云南切梢小蠹熱激蛋白20基因克隆及序列分析

楊誠 許玉 劉霞

摘要：【目的】對云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）成蟲熱激蛋白20基因（TynHSP20）進(jìn)行克隆和序列分析，為研究該蟲在高溫環(huán)境下的抗逆機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎胏DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆云南切梢小蠹成蟲TynHSP20基因cDNA序列，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】克隆獲得的TynHSP20基因cDNA序列長671 bp，含開放閱讀框597 bp，5'端非編碼序列和部分3'端非編碼序列分別為44和33 bp。該基因編碼198個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為22.50 kD，等電點(diǎn)為7.86，包含一個(gè)保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域。同源性比對分析結(jié)果表明，TynHSP20蛋白氨基酸序列與東亞飛蝗、蓼藍(lán)齒脛葉甲、斜紋夜蛾和美洲斑潛蠅的HSP20氨基酸序列相似性均低于20%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，TynHSP20與沙蔥螢葉甲的親緣關(guān)系較近?！窘Y(jié)論】成功克隆獲得TynHSP20基因cDNA序列，該基因具有小熱激蛋白家族的特征，但與其他物種小熱激蛋白的同源性較低。

關(guān)鍵詞： 云南切梢小蠹;HSP20基因;基因克隆;序列分析;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

中圖分類號： S763.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2425-07

Cloning and sequence analysis of heat shock protein 20 gene （TynHSP20） from Tomicus yunnanensis（Coleoptera：Scolytidae）

YANG Cheng， XU Yu， LIU Xia*

（College of Biodiversity Conservation and Utilization， Southwest Forestry University/Yunnan Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control， Kunming? 650224， China）

Abstract：【Objective】Cloning and sequence analysis of heat shock protein 20 gene（TynHSP20） from adult Tomicus yunnanensis were conducted to form molecular basis for the research on anti-adversity mechanisms of T. yunnanensis under high temperature environment. 【Method】The cDNA sequence of TynHSP20 gene from adult T. yunnanensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends technique（RACE） and bioinformatics analysis was conducted. 【Result】The obtained TynHSP20 gene cNDA sequence by cloning was 671 bp in length， which contained an open reading frame of 597 bp;thenoncoding sequences of 5'-end and a part of 3'-end were 44 and 33 bp respectively. TynHSP20 gene encoded 198 amino acids， with the predicted protein molecular weight of 22.5 kD and isoelectric point of 7.86， containing a conserved α-crystallin domain. Homology comparison analysis indicated that T. yunnanensis TynHSP20 protein amino acid sequence shared low（below 20%） similarity with the HSP20 amino acid sequence of Locusta migratoria， Gastrophysa atrocyanea， Spodoptera litura and Liriomyza sativae. The result of phylogenetic analysis showed that TynHSP20 had the clo-sest genetic relationship with Galerucadaurica. 【Conclusion】The TynHSP20 gene cDNA sequence is successfully obtained by cloning. TynHSP20 gene has the characteristic of small heat shock protein family， and has relatively low homology with the small heat shockprotein of otherspecies.

Key words：Tomicus yunnanensis; TynHSP20; gene cloning; sequence analysis; phylogenetic tree

