HS-SPME同時(shí)萃取衍生化定量白酒中反-2-烯醛和二烯醛類化合物

曹長(zhǎng)江，范文來，聶 堯，徐 巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫214122)

醛類是飲料酒香氣重要成分，由微生物發(fā)酵及脂肪［1］和醇類［2］氧化產(chǎn)生。反-2-烯醛和二烯醛類屬于不飽和醛類，在飲料酒中的含量低［3-6］，但由于其較低的閾值［7］，對(duì)飲料酒的香氣有很大貢獻(xiàn)［4］。

碘量法和比色法是醛類檢測(cè)的常規(guī)方法［2］，主要檢測(cè)白酒中醛類總量。利用頂空固相微萃取(HS-SPME)檢測(cè)白酒中醛類，受到醛類極性、沸點(diǎn)、萃取頭類型，以及飲料酒基質(zhì)干擾的影響，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度不高，只能定量白酒中部分飽和醛［8-9］。采用衍生化方法，能提高檢測(cè)靈敏度，去除基質(zhì)干擾。常見衍生化試劑有 2，4-二硝基苯肼［10］、五氟苯肼［11］以及鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA)［3，12-13］等，其中 PFBHA具有衍生效率高，衍生劑用量小等特點(diǎn)［12］，如López-Vázquez［3］等用 PFBHA 衍生化 SPME 法在葡萄皮渣蒸餾酒中定量檢測(cè)5種反-2-烯醛和4種二烯醛類化合物;Saison［4］等利用 PFBHA衍生化 SPME法檢測(cè)啤酒中6種反-2-烯醛和1種二烯醛類化合物;Sowiński［6］等利用 PFBHA 衍生化檢測(cè)伏特加酒中 2種反-2-烯醛和 8種飽和醛。Ferreira［13］等利用PFBHA衍生結(jié)合固相萃取(SPE)應(yīng)用GC-MS定量檢測(cè)葡萄酒中反-2-壬烯醛和反，順-2，6-二烯醛。

中國白酒中醛類檢測(cè)主要集中在總?cè)┖惋柡腿╊惿?。李俠［14］利用光度法測(cè)定白酒中醛類總量，王曉欣［8］利用HS-SPME結(jié)合GC-MS檢測(cè)濃香型習(xí)酒香氣物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)到乙醛、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、己醛、壬醛、癸醛等6種飽和醛類，張燦［15］利用浸入固相微萃取檢測(cè)白酒中異嗅化合物時(shí)，檢測(cè)到反-2-壬烯醛(檢測(cè)限為1．55μg/L)。范文來［16］等利用液液萃取結(jié)合正相色譜，采用GC-MS的檢測(cè)方法，在我國清香型和醬香型白酒中共定性出6種反-2-烯醛和6種二烯醛類化合物，沒有對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PFBHA作衍生化試劑，HS-SPME同時(shí)萃取衍生和GC-MS聯(lián)用的方法共定量我國白酒中14種反-2-烯醛和二烯醛類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

反-2-戊烯醛(純度 95%)、反-2-己烯醛(95%)、反-2-庚烯醛(95%)、反-2-辛烯醛(94%)、反-2-壬烯醛(97%)、反，反-2，4-己二烯醛(95%)、反，反-2，4-庚二烯醛(88%)、反，反-2，4-辛二烯醛(95%)、反，反-2，4-壬二烯醛(85%)、反，反-2，4-癸二烯醛(85%)、反，順-2，6-壬二烯醛(95%)、對(duì)氟苯甲醛(內(nèi)標(biāo)，98%)、鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA，98%)Sigma-Aldrich公司;乙醇 色譜純，上海安譜科學(xué)儀器公司;氯化鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水 超純水，Milli-Q系統(tǒng)純化。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent GC 6890-MSD 5975 美國Agilent公司;自動(dòng)進(jìn)樣裝置(MPS2) 德國Gestel公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;DVB/CAR/PDMS三相萃取頭 加拿大Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 內(nèi)標(biāo)、反-2-烯醛和二烯醛類標(biāo)準(zhǔn)液及衍生劑溶液的配制 參照文獻(xiàn)［4］，準(zhǔn)確稱量14．30mg的對(duì)氟苯甲醛(內(nèi)標(biāo))，用色譜純乙醇定容至100mL，再用色譜純乙醇稀釋500倍(濃度為1．0724mg/L)，-20℃儲(chǔ)存，作為內(nèi)標(biāo)溶液以備使用。分別準(zhǔn)確稱取1．86～5．77mg的14種反-2-烯醛和二烯醛類標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于100mL色譜純乙醇，-20℃儲(chǔ)存，作為單標(biāo)溶液以備使用。

