桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內可培養(yǎng)細菌分離鑒定及多樣性分析

王蕊蕊 胡穎 楊振德 郭春暉 朱林慧 鄭霞林 玉舒中

摘要：【目的】明確桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）體內可培養(yǎng)細菌多樣性，為利用微生物防治該害蟲打下基礎?！痉椒ā坷脗鹘y(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)與鑒定方法，結合16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，對剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內可培養(yǎng)細菌進行多樣性分析?！窘Y果】從桉樹枝癭姬小蜂體內分離出11株細菌，經(jīng)鑒定歸類于3個門（厚壁菌門、放線菌門和變形菌門）3個綱（芽孢桿菌綱、放線菌綱和γ-變形菌綱）4個目（芽孢桿菌目、微球菌目、乳酸桿菌目和腸桿菌目）8個科（芽孢桿菌科、微桿菌科、葡萄球菌科、乳酸桿菌科、纖維單胞菌科、微球菌科、腸桿菌科和類芽孢桿菌科）8個屬（芽孢桿菌屬、微桿菌屬、葡萄球菌屬、片球菌屬、纖維單胞菌屬、微球菌屬、埃希氏桿菌屬和類芽孢桿菌屬），其中，厚壁菌門（Firmicutes）6株，為優(yōu)勢類群;芽孢桿菌屬（Bacillus）3株，為優(yōu)勢菌屬?！窘Y論】桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌具有豐富的多樣性。

關鍵詞： 桉樹枝癭姬小蜂;雌成蟲;可培養(yǎng)細菌;細菌多樣性

中圖分類號： S718.83? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2432-08

Isolation， identification and diversity of culturable bacteria in female adults of Leptocybe invasa Fisher & La Salle

WANG Rui-rui1， HU Ying1， YANG Zhen-de1，2*， GUO Chun-hui1， ZHU Lin-hui1，

ZHENG Xia-lin3， YU Shu-zhong1

（1College of Forestry， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Guangxi Key Laboratory of Forestry Ecology and Conservation， Nanning? 530004， China; 3College of Agriculture， Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】The diversity of culturable bacteria in Leptocybe invasa Fisher & La Salle was clarified to lay a foundation for microbiological control on the pest. 【Method】Traditional methods of bacterial isolation， culture and identification combined with 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis were used for the study on the diversity of culturable bacteria in the female adults of L. invasa that were newly emerged. 【Result】Eleven strains of bacteria were isolated from the sexually matured female L. invasa， belonging to three phyla（Firmicutes， Actinobacteria and Proteobacteria）， three classes（Bacilli， Actinobacteria and Gammaproteobacteria）， four orders（Bacillales， Micrococcales，Lactobacillales and Enterobacterales）， eight families（Bacillacea， Microbacteriaceae， Staphylococcaceae， Lactobacillaceae， Cellulomonadaceae， Micrococcaceae， Enterobacteriaceae and Paenibacillaceae） and eight genera（Bacillus， Microbacterium，Staphylococcus， Pediococcus， Cellulomonas， Microbacterium， Escherichia and Paenibacillus）， among which Firmicutes（six strains） was the dominant bacterium and Bacillus（three strains） was the dominant genus. 【Conclusion】The diversity of culturable bacteria in L. invasa is rich.

Key words：? Leptocybe invasa Fisher & La Salle; female adults; culturable bacteria; bacterial diversity