0 引言

【研究意義】熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）又稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白（Heat stress protein），屬分子伴侶家族，廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)，在進(jìn)化上高度保守（馬文靜和馬紀(jì)，2012;司風(fēng)玲等，2016）。熱激蛋白除作為分子伴侶外，當(dāng)機(jī)體受到高溫、高壓、低溫、缺氧、紫外線、病原體感染、組織損傷、某些重金屬離子等不利環(huán)境或條件脅迫后，生物體通常大量表達(dá)該蛋白，從而起到抗脅迫的作用（孫衛(wèi)忠等，2003;張莉和劉吉平，2006;王建義和慈忠玲，2008）。此外，熱激蛋白還參與靶蛋白活性和功能的調(diào)節(jié)，主要涉及蛋白質(zhì)的折疊、裝配、跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物進(jìn)程，對蛋白質(zhì)在生物體的平衡具有重要作用（姜建軍等，2015;史彩華等，2017;Wu et al.， 2017）。依據(jù)熱激蛋白分子量、氨基酸序列和功能，可將其分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子熱激蛋白（Small heat shock protein， sHSP）（Gkouvitsas et a1.， 2009），其中，sHSP在生物體內(nèi)分布最廣、保守性最低，其分子量在12～43 kD，具有分子伴侶活性，可在環(huán)境脅迫下幫助蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)（張莉和劉吉平，2006;夏佳音和張耀州，2007;劉鵬等，2017）。當(dāng)機(jī)體受到刺激源刺激時(shí)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，部分變性的蛋白質(zhì)以一種不穩(wěn)定的狀態(tài)結(jié)合到sHSP上形成sHSP底物復(fù)合物，以避免集聚;當(dāng)恢復(fù)正常狀態(tài)后，部分變性蛋白從sHSP上解離下來，重新折疊成正確構(gòu)象（李雯，2009）。sHSP在昆蟲對溫度脅迫的耐受性方面扮演著重要角色，同時(shí)在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，如高溫和低溫脅迫下華山松大小蠹成蟲體內(nèi)sHSP基因表達(dá)變化顯著（石琦，2016），蔥蠅DaHSP23基因在其冬滯育和夏滯育發(fā)育過程中明顯上調(diào)表達(dá)（司風(fēng)玲等，2016）。因此，對sHSP基因進(jìn)行深入研究，除了具有闡明sHSP蛋白在昆蟲應(yīng)對高溫脅迫中的理論意義外，還有助于揭示昆蟲與環(huán)境信息交流的機(jī)制，為探索昆蟲抗逆性的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從原核生物到真核生物，sHSP已被證實(shí)在C末端有一段80～100個(gè)殘基的保守結(jié)構(gòu)域——α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)，可通過溫度依賴性結(jié)構(gòu)的變化增加其表面疏水性（于可明等，2009）。正常情況與應(yīng)激狀態(tài)下，sHSP均參與復(fù)雜而重要的生物學(xué)過程，如當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)sHSP對細(xì)胞損害的抵抗力增強(qiáng)，加速異常蛋白的降解，阻止蛋白間不必要的相互作用并幫助變性蛋白重新折疊（Haslbeck，2006）。目前，有關(guān)昆蟲sHSP基因的研究主要集中在基因克隆和定量表達(dá)等方面，羅素娟等（2010）克隆了家蠶（Bombyx mori）HSP23.7基因，并對該基因在家蠶5齡幼蟲不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在卵巢中表達(dá)量最高;孫濤等（2016）在白蠟蟲（Ericerus pela）泌蠟高峰期共鑒定到32個(gè)熱激蛋白非重復(fù)序列基因（Unigene），其中包含1個(gè)特異性的HSP20基因，且其相對表達(dá)量能被高溫誘導(dǎo);劉鵬等（2017）鑒定獲得舞毒蛾（Lymantria dispar）6個(gè)小分子熱激蛋白家族基因，并明確了smHSP基因?qū)⑾x劑甲萘威脅迫的響應(yīng)。云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）屬鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹屬（Tomicus），是嚴(yán)重危害云南松的次期性蛀干害蟲，主要分布在我國的西南地區(qū)（葉輝，2011;Zhu et a1.， 2012;王軍輝，2015）。該蟲在云南地區(qū)每年發(fā)生一代，4—12月為蛀梢期，新羽化的成蟲喜食嫩梢，一般只選擇健康的云南松梢補(bǔ)充營養(yǎng);12月—翌年3月為蛀干期，性成熟的成蟲只選擇樹勢衰弱的云南松樹干作為繁殖場所（Lieutier et al.，2015）。該蟲自20世紀(jì)80年代在云南中部大發(fā)生以來，現(xiàn)已擴(kuò)散至四川等地，累積因云南切梢小蠹為害致死的云南松林面積高達(dá)20萬ha（Lieutier et al.， 2015），給云南松林產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了松林產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)文明建設(shè)（王曉渭等，2014;俞琳鋒等，2017）。目前，國內(nèi)外有關(guān)云南切梢小蠹的研究主要集中在生態(tài)學(xué)和生物學(xué)等方面。呂軍等（2010）通過控制云南切梢小蠹蛀干密度，首次探討了自然條件下該害蟲的蛀干行為與危害情況;岳鋒等（2011）探討了云南松純林和云南松與藏柏、樟樹、滇青岡、旱冬瓜、麻櫟等樹種以塊狀混交、行間混交、株間混交等方式的混交林對云南切梢小蠹的抗性，結(jié)果表明，混交林對云南切梢小蠹的抗性強(qiáng)于云南松純林，云南松與藏柏和滇青岡混交林抗蟲性好，不同混交方式的抗蟲性以株間混交最好，行間混交次之，塊狀混交較差?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于云南切梢小蠹分子生物學(xué)方面的研究較少，其中sHSP是研究相對較少的一類蛋白質(zhì)分子?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆云南切梢小蠹成蟲TynHSP20基因cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)特征分析，為研究該蟲在高溫環(huán)境下的抗逆機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

