克雷伯桿菌肺炎致多器官功能障礙小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)研究*

李 猛,王志梅,徐紅日,王成祥△,馬戰(zhàn)平

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003),2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712000), 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(北京 100029)

主題詞 肺炎,細(xì)菌性/并發(fā)癥 克雷伯菌感染 外器官功能衰竭/病理學(xué) 模型，動(dòng)物 小鼠

多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)是指機(jī)體遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等過(guò)程中的嚴(yán)重并發(fā)癥，病死率隨著功能障礙器官系統(tǒng)的增加而上升。在呼吸系統(tǒng)疾病中細(xì)菌性肺炎是誘發(fā)MODS的主要誘因，肺炎克雷伯桿菌是占第三位的常見致病菌，老年人或免疫功能低下者容易發(fā)生。機(jī)體感染后，若治療不及時(shí)，容易進(jìn)一步出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，進(jìn)而導(dǎo)致MODS的發(fā)生[1-2]。國(guó)內(nèi)外研究者正在積極尋找MODS新的治療途徑，如細(xì)胞因子、基因治療、免疫治療等，雖治療技術(shù)有很大提高，但其病死率仍居高不下[3]。因此，建立克雷伯桿菌肺炎致多器官功能障礙小鼠模型，對(duì)于細(xì)菌性肺炎導(dǎo)致的MODS的發(fā)病機(jī)制和臨床藥效學(xué)研究有重要意義。

材料和方法

1 材 料

1.1 動(dòng)物:SPF級(jí)KM雄性小鼠64只，鼠齡4周，體重(20 ± 5)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)XK20110013)。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥品：肺炎克雷伯桿菌由中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所提供(菌株號(hào)：K46114)，使用前用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1.0 × 103CFU/ml。

1.3 主要試劑與儀器：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)(批號(hào)：20170503)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)(批號(hào)：20170504)、GOT試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzymes，CK)-MB(批號(hào)：L170329067)、CK-M(批號(hào)：L170329060)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α(批號(hào)：EK0527)、白介素(Interleukin，IL)-6(批號(hào)：EK0411)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒由武漢云克隆科技股份有限公司提供。HE染色試劑盒(批號(hào)：G1120)由北京索萊寶科技有限公司提供。TP1020全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150石蠟包埋機(jī)、RM2145型自動(dòng)切片機(jī)(Leica，德國(guó))；OLYMPUS-DP70型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(奧林巴斯，日本)；Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像采集及分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，美國(guó))；UV-260自動(dòng)分光光度計(jì)(島津，日本)。

2 研究方法

2.1 分組與造模：將64只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組，每組32只。參照文獻(xiàn)[4-6]提供的方法制備小鼠肺炎模型：采用10%水合氯醛溶液，按0.1 ml/10 g劑量腹腔注射麻醉小鼠。將麻醉好的小鼠仰臥于鼠板上，用膠帶固定小鼠四肢，用細(xì)線固定小鼠上頜，左手輕輕將小鼠舌頭拉出、上提，打開口腔，用照射燈(冷光源)對(duì)準(zhǔn)小鼠頸部，即可清晰看到小鼠聲門開合。在小鼠聲門打開時(shí)，迅速將氣管插管插入氣管，并立即拔出針芯，避免窒息。將棉絮置于插管口部，當(dāng)出現(xiàn)棉絮隨呼吸擺動(dòng)，且與小鼠呼吸節(jié)律一致，提示氣管插管成功。取0.1 ml配制好的肺炎克雷伯桿菌菌液快速注入小鼠氣道內(nèi)，并注入少量空氣，以確保全部藥液進(jìn)入氣管。隨后將鼠板直立約30 s，輕輕拍打小鼠背部，使菌液入肺。對(duì)照組小鼠采用相同方法注入0.1 ml生理鹽水。

2.2 取材與指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 一般情況：觀察小鼠飲食、活動(dòng)度、呼吸、皮毛光澤度、精神狀態(tài)、尿量等情況。