0 引言

【研究意義】桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）隸屬膜翅目（Hymenoptera）小蜂總科（Chalcidoidea）姬小蜂科（Eulophidae），是一種嚴重危害桉屬（Eucalyptus）植物枝葉的外來入侵致癭性害蟲（Mendel et al.，2004）。該害蟲原產(chǎn)于澳大利亞，2000年在中東地區(qū)及地中海沿岸國家首次暴發(fā)，因其繁殖速度快、世代重疊、暴發(fā)期長，現(xiàn)已擴散至亞洲、非洲、歐洲及北美洲等地區(qū)的26個國家，給桉樹生產(chǎn)造成巨大損失，是目前國際上高度重視的桉樹危險性害蟲（Zheng et al.，2014）。鑒于昆蟲體內細菌對其宿主生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、生殖、行為、免疫、抗逆及抗藥等發(fā)揮的重要作用，同時在害蟲防治、昆蟲資源開發(fā)及生物能源生產(chǎn)等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力（Hosokawa et al.，2016;王四寶和曲爽，2017;張振宇等，2017），因此，研究桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的組成和多樣性有助于進一步探明其體內可培養(yǎng)細菌的功能，為利用微生物防治法控制該害蟲提供理論基礎。【前人研究進展】近年來，隨著微生態(tài)學理論及實踐范圍的不斷擴大，有關昆蟲腸道微生物的研究日益增多。夏曉峰等（2013）利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法從小菜蛾（Plutella xylostella）3齡幼蟲中腸分離得到8株細菌，分屬于沙雷氏菌屬（Serratia）、腸桿屬（Enterobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomononas）和香味菌屬（Myroides）4個屬。Nugnes等（2015）利用Wolbachia、Cardinium、Rickettsia、Spiroplasma和Arsenophonus特異性引物分別對雌、雄桉樹枝癭姬小蜂體內微生物總DNA進行PCR擴增，變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析發(fā)現(xiàn)只有Rickettsia存在于其體內，并影響桉樹枝癭姬小蜂的生殖能力。劉小改等（2016）對稻縱卷葉螟[Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）]4齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA V3-V4變異區(qū)進行測序分析，發(fā)現(xiàn)其腸道細菌多樣性較豐富，不同樣本數(shù)量間微生物群落結構和多樣性存在明顯差異，其中類諾卡氏屬（Nocardioides）和鞘脂單胞菌（Sphingomonas）為4個樣本的共有優(yōu)勢屬。李文丹等（2018）采用16S rDNA文庫隨機測序法對甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]初孵和1日齡幼蟲整個蟲體、3齡和5齡幼蟲中腸細菌進行調查分析，發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾中腸存在多種共生細菌，其中不動桿菌屬（Acinetobacter）為優(yōu)勢共生菌，且不同的發(fā)育時期其共生菌種類與相對豐度存在明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前對桉樹枝癭姬小蜂體內微生物的研究僅采用DGGE分析方法檢測其體內是否具有與生殖相關的菌株，而對桉樹枝癭姬小蜂體內細菌群落組成、多樣性及各菌株生態(tài)功能的研究尚無文獻報道?！緮M解決的關鍵問題】桉樹枝癭姬小蜂多為雌性，大多數(shù)雌蜂在破癭出蜂前已攜帶成熟蜂卵，是一種孤雌生殖昆蟲，雄蜂難以捕獲。本研究利用傳統(tǒng)微生物分離鑒定與16S rDNA序列分析相結合的方法，對桉樹枝癭姬小蜂冬季雌成蟲體內可培養(yǎng)細菌進行分離和鑒定，以了解其體內可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢種群及多樣性，為更好地開發(fā)基于共生關系調控或對內共生菌進行基因改造的“抑菌防蟲”生物防治新技術打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試蟲源：2017年12月18日采自廣西大學林學院教學實驗基地露地環(huán)境的網(wǎng)棚中[東經(jīng)108°17′，北緯22°51′;溫度（10±1）℃，相對濕度（35±5）%]單株栽培的巨園桉無性系（DH201-2）植株上剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲。培養(yǎng)基原料、細菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂和Gold View核酸染料及其他分析純試劑均購自南寧市羽瑞生物試劑經(jīng)營部，引物（27F和1492R）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA Marker、2×EayTaq PCR SuperMix（+dye）購自北京全式金生物技術有限公司。

1. 2 桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的分離與純化

無菌條件下隨機選取剛羽化的健康桉樹枝癭姬小蜂雌蟲20只，先用無菌水清洗，隨后放入75%酒精中進行蟲體表面消毒1 min，取出蟲體用無菌水清洗殘留酒精，轉入1‰ HgCl2浸泡3 min后，移至無菌水清洗5～6次，在無菌勻漿器中加入已滅菌的蟲體和1.0 mL無菌水，充分研磨制成組織勻漿液，將勻漿液迅速10倍梯度稀釋成10-1～10-5，各稀釋度取0.1 mL菌液，用無菌涂布棒均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，每個稀釋度重復10次。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)72 h，每隔24 h觀察其生長狀況，用接種環(huán)挑取顏色、形態(tài)、大小各不相同的單菌落，在新的NA培養(yǎng)基上進行數(shù)次四區(qū)劃線分離，直至得到純的單克隆菌株，同時按可數(shù)性原則對每個培養(yǎng)基上不同菌落進行計數(shù)，將純化后的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基并加入25%甘油于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 可培養(yǎng)細菌群的鑒定