在云南切梢小蠹為害較嚴(yán)重的曲靖云南松林區(qū)（曲靖市沾益區(qū)九龍山林場）選擇正在枝梢內(nèi)取食的切梢小蠹帶回實(shí)驗(yàn)室，剖開松枝，取出活成蟲，依據(jù)鞘翅斜面第二溝間部有無顆瘤、刻點(diǎn)排列方式等特征鑒定云南切梢小蠹（Kirkendall et al.， 2008;李霞等，2012）。將成蟲迅速放入裝有TRIzol試劑的PE管中，并將PE管及時(shí)放在冰盒內(nèi)，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑及儀器設(shè)備：TRIzol? Reagent購自Invitrogen公司;SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司;pGEM?-T載體購自Promega公司;PCR儀Veriti96型（Applied Biosystems）;高速冷凍離心機(jī)5804R型（Eppendorf）;超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo）;移液槍（Eppendorf）;凝膠成像儀GBOXiChemi型（Syngene）;電泳儀（北京市六一儀器廠）;電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取 操作步驟：（1）將已制備好成蟲材料的PE管放在冰盒上，待融化后加入200 μL TRIzol試劑，用電動研磨器充分研磨至粉末狀，加TRIzol補(bǔ)足至1.0 mL;（2）室溫下靜置5 min后，加入0.2 mL氯仿，用漩渦振蕩儀劇烈振蕩15 s，靜置5 min后離心15 min（4 ℃，12000 r/min）;（3）保留上清液并移至新的無RNase的1.5 mL離心管中，加入0.5 mL異丙醇，輕輕吹打混勻，室溫靜置10 min后離心10 min （4 ℃，12000 r/min）;（4）棄上清液，在沉淀中加入1.0 mL 75%乙醇，輕輕振蕩混勻，離心5 min（4 ℃，7600 r/min）;（5）棄上清液，室溫干燥后加入適量DEPC水溶解，所得產(chǎn)物即為總RNA。總RNA經(jīng)分光光度法測定其含量和純度后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1. 2. 2 TynHSP20基因5'-RACE擴(kuò)增 RACE-PCR參照陳德富和陳喜文（2006）的方法，以抽提的云南切梢小蠹成蟲總RNA為材料，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit合成5'-RACE cDNA模板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對云南切梢小蠹cDNA文庫測序獲得的HSP20基因3'-端序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5'-RACE-PCR特異性引物（5'-AGTAACGTG

ATTGGTGAG-3'），參照RACE試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶切膠回收并純化，用TA克隆法連接到pGEM?-T 載體上，并在42 ℃熱激90 s后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在X-Gal和IPTG誘導(dǎo)下，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆送至金思特科技（南京）有限公司測序。

