominant strains

    注:a為未查到中文種名;b為未鑒定到種。

    3 結(jié)論

    包裝飲用水企業(yè)四個工廠生產(chǎn)工藝對微生物的控制較為有效,微生物危害風(fēng)險(xiǎn)較低。在我國,包裝飲用水微生物污染存在企業(yè)生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié),從源頭難以有效控制;且微生物種類多易發(fā)生變異,使得污染控制技術(shù)需不停的調(diào)整和優(yōu)化,以獲得一套有效的車間質(zhì)量監(jiān)測體系。包裝飲用水企業(yè)可參照 GB 19304-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范》的相關(guān)要求,以及該標(biāo)準(zhǔn)附錄A“包裝飲用水加工過程的微生物監(jiān)控程序指南”,進(jìn)行固定頻率的監(jiān)控,各監(jiān)控點(diǎn)的監(jiān)控結(jié)果應(yīng)當(dāng)符合監(jiān)控指標(biāo)的限值并保持穩(wěn)定,當(dāng)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不符合時,應(yīng)立即糾正,同時查找問題原因。除此以外,建議包裝飲用水企業(yè)開展常態(tài)化的微生物監(jiān)控,除了對包裝飲用水生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)的水進(jìn)行監(jiān)控外,還應(yīng)對環(huán)境、人員、設(shè)備和產(chǎn)品包裝材料等進(jìn)行微生物污染調(diào)查和風(fēng)險(xiǎn)識別研究,以獲取完整的微生物風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù);對于重要致病菌的監(jiān)控,企業(yè)可根據(jù)條件引入PCR或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等快速檢測方法。管控產(chǎn)品發(fā)生微生物污染的風(fēng)險(xiǎn),建立包裝飲用水微生物安全風(fēng)險(xiǎn)和溯源數(shù)據(jù)庫,依據(jù)現(xiàn)有規(guī)程及時糾正,從而建立新型包裝飲用水的質(zhì)量控制體系,提升整個行業(yè)風(fēng)險(xiǎn)控制能力,保證產(chǎn)品安全。

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