1．2．2 樣品預(yù)處理 用煮沸后冷卻至室溫的超純水將酒樣稀釋至酒精度10%vol，準(zhǔn)確吸取8mL置于20mL頂空瓶中，加入8μL內(nèi)標(biāo)對(duì)氟苯甲醛溶液(最終濃度為 1．0724μg/L)和 300μL 的衍生化試劑PFBHA溶液，旋緊瓶蓋，待分析。

1．2．3 HS-SPME同時(shí)萃取衍生化條件優(yōu)化 參考López-Vázquez［3］的方法，同時(shí)萃取衍生化。用自動(dòng)進(jìn)樣裝置(MPS2)進(jìn)行樣品HS-SPME同時(shí)萃取衍生化，衍生反應(yīng)時(shí)間為10min，酒樣稀釋至10%vol，同時(shí)萃取衍生化溫度為65℃，萃取衍生化時(shí)間為45min，加 3g NaCl。

對(duì)主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化?？疾炀凭?10%vol、20%vol和30%vol)、同時(shí)萃取衍生化溫度(45、50、55、60、65、70 和 80℃)、同時(shí)萃取衍生化時(shí)間(15、30、45和60min)和離子強(qiáng)度對(duì)反-2-烯醛和二烯醛類檢測(cè)的影響。

1．2．4 GC-MS 條件 GC 條件:載氣 He(純度99．9995%)，流速 2mL/min，不分流進(jìn)樣;色譜柱:DB-Wax(60m × 0．25mm × 0．25μm)。進(jìn)樣口溫度250℃，解吸附300s。升溫程序?yàn)?50℃保持2min，以6℃ /min升至 100℃，保持 0．1min，以 2℃ /min 升至160℃，保 持 0．1min，以 5℃/min 升 至 230℃，保持15min。

MS條件:電子電離(EI)，電子能量70eV，離子源溫度 230℃，SCAN 模式掃描范圍為 35．00～380．00amu。質(zhì)譜分析使用NIST05a．L數(shù)據(jù)庫。

1．2．5 定性和定量 通過對(duì)比衍生化后酒樣和反-2-烯醛和二烯醛類標(biāo)準(zhǔn)品衍生后的保留時(shí)間以及NIST05a．L數(shù)據(jù)庫提供的質(zhì)譜圖對(duì)照，利用匹配度、特征離子以及保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。

用選擇特征定量離子(SIM)的方法對(duì)反-2-烯醛和二烯醛類衍生物進(jìn)行積分，衍生產(chǎn)物有順，反異構(gòu)體的，以兩個(gè)離子峰面積之和計(jì)算(見圖1)。以14種反-2-烯醛和二烯醛類衍生物特征離子峰與內(nèi)標(biāo)的特征離子峰(m/z 319)的峰面積之比為橫坐標(biāo)(x)，反-2-烯醛和二烯醛類與內(nèi)標(biāo)濃度之比為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向白酒樣品中添加與酒中濃度相近的、相應(yīng)的反-2-烯醛和二烯醛類標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率和精密度測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