1. 2. 3 序列分析 采用SeqMan將測序獲得的HSP20核苷酸序列進(jìn)行拼接，BLASTx進(jìn)行序列同源比對分析，利用在線軟件ORF Finder預(yù)測開放閱讀框（Opening reading frame，ORF），SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測，Motifscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，DNAMAN預(yù)測其分子量及等電點(diǎn)，運(yùn)用Genetyx-MIN 5.1將其基因核苷酸序列推導(dǎo)成氨基酸序列，ClustalX 1.83和Gene-Doc進(jìn)行多序列比對，使用MEGA 5.0中的鄰接法（Neighbour Joining，N-J）構(gòu)建不同昆蟲HSP20基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TynHSP20基因克隆與序列分析結(jié)果

5'-RACE擴(kuò)增后，目的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收，連接至pGEM?-T載體后，隨機(jī)挑取20個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果通過BLASTx比對分析，發(fā)現(xiàn)僅有1條為HSP20基因序列。將已知的3'端序列和5'-RACE擴(kuò)增所得目的基因片段拼接后，即獲得云南切梢小蠹TynHSP20基因（GenBank登錄號：MH67434）序列671 bp，ORF為597 bp，5'端非編碼序列和部分3'端非編碼序列分別為44和33 bp（圖1）。該基因編碼198個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量和等電點(diǎn)分別為22.50 kD和7.86。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，TynHSP20蛋白的氨基酸序列中有一個(gè)依賴于3'-5'-環(huán)化核苷酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（RKIS150-153）、3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（TSTE88-91、SKFE144-147和SIPE153-156）和2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（STR30-32和TYK166-168）。對TynHSP20蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其極性氨基酸含量占62.6%，預(yù)測該蛋白具有較強(qiáng)的親水性。

BLASTp比對分析結(jié)果顯示，TynHSP20蛋白包含一個(gè)保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（α-crystallin）（圖2），屬于12～43 kD的sHSP家族。該家族成員作為分子伴侶時(shí)不依賴ATP，以形成大的聚合物形式行使其功能，能阻止蛋白質(zhì)聚集并與其他熱激蛋白共同參與蛋白質(zhì)的正確折疊。利用SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白不具有信號肽（圖2）。

2. 2 TynHSP20蛋白同源性分析結(jié)果

在NCBI中搜索東亞飛蝗（Locusta migratoria）、蓼藍(lán)齒脛葉甲（Gastrophysa atrocyanea）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）和美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）等昆蟲的HSP20蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示TynHSP20蛋白與東亞飛蝗、蓼藍(lán)齒脛葉甲、斜紋夜蛾和美洲斑潛蠅的HSP20蛋白的氨基酸序列相似性不高，分別為11%、13%、15%和16%，均低于20%（圖3）。為研究TynHSP20蛋白與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系，采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖4可看出，不同物種HSP20蛋白被明顯分為2個(gè)分支，即鱗翅目聚為一支，直翅目、雙翅目和鞘翅目聚為一支，其中云南切梢小蠹與同為鞘翅目的沙蔥螢葉甲親緣關(guān)系較近。

3 討論

隨著全球氣候變暖及極端高溫天氣的不斷出現(xiàn)，昆蟲對高溫天氣的耐熱性及其機(jī)理已成為近年來昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題（馬罡和馬春森，2016）。昆蟲作為典型的變溫動物，其對體內(nèi)溫度的維持和調(diào)節(jié)能力較弱，環(huán)境溫度是影響昆蟲生命活動的重要因素（史彩華等，2017）。多種逆境條件（如高溫、低溫、干旱和澇害等）均可誘導(dǎo)sHSP基因的表達(dá)，說明sHSP是昆蟲應(yīng)對逆境的重要應(yīng)激蛋白，與昆蟲的抗逆性密切相關(guān)（周永剛等，1996）。大部分昆蟲的HSP20基因在機(jī)體受到溫度脅迫時(shí)發(fā)揮重要抗脅迫功能，如從二化螟中分離鑒定出的HSP20基因在進(jìn)行高低溫刺激后檢測發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量均明顯增加（Lu et al.， 2014）;Liu等（2014）在前期研究中發(fā)現(xiàn)白蠟蟲HSP20對溫度變化敏感，進(jìn)一步推測其在白蠟蟲2齡雄蟲對溫度耐受性的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用（孫濤等，2016）。