1. 3. 1 形態(tài)學和生理生化特性鑒定 根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對分離所得的菌株進行菌體形態(tài)觀察、染色反應、培養(yǎng)性狀和生理生化測定。

1. 3. 2 細菌DNA抽提及16S rDNA序列片段擴增 采用細菌基因組DNA抽提試劑盒分別提取所有供試菌株的總DNA，操作步驟按說明進行。以各細菌提取的DNA為模板，使用細菌通用引物：正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系30.0 ?L：2× EayTaq PCR SuperMix（+dye）15.0 ?L，27F（32P）0.5 ?L，1492R（32P）0.5 ?L，DNA模板2.0 ?L，ddH2O 12.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并使用凝膠回收試劑盒純化后送至北京睿博興科生物技術有限公司測序。

1. 3. 3 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序所得的16S rDNA序列在EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）進行比對，并結合RDP seqmatch和RDP Classifier在線比對分析，確定各菌株屬以上的分類單位及同源序列，采用ClustalX程序進行多序列匹配排列，使用MEGA 5.0中的鄰位相連Neighbor-joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，各分支的Bootstrap置信度用1000次自導復制評價（Tamura et al.，2011）。

1. 3. 4 桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌多樣性分析 細菌多樣性分析參數(shù)Margalef豐富度指數(shù)（D'）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）和Pielou均勻度指數(shù)（J）等均用Excel 2013進行計算。

N=[Ni]

D'=[S-1lnN]

D=1-[P2i]

H'=-[PilnPi]

J=H'/lnS

式中，Ni為物種i的個體數(shù)，N為群落中所有物種的總個體數(shù)，S為物種總數(shù)，Pi為物種i的個體數(shù)占全部個體數(shù)的比例。

2 結果與分析

2. 1 可培養(yǎng)細菌菌體形態(tài)和培養(yǎng)性狀

通過對桉樹枝癭姬小蜂冬季雌成蟲體內可培養(yǎng)細菌的分離、純化培養(yǎng)，共獲得11株不同的單克隆菌株（圖1），各菌株形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀見表1。將供試菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，按照革蘭氏染色法區(qū)別11株細菌菌株，結果發(fā)現(xiàn)有10株呈革蘭氏陽性反應，1株呈革蘭氏陰性反應。經(jīng)油鏡觀察發(fā)現(xiàn)7株菌株為桿狀，4株菌株為圓球狀;4株有芽孢，7株無芽孢;5株周生鞭毛，6株無鞭毛;所有菌株均有莢膜。

2. 2 可培養(yǎng)細菌的生理生化特性

對11株菌株進行3種碳素化合物、4種氮素化合物和7種酶生理生化特性鑒定，結果（表2）顯示，11株菌株均屬于糖、醇類發(fā)酵型，不產(chǎn)生色氨酸脫氨酶和苯丙氨酸脫氨酶;除N6號菌株外，其余菌株均能產(chǎn)生過氧化氫酶;除N4號菌株外，其余菌株均不產(chǎn)生吲哚。

2. 3 可培養(yǎng)細菌鑒定及多樣性分析結果

綜合各菌株培養(yǎng)性狀、菌體形態(tài)、染色反應和生理生化反應等各項指標，共鑒定出8個屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pedioco-ccus）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。由表3可知，桉樹枝癭姬小蜂體內各菌株的數(shù)量差異較大，其中芽孢桿菌屬數(shù)量最多。對桉樹枝癭姬小蜂體內細菌多樣性進行分析，結果表明，D'=0.62，D=0.65，H'=1.36，J=0.57。因此，桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌多樣性豐富，可通過免培養(yǎng)法對桉樹枝癭姬小蜂體內細菌多樣性信息進行補充和完善。

2. 4 可培養(yǎng)細菌16S rDNA序列的PCR擴增結果

采用27F和1492R細菌通用引物擴增桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的16S rDNA序列，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的細菌16S rDNA序列片段如圖2所示，均在1500 bp左右。