醛類化合物與PFBHA反應(yīng)得到的衍生產(chǎn)物，除個(gè)別形成單峰，一般是兩個(gè)色譜峰(即順，反異構(gòu)體)［17-18］。本實(shí)驗(yàn)研究的醛類除反-2-壬烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛的衍生產(chǎn)物為單峰，其他均為兩個(gè)峰，如圖1所示。計(jì)算峰面積時(shí)，除反-2-壬烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛為一個(gè)離子峰外，其他物質(zhì)均以兩個(gè)離子峰面積總和來計(jì)算。

2.1 同時(shí)萃取衍生條件優(yōu)化

本研究共涉及14種反-2-烯醛和二烯醛，包括8種反-2-烯醛類和6種二烯醛類。根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相似的原理，選取反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛分別代表反-2-烯醛類和二烯醛類化合物，進(jìn)行萃取條件優(yōu)化?？疾炝擞绊懖伙柡腿╊愅瑫r(shí)萃取衍生效率的因素主要包括酒精度、萃取溫度、萃取時(shí)間、離子濃度等。

2．1．1 酒精度的優(yōu)化 酒精度優(yōu)化時(shí)分別選取10%vol，20%vol和30%vol三個(gè)酒精度，結(jié)果以相對(duì)峰面積比值表示(相對(duì)峰面積比值:同一物質(zhì)在不同酒精度下的峰面積中，選取最大峰面積并設(shè)定為100，其他酒精度條件的峰面積除以最大值的實(shí)際值，得到的比值)。由圖2可以看出:20%vol和30%vol的酒精度下，兩個(gè)化合物的萃取效果都顯著降低。10%vol的酒精度的萃取效果最好。這一結(jié)果與早期研究白酒微量成分檢測(cè)與香氣［19］時(shí)采用的酒精度一致，所以選取10%vol的酒精度為樣品測(cè)定酒精度。

圖1 豉香型白酒樣品與PFBHA反應(yīng)的反-2-烯醛和二烯醛類衍生物離子圖譜Fig．1 Extracted ions chromatograms of trans-2-alkenals and alkadienals oxime derivatives of soybean aroma type liquor

2．1．2 萃取溫度的選擇 由圖3可以看出，萃取效率隨萃取溫度升高先上升后下降，這一趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。當(dāng)萃取溫度升到65℃時(shí)，反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛的萃取效果最好，溫度繼續(xù)升高，萃取效率降低。溫度從40℃升高到65℃過程中，不飽和醛反-2-烯醛和二烯醛類化合物隨著溫度的升高從酒樣中揮發(fā)到空氣中，從而增加萃取頭的吸附效率;但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，加速了萃取頭上不飽和醛類的解吸附，降低了萃取效率。Sowiński［6］驗(yàn)證了在30、50和70℃條件下，PFBHA衍生產(chǎn)物的萃取效率，結(jié)果為70℃的萃取效率最高，與本研究結(jié)果接近。故選擇65℃作為實(shí)驗(yàn)萃取溫度。

圖2 不同酒精度下的萃取效果Fig．2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

圖3 不同萃取溫度下的萃取效果Fig．3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2．1．3 萃取時(shí)間的選擇 López-Vázquez［3］等人選取2、5、10min和15min考察了衍生反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果顯示衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果沒有影響，這可能是醛類和PFBHA反應(yīng)迅速，所需時(shí)間小于2min。本實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)熱5min作為反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行萃取時(shí)間優(yōu)化。

由圖4可見，當(dāng)萃取時(shí)間從15min增加到45min時(shí)，不飽和醛類的萃取效率顯著增加，萃取時(shí)間超過45min后，不飽和醛類的萃取效率增加幅度不大，趨于平衡，此時(shí)達(dá)到吸附和解吸附平衡。Saison［4］報(bào)道萃取時(shí)間40min，二者結(jié)果相似。故選取45min為樣品萃取時(shí)間。