本研究以云南切梢小蠹為對象，利用RACE技克隆獲得該害蟲的TynHSP20基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其ORF序列長度為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果顯示，TynHSP20與沙蔥螢葉甲的親緣關(guān)系較近。親、疏水性是由蛋白的氨基酸序列決定，TynHSP20的親水性強(qiáng)反映其極性氨基酸數(shù)量較多，是具有分子伴侶活性sHSP的基本特征，這一性質(zhì)可幫助sHSP形成大寡聚體而不會聚集沉淀（Haslbeck，2006）。含有信號肽的蛋白質(zhì)一般能被分泌到細(xì)胞外，本研究使用SignalP 4.1蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測工具分析結(jié)果表明TynHSP20蛋白不具有信號肽。

sHSP的主要結(jié)構(gòu)由N端域和C端域兩部分組成，C端域含有一個(gè)相當(dāng)保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域，是sHSP家族成員所共有的結(jié)構(gòu)域，在同物種sHSP間高度保守，甚至在不同物種間也具有很高的保守性（夏佳音和張耀州，2007）;N端域在同一物種間具有相對保守性，而在不同物種間無保守性，多變的N端域能調(diào)節(jié)低聚反應(yīng)，其與形成大的低聚體復(fù)合物及伴侶活性有關(guān)（Kundu et al.， 2007）。N端域和C端域在序列上高度可變，且這兩部分對于sHSP形成寡聚體結(jié)構(gòu)及發(fā)揮功能至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，云南切梢小蠹TynHSP20蛋白包含一個(gè)保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域，但C末端并不齊全，缺少部分尾巴poly（A）序列。sHSP是一個(gè)極多樣的群體，不同的組織有著不同數(shù)目的sHSP，如從啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）單一的sHSP到高等植物的30多種sHSP（Kitagawa et al.，2000;Tada et al.，2000）;在分子量上也存在明顯差異，如從線蟲的16 kD到原生動物血吸蟲（Schistosoma mansoni）的40 kD（Kanamura et al.，2002;Hartwig et al.，2009），甚至在同種內(nèi)也可觀察到其多樣性，以及在序列上具有的差異。本研究通過同源序列多重比對分析發(fā)現(xiàn)，TynHSP20蛋白氨基酸序列與4個(gè)已報(bào)道的其他昆蟲（東亞飛蝗、蓼藍(lán)齒脛葉甲、斜紋夜蛾和美洲斑潛蠅）的HSP20氨基酸序列間具有一定的保守性，但相似性很低，與前人的研究結(jié)果相似，即不同物種之間小熱激蛋白序列相似性一般都很低（Taylor and Benjamin，2005）。本研究克隆云南切梢小蠹TynHSP20基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探討HSP20基因的抗逆性機(jī)制打下基礎(chǔ)，但有關(guān)該基因?qū)囟茸兓捻憫?yīng)與調(diào)控作用還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié)論

云南切梢小蠹TynHSP20基因C端域含有α-晶體蛋白，具有12～43 kD小熱激蛋白家族的特征，序列同源性分析結(jié)果表明HSP20基因具有較低的保守性。本研究為了解云南切梢小蠹小熱激蛋白的生物功能提供了分子基礎(chǔ)，對下一步研究該蛋白的功能具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

陳德富，陳喜文. 2006. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社：225-230. [Chen D F， Chen X W. 2006. Modern Molecular Biology Experimental Principles and Techniques[M].Beijing： Science Press：225-230.]