2.2.2 血液：分別于造模后第1、3、5、7天每組各取8只小鼠，摘眼球采集血液，分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法，檢測(cè)小鼠心肌酶譜CK-MB、CK-M水平(單位：ng/ml)；采用微板賴氏法酶標(biāo)儀定量，檢測(cè)小鼠肝功能ALT、AST水平(單位：U/L)。以上操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

2.2.3 肺臟、心臟、肝臟：小鼠處死后，開腹、開胸取出肺臟、心臟、肝臟，右肺、心臟、肝臟分別用4%多聚甲醛固定液固定，待做蘇木素-伊紅(Htoxylin eosin，HE)染色；左肺進(jìn)行組織勻漿，分離上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用ELISA法，檢測(cè)小鼠肺組織TNF-α、IL-6水平(單位：pg/ml)；取固定好的右肺、心和肝臟組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4 μm厚的切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各臟器組織病理學(xué)改變。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況 對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間飲食正常，動(dòng)作活潑敏捷，呼吸節(jié)律平穩(wěn)，皮毛柔軟致密，光亮潤(rùn)澤，精神狀態(tài)良好，尿量正常；模型組小鼠造模后第1天飲食明顯減少，活動(dòng)減少，呼吸急促、困難，胸腔起伏加劇，毛發(fā)蓬松無(wú)光澤，精神萎靡，尿量明顯減少；造模后第3天，小鼠飲食量及活動(dòng)量較第1天稍增加，呼吸仍較急促，毛發(fā)光澤度及精神狀態(tài)較差，尿量增加；第5天，小鼠飲食及活動(dòng)量增加，呼吸稍促，活動(dòng)稍增，毛發(fā)光澤度稍差，精神狀態(tài)不佳，尿量較正常稍減；第7天，小鼠飲食、活動(dòng)度、呼吸、皮毛光澤度、精神狀態(tài)、尿量等情況基本恢復(fù)正常。

2 兩組血清CK-MB比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天血清CK-MB含量顯著升高(P<0.01)；第5、7天，CK-MB有升高趨勢(shì)(P>0.05)，見表1。

3 兩組血清CK-M比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，心肌酶譜CK-M含量顯著升高(P<0.01)；第5、7天，CK-M有升高趨勢(shì)(P>0.05)，見表2。

4 兩組血清ALT比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1天，肝功能ALT含量顯著升高(P<0.01)；第3、5、7天，ALT有升高趨勢(shì)(P>0.05),見表3。

5 兩組血清AST比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后各時(shí)間點(diǎn)的血清AST含量均有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表4。

6 兩組炎性細(xì)胞因子比較

6.1 兩組肺組織TNF-α比較:與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，肺組織TNF-α的含量顯著增高(P<0.01)，見表5。

6.2 兩組肺組織IL-6比較:與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，肺組織IL-6的含量顯著增高(P<0.05或P<0.01)，見表6。

表1 兩組不同感染時(shí)相小鼠血清CK-MB的變化比較(ng/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.01。

注:與對(duì)照組比較，*P<0.01。

表3 兩組不同感染時(shí)相小鼠血清ALT的變化比較(U/L)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.01

表4 兩組不同感染時(shí)相小鼠血清AST的變化比較(U/L)

表5 兩組不同感染時(shí)相各組小鼠肺組織TNF-α比較(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.01

表6 兩組不同感染時(shí)相各組小鼠肺組織IL-6比較(pg/ml)

注: 與對(duì)照組比較，*P<0.05,△P<0.01

7 各組組織形態(tài)學(xué)比較

7.1 肺組織病理改變：肉眼可見，對(duì)照組肺臟呈均勻粉紅色，表面光滑，彈性好，未見病損灶；模型組肺臟深紅色，可見廣泛點(diǎn)狀、片狀出血灶，充血、水腫、體積增大。