2．1．4 離子強(qiáng)度 由圖5可見，樣品中離子強(qiáng)度較大時(shí)(即加入3g NaCl飽和，使樣品溶液飽和)，萃取效率高于離子強(qiáng)度較低時(shí)(即不添加NaCl)。為了得到最佳萃取效果，選擇樣品中加入3g NaCl，再進(jìn)行萃取。

文獻(xiàn)中報(bào)道溶液離子強(qiáng)度對(duì)萃取效率的影響并不一致。這一結(jié)果與 Saison［5］和 Sowiński［6］的結(jié)論一致，Saison認(rèn)為液相中離子強(qiáng)度增加，提高了液相中化合物擴(kuò)散到氣相的比例，從而提高頂空萃取效率［5］，NaCl的添加有助于提高萃取效率。而 López-Vázquez［3］實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相反，即 NaCl的添加降低萃取效率，認(rèn)為高的離子濃度影響醛類衍生物的形成，從而影響醛類衍生物萃取效率。

表1 反-2-烯醛和二烯醛類的定量相關(guān)參數(shù)Table 1 Quantification parameters of trans-2-alkenals and alkadienals

圖4 不同萃取時(shí)間的萃取效果Fig．4 Effect of extraction time on extraction efficiency

圖5 不同離子濃度下的萃取效果Fig．5 Effect of ionic concentration on extraction efficiency

因此，HS-SPME同時(shí)萃取衍生化的條件是酒樣稀釋到酒精度10%vol，樣品中加入3g NaCl，同時(shí)萃取衍生化溫度65℃，萃取衍生化時(shí)間45min。

2.2 線性范圍與檢測(cè)限

由表1可知，該方法對(duì)于14種反-2-烯醛和二烯醛類有很寬的線性范圍，線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)(R2)均在0．9924(反-2-辛烯醛)以上。選取信噪比為3時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限(limit of detection，LOD)，檢測(cè)限從 0．014μg/L(反 -2- 庚烯醛)到0．186μg/L(反-2-十一烯醛)，較 HS-SPME 非衍生化檢測(cè)方法(反-2-壬烯醛，檢測(cè)限 1．55μg/L)［15］更低，能滿足白酒中低濃度不飽和醛類的檢測(cè)要求。

2.3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，14種反-2-烯醛和二烯醛類化合物的回收率在84．47%～116%之間，RSD值均小于10．99%。說明該方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足分析要求。

2.4 白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類化合物的檢測(cè)結(jié)果

選取了濃香型、清香型、醬香型等8種香型白酒的原酒定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。

在檢測(cè)的8種香型的白酒中，豉香型白酒不飽和醛類總量最高，達(dá)1077．36μg/L(表3)，醬香型和兼香型白酒的不飽和醛類總量最低，小于32．95μg/L，其他各香型白酒中不飽和醛類總量在107．30～141．50μg/L范圍。其中含量最高的是豉香型白酒中反-2-辛烯醛，達(dá)301．86μg/L。一般情況下，白酒中的反-2-烯醛類總量高于二烯醛類化合物，不同香型白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類含量各不相同，這一現(xiàn)象可能與白酒釀造的原料和工藝有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

應(yīng)用鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA)作衍生化試劑，采用HS-SPME同時(shí)萃取衍生化結(jié)合GC-MS技術(shù)，建立了白酒中反-2-烯醛和二烯醛類的定性、定量方法。該方法準(zhǔn)確度、精密度高，檢測(cè)限低，并且定量檢測(cè)反-2-烯醛和二烯醛類的種類達(dá)到14種，能滿足白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類化合物的檢測(cè)要求，有助于分析比較不同白酒產(chǎn)品之間的重要風(fēng)味物質(zhì)差別，為白酒品質(zhì)的改進(jìn)提供必要的手段和相關(guān)理論依據(jù)。

表2 白酒中反-2-烯醛和二烯醛類化合物的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)Table 2 Accuracy and standard recovery tests of trans-2-alkenals and alkadienals in Chinese liquor(n=3)

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