姜建軍，王鳳英，黃立飛，陳紅松，李磊，楊朗. 2015. 瓜實(shí)蠅熱激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，46（5）：800-805. [Jiang J J，Wang F Y，Huang L F，Chen H S，Li L，Yang L. 2015. Cloning and sequence analysis of heat shock protein gene（hsp70） from Bactrocera cucurbitae Coquillett[J]. Journal of Southern Agriculture，46（5）：800-805.]

李雯. 2009. 熱應(yīng)激蛋白抗應(yīng)激機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，36（11）：28-29. [Li W. 2009. Research progress of heat stress proteins anti-stress mechanism[J]. Sichuan Animal & Veterinary Sciences， 36（11）：28-29.]

李霞，張真，曹鵬，王鴻斌，韓平定. 2012. 切梢小蠹屬昆蟲分類鑒定方法[J]. 林業(yè)科學(xué)，48（2）：110-116. [Li X， Zhang Z，Cao P，Wang H B，Han P D. 2012. Classification of Tomicus species[J]. Scientia Silvae Sinicae，48（2）：110-116.]

羅素娟，楊慧鵬，李軼女，張志芳，張耀洲. 2010. 家蠶小熱激蛋白家族成員Hsp23.7基因的克隆與分析[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，47（3）： 467-471. [Luo S J，Yang H P，Li Y N， Zhang Z F，Zhang Y Z. 2010. Cloning and analysis of small heat-shock gene Hsp23.7 from Bombyx mori[J].Chinese Bulletin of Entomology，47（3）：467-471.]

劉鵬，孫麗麗，張琪慧，曹傳旺. 2017. 舞毒蛾小分子熱激蛋白基因分析及對甲萘威脅迫的響應(yīng)[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（1）：78-84. [Liu P，Sun L L，Zhang Q H，Cao C W. 2017. Analysis of smHsp genes in Lymantria dispar and its response to carbaryl stress[J]. Journal of Beijing Forestry University，39（1）：78-84.]

呂軍，葉輝，段焰青，廖周瑜，母其愛. 2010. 云南切梢小蠹對云南松樹的蛀干危害及致死機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，30（8）：2100-2104. [Lü J，Ye H，Duan Y Q，Liao Z Y，Mu Q A. 2010. On trunk attacks and the killing mechanism of Tomicus yunnanensis（Coleoptera： Scolytinae） on Pinus yunnanensis trees[J]. Acta Ecologica Sinica，30（8）：2100-2104.]

馬文靜，馬紀(jì). 2012. 小胸鱉甲熱激蛋白基因（Mphsp70）的克隆、序列分析及溫度對其表達(dá)的影響[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，49（2）：439-447. [Ma W J， Ma J. 2012. Cloning and sequence analysis of a heat shock protein gene（Mphsp70）from Microdera punctipennis and its expression in relation to high temperatures[J]. Chinese Journal of Applied Entomology， 49（2）：439-447.]

馬罡，馬春森. 2016. 氣候變化下極端高溫對昆蟲種群影響的研究進(jìn)展[J]. 中國科學(xué)：生命科學(xué)，46（5）：556-564. [Ma G， Ma C S. 2016. Advances in research on the effect of extreme high temperature on insect population under climate change[J]. Scientia Sinica（Vitae）， 46（5）：556-564.]

司風(fēng)玲，何正波，陳斌. 2016. 蔥蠅熱激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滯育和夏滯育蛹中的表達(dá)分析（英文）[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，59（4）：402-410. [Si F L，He Z B，Chen B. 2016. Cloning and expression profiling of heat shock protein DaHSP23 gene in the winter and summer diapause pupae onion maggot，Delia antique（Diptera：Anthomyiidae）[J]. Acta Entomologica Sinica，59（4）：402-410.]

孫衛(wèi)忠，李斌，王彥文，柴春利，魯成. 2003. 熱激蛋白研究進(jìn)展[J]. 蠶學(xué)通訊，23（1）：21-27. [Sun W Z，Li B，Wang Y W，Chai C L，Lu C. 2003. Research progress of heat stress proteins[J]. Newsletter of Sericultural Science，23（1）：21-27.]