顯微鏡下，對(duì)照組小鼠各時(shí)相肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡腔及肺泡間隔無(wú)明顯增厚(圖1A、B)。模型組小鼠造模后第1天，大部分肺泡破解融合、結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡塌陷，肺泡間隔明顯增厚，充血水腫明顯，肺泡腔及肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)；第3天，部分肺泡破解融合、結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隔增厚，中度充血水腫，肺泡腔及肺間質(zhì)中等量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)；第5天，少部分肺泡破解融合，部分肺泡間隔增厚，輕度充血水腫，肺泡腔及肺間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)；第7天，部分肺泡腔及肺間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織大致恢復(fù)正常(圖1F)。

A：對(duì)照組，× 200；B：對(duì)照組，× 400；C：模型組第1天，× 400；D：模型組第3天，× 400；E：模型組第5天，× 400；F：模型組第7天，× 400

圖1 各組小鼠肺組織代表性病理照片

7.2 心肌組織病理改變：大體可見，對(duì)照組心臟組織為淡紅色，無(wú)腫脹、充血；模型組心臟組織肉眼所見為暗紅色，體積增大，可見廣泛瘀血點(diǎn)。

顯微鏡下，對(duì)照組小鼠試驗(yàn)期間心肌組織形態(tài)大致正常(圖2A、B)。模型組小鼠造模后第1天，心肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，小血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2C)；第3天，部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，可見間質(zhì)纖維組織增生，小血管周圍可見中等量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2D)；第5天，少部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，小血管周圍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2E)；第7天，心肌組織大致恢復(fù)正常(圖2F)。

7.3 各組肝臟病理改變:大體可見，對(duì)照組肝臟紅潤(rùn)，無(wú)腫脹、充血；模型組肝臟肉眼所見為深褐色，稍顯充血。

鏡下可見，對(duì)照組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肝組織形態(tài)大致正常(圖3A、B)。模型組小鼠造模后第1天肝細(xì)胞腫脹，肝竇狹窄、瘀血，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3C)；造模后第3天部分肝細(xì)胞腫脹，可見肝竇狹窄、瘀血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3D)；造模后第5天少部分肝細(xì)胞腫脹、肝竇狹窄、瘀血，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3E)；造模后第7天肝組織大致恢復(fù)正常(圖3F)。

A：對(duì)照組，× 200；B：對(duì)照組，× 400；C：模型組第1天，× 400；D：模型組第3天，× 400；E：模型組第5天，× 400；F：模型組第7天，× 400

圖2 各組小鼠心肌組織代表性病理照片

A：對(duì)照組，× 200；B：對(duì)照組，× 400；C：模型組第1天，× 400；D：模型組第3天，× 400；E：模型組第5天，× 400；F：模型組第7天，× 400

圖3 各組小鼠肝臟組織代表性病理照片

討論

細(xì)菌性肺炎是臨床上常見的肺部感染性疾病，肺炎克雷伯桿菌是導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎的主要致病菌，多見于老年人或免疫功能低下的患者，近年來(lái)耐藥率有增加趨勢(shì)，是院內(nèi)感染的重要原因，其死亡率高達(dá)40%[7]。老年人或免疫功能低下者出現(xiàn)細(xì)菌性肺炎需要及時(shí)治療，否則很難自行好轉(zhuǎn)，甚至容易引起MODS或MOF等較為嚴(yán)重的并發(fā)癥而致死[8]。

MODS發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，目前主要圍繞炎性反應(yīng)失控、凝血/纖溶系統(tǒng)失衡、氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡等方面進(jìn)行研究[9]。炎癥反應(yīng)失控是MODS主要的發(fā)病機(jī)制，MODS是眾多炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子大量釋放和相互作用所造成的失控性全身炎癥反應(yīng)的最終表現(xiàn)[10]。肺是老年多器官功能障礙的啟動(dòng)器官，這與肺自身的組織結(jié)構(gòu)及生理功能密切相關(guān)[11]。肺部感染后，大量炎性介質(zhì)和炎性因子的釋放，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起肺損傷，一方面炎癥介質(zhì)通過(guò)損傷的肺泡上皮細(xì)胞、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，對(duì)心臟、肝臟等其它臟器造成直接損傷，進(jìn)而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征；另一方面肺部損傷后誘發(fā)嚴(yán)重低氧血癥，引起心肌細(xì)胞及肝細(xì)胞驟然缺血缺氧，加重心臟、肝臟損傷[12]。本組資料顯示，感染后第1天、第3天模型組小鼠CK-MB、CK-M、ALT水平較對(duì)照組顯著升高。對(duì)肺臟、心臟、肝臟組織病理變化的動(dòng)態(tài)觀察顯示，在感染后第1天、第3天模型組小鼠各臟器組織病理?yè)p傷明顯，尤以第1天損傷更為明顯。提示該模型可造成小鼠肺臟、心肌以及肝臟組織損傷。