孫濤，王雪慶，趙遵嶺，于淑慧，陳曉鳴，劉魏魏，亓倩，楊璞. 2016. 白蠟蟲熱激蛋白序列分析[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，29（5）：778-783. [Sun T，Wang X Q，Zhao Z L，Yu S H， Chen X M，Liu W W，Qi Q，Yang P. 2016. Sequence analysis of heat shock protein of Ericerus pela[J]. Forest Research，29（5）：778-783.]

史彩華，胡靜榮，張友軍. 2017. 高溫對昆蟲生殖生理的影響及其在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的展望[J]. 中國植保導(dǎo)刊，37（3）：24-32. [Shi C H，Hu J R，Zhang Y J. 2017. Effects of heat stress on insect reproduction-physiology and outlook in agricllltural insect pests control[J]. China Plant Protection， 37（3）：24-32.]

石琦. 2016. 華山松大小蠹熱激蛋白基因克隆與定量表達(dá)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).[Shi Q. 2016. Cloning and expression analysis of heat shock protein genes from Dendroctonus armandi[D]. Yangling：Northwest A&F University.]

王建義，慈忠玲. 2008. 熱激蛋白的研究進(jìn)展[J]. 山西林業(yè)科技，3（1）：27-32. [Wang J Y，Ci Z L. 2008. Advances in study of heat shock protein[J]. Shanxi Forestry Science and Technology，3（1）：27-32.]

王曉渭，袁瑞玲，焦曉旭，陳鵬. 2014. 云南切梢小蠹及其伴生真菌的研究進(jìn)展[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，43（5）：153-159.[Wang X W，Yuan R L，Jiao X X，Chen P. 2014. Pro-gress of Tomicus yunnanensis and its associated fungi study[J]. Journal of West China Forestry Science，43（5）：153-159.]

王軍輝. 2015. 三種切梢小蠹化學(xué)生態(tài)學(xué)關(guān)系研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院. [Wang J H. 2015. Chemical ecological relationships of three Tomicus species[D]. Beijing： Chinese Academy of Forestry.]

夏佳音，張耀州. 2007. 小熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，23（11）：911-915. [Xia J Y， Zhang Y Z. 2007. Structure and function of small heat shock proteins[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 23（11）：911-915.]

于可明，王海山，陳文博，伊男，李楠，何瑩，張悅. 2009. 小熱休克蛋白家族的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，15（5）：49-51. [Yu K M，Wang H S，Chen W B，Yi N，Li N，He Y，Zhang Y. 2009. Research advances in the small heat shock protein family in plants[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 15（5）：49-51.]

岳鋒，楊斌，馮丹，周希偉. 2011. 云南松混交林抗云南切梢小蠹的效果研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（4）：159-161. [Yue F， Yang B， Feng D， Zhou X W. 2011. Study on the effect of mixed forest of Pinus yunnanensis on Tomicus yunnanensis[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 39（4）：159-161.]

葉輝. 2011. 云南切梢小蠹[M]. 昆明：云南科技出版社. [Ye H. 2011. Tomicus yunnanensis[M]. Kunming：Yunnan Science and Technology Press.]

俞琳鋒，黃華國，澤桑梓，任利利，宗世祥，盧文娟，駱有慶. 2017. 云南松林兩種切梢小蠹成蟲蛀梢期的空間分布格局[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，54（6）：940-946. [Yu L F，Huang H G，Ze S Z，Ren L L，Zong S X，Lu W J，Luo Y Q. 2017. Research on the spatial distribution patterns of Tomi-cus sp. in Pinus yunnanensis during the shoot feeding period[J]. Chinese Journal of Applied Entomology，54（6）：940-946.]

周永剛， 祝其鋒， 楊于嘉. 1996. 一些與熱休克蛋白有關(guān)的生物功能[J]. 國外醫(yī)學(xué)（生理、病理科學(xué)與臨床分冊），16（4）：286-289. [Zhou Y G，Zhu Q F，Yang Y J. 1996. Some of the biological functions associated with heat shock proteins[J]. Foreign Medical Sciences（Section of Pathophysiology and Clinical Medicine），16（4）：286-289.]

張莉，劉吉平. 2006. 熱激蛋白研究進(jìn)展[J]. 廣東蠶業(yè)，40（2）：39-42. [Zhang L，Liu J P. 2006. Research progress of heat stress proteins[J]. Guangdong Sericlture， 40（2）：39-42.]

Gkouvitsas T，Kontogiannatos D，Kontogiannatos A. 2009. Hsp70 gene is induced during deep larval diapause in the moth Sesamia nonagrioides[J]. Insect Molecular Biology， 18（2）： 253-264.

Haslbeck M. 2006. Recombinant expression and in vitro refolding of the yeast small heat shock protein Hsp42[J]. International Journal of Biological Macromolecules，38（2）： 107-114.

Hartwig K， Heidler T， Moch J， Daniel H， Wenzel U. 2009. Feeding a ROS-generator to Caenorhabditis elegans leads to increased expression of small heat shock protein HSP-16.2 and hormesis[J]. Genes & Nutrition， 4（1）：59-67.

Kundu M， Sen P C， Das K P. 2007. Structure， stability， and chaperone function of alphaA-crystallin： Role of N-terminal region[J]. Biopolymers， 86（3）： 177-192.

Kirkendall L R， Faccoli M， Ye H. 2008. Description of the Yunnan shoot borer， Tomicus yunnanensis Kirkendall & Faccoli sp. n.（Curculionidae， Scolytinae）， an unusually aggressive pine shoot beetle from southern China， with a key to the species of Tomicus[J]. Zootaxa， 1819： 25-39.

Kitagawa M，Matsumura Y，Tsuchido T. 2000. Small heat shock proteins， IbpA and IbpB， are involved in resistances to heat and superoxide stresses in Escherichia coli[J]. Fems Microbiology Letters， 184（2）：165-171.

Kanamura H Y，Hancock K，Rodrigues V，Damian R T. 2002. Schistosoma mansoni heat shock protein 70 elicits an early humoral immune response in S. mansoni infected baboons[J]. Memo?rias Do Instituto Oswaldo Cruz，97（5）：711-716.

Tada Y， Wakasugi T，Nishikawa A，F(xiàn)uruhashi K，Yamada K. 2000. Developmental regulation of a gene coding for a low-molecular-weight heat shock protein during hausto-rium formation in the seedlings of a holoparasitic plant， Cuscuta japonica[J]. Plant & Cell Physiology，41（12）：1373-1380.

Taylor R P，Benjamin I J. 2005. Small heat shock proteins： a new classification scheme in mammals[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology， 38（3）：433-444.

Lieutier F，Ye H，Yart A. 2015. Shoot damage by Tomicus sp. （Coleoptera： Scolytidae） and effect on Pinus yunnanensis resistance to subsequent reproductive attacks in the stem[J]. Agricultural and Forest Entomology，5：227-233.

Liu W W，Yang P，Chen X M，Xu D L，Hu Y H. 2014. Cloning and expression analysis of four heat shock protein genes in Ericerus pela（Homoptera：Coccidae）[J]. Journal of Insect Science，14（1）：142-150.

Lu M X，Hua J，Cui Y D，Du Y Z. 2014. Five small heat shock protein genes from Chilo suppressalis： Characteristics of gene， genomic organization， structural analysis， and transcription profiles[J]. Cell Stress & Chaperones， 19 （1）：91-104.

Wu J M，Liu T E，Rios Z，Mei Q B，Lin X K，Cao S S. 2017. Heat shock proteins and cancer[J]. Trends in Pharmacological Sciences， 38（3）： 226-256.

Zhu J Y，Zhao N，Yang B. 2012. Global transcriptome profi-ling of the pine shoot beetle，Tomicus yunnanensis（Coleoptera： Scolytinae）[J]. PLoS One，7（2）： e32291.