在感染所致MODS的動(dòng)物模型研究方面，國(guó)內(nèi)外研究者也通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)建立了多種MODS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚13]。盛志勇等[14]根據(jù)復(fù)制MODS動(dòng)物模型的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合人類MODS診斷依據(jù)，曾提出過(guò)MODS診斷標(biāo)準(zhǔn)，但尚無(wú)統(tǒng)一和公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物MODS診斷標(biāo)準(zhǔn)的核心要求是動(dòng)物致傷24h后出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上器官功能障礙者即可考慮MODS動(dòng)物模型造模成功。國(guó)內(nèi)學(xué)者既往對(duì)MODS的研究主要集中在MODS的腸啟動(dòng)機(jī)制方面，提出了如盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)、大腸桿菌腹腔注射法、腸系膜上動(dòng)脈缺血法等方法制備MODS模型[15]，但對(duì)MODS的肺啟動(dòng)機(jī)制研究尚在探索階段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠感染后第1天、第3天，呼吸窘迫，肺組織病理?yè)p傷明顯；心肌酶CK-MB、CK-M水平均顯著高于對(duì)照組，心肌和肝臟組織病理?yè)p傷明顯。ALT、AST較對(duì)照組升高，提示心肌和肝功能損傷，但肝損傷相對(duì)較輕。提示，本實(shí)驗(yàn)中在肺炎克雷伯桿菌引起多器官功能障礙綜合征過(guò)程中肺臟、心臟、肝臟均有所損傷，以肺、心損傷程度較為明顯。因此，復(fù)制以肺功能障礙為首發(fā)的動(dòng)物模型，對(duì)于由肺炎或肺損傷引起的MODS研究可提供較好的基礎(chǔ)。

近年來(lái)，對(duì)MODS的認(rèn)識(shí)已由"感染"模式轉(zhuǎn)變?yōu)?炎癥"模式。研究發(fā)現(xiàn)，MODS的發(fā)病與急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)密切相關(guān)；而失控性全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是ALI→ARDS→MODS發(fā)展過(guò)程中共同的發(fā)病基礎(chǔ)[16]。肺部感染后，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，激活多種炎癥細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞，釋放大量的炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，釋放氧自由基和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物等，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)失控性SIRS，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起ALI，嚴(yán)重者導(dǎo)致ARDS，最終誘發(fā)MODS而死亡[17]。機(jī)體發(fā)生SIRS的同時(shí)還釋放大量?jī)?nèi)源性抗炎介質(zhì)，當(dāng)抗炎反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)時(shí)則發(fā)生"代償性抗炎癥反應(yīng)綜合征(Compensatory antiinflammatory response syndrome，CARS)"。若SIRA/CARS平衡，則內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；SIRA/CARS失衡，則引起組織和器官的損害?？傊?，SIRS、CARS均反應(yīng)了炎癥反應(yīng)失控，這是導(dǎo)致MODS發(fā)生的根本原因[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠在感染后第1天、第3天肺組織炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯升高，在感染后第1天即出現(xiàn)嚴(yán)重的組織病理?yè)p傷，尤以肺臟、心臟為主。

本實(shí)驗(yàn)采用氣管插管法滴入肺炎克雷伯桿菌后，迅速出現(xiàn)肺、心肌、肝臟的器官功能損傷，這一過(guò)程比較符合由肺炎發(fā)展而來(lái)的多器官功能障礙的臨床特征，適用于細(xì)菌性肺炎導(dǎo)致的MODS發(fā)病機(jī)制和臨床藥效學(xué)的研究。