2. 5 可培養(yǎng)細菌的16S rDNA序列分析結果

將所測得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對，結合RDP數(shù)據(jù)庫Classifier分析，從桉樹枝癭姬小蜂體內分離獲得的11株細菌分屬于厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），共涉及8個屬，其中3株（N1、N2和N3）屬于芽孢桿菌屬，2株（N8和N10）屬于微球菌屬，N5屬于葡萄球菌屬，N6屬于片球菌屬，N11屬于類芽孢桿菌屬，N4屬于微桿菌屬，N7屬于纖維單胞菌屬，N9屬于埃希氏桿菌屬（表4）?？梢?，16S rDNA序列鑒定結果與綜合細菌培養(yǎng)性狀、菌體形態(tài)、染色反應和生理生化特性等各項指標的鑒定結果基本一致，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。

2. 6 可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化分析結果

將測序得到的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內可培養(yǎng)細菌的16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析。結果（圖3）顯示，桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌可歸類于8個屬，分別在進化樹上形成獨立的分支，其中芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、片球菌屬和類芽孢桿菌屬形成一個以厚壁菌門為家族的大分枝，該4個屬的細菌均為芽孢桿菌綱（Bacilli），其中芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和類芽孢桿菌屬分別屬于孢桿菌目（Bacillales）的芽孢桿菌科（Bacillaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）;片球菌屬屬于乳酸桿菌目（Lactobacillales）的乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）;微桿菌屬、纖維單胞菌屬和微球菌屬形成一個以放線菌門（Actinobacteria）為家族的分支，該3個屬的細菌均為放線菌綱（Actinobacteria），分別屬于微球菌目（Micrococcales）的微桿菌科（Microbacteriaceae）、纖維單胞菌科（Cellulomonadaceae）和微球菌科（Micrococca-ceae）;埃希氏桿菌屬獨自形成一個以變形菌門為家族的分支，該屬為腸桿菌目（Enterobacterales）的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）。系統(tǒng)發(fā)育進化分析進一步支持了RDP Classiffier分類結果。

3 討論

桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化分析結果顯示，11株細菌中有6株歸類于厚壁菌門，4株歸類于放線菌門，1株歸類于變形菌門，說明在門水平上厚壁菌門和放線菌門是冬季桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌群，暗示這兩類細菌可能對冬季桉樹枝癭姬小蜂的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝及免疫等產(chǎn)生重要影響。在已報道的昆蟲如鱗翅目的棉鈴蟲（Helicoverpa armigera H?bner）（Xiang et al.，2006）、家蠶（Bombyx mori Linnaeus）（相輝等，2007）、貢嘎蝠蛾（Hepjalus gonggaensis Fu & Huang）（劉莉等，2008）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）（孫博通等，2017）及膜翅目蜜蜂屬（Apis）（王洪秀等，2017）和鞘翅目的光背天牛（Anoplophora glabripennis）（Schloss et al.，2006）等的腸道優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門和變形菌門，說明這兩類細菌普遍存在于大多數(shù)昆蟲體內，且對宿主產(chǎn)生作用。不同昆蟲或同種昆蟲不同蟲態(tài)、性別、生境等其體內可培養(yǎng)細菌種類不同，昆蟲體內可培養(yǎng)細菌的組成和結構與宿主的種類、食性和環(huán)境有著密切聯(lián)系（魏丹峰等，2017;楊曉晴等，2018）。本研究從桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內只分離到1株變形菌門細菌，可能是越冬時期氣溫較低，桉樹枝癭姬小蜂生命活動較弱，體內細菌種類較少;也可能是受到培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制。

芽孢桿菌屬繁殖力強，種群多，能產(chǎn)生抗生素、纖維素酶、細胞壁降解酶、蛋白酶和脂肪酶等，對昆蟲消化吸收和防御起到至關重要的作用（周艷玲等，2017）。Douglas（2015）研究發(fā)現(xiàn)埃希菌屬和葡萄球菌屬可參與家蠶的免疫反應;孫博通等（2017）研究表明，微桿菌屬具有很強的苯酚降解能力，可抵抗植物有毒次生代謝物質，進而拓展宿主食性范圍。茶長卷葉蛾（Homona magnanima）腸道中的葡萄球菌屬可抑制入侵宿主體內的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）生長與繁殖（Takatsuka and Kunimi，2000）。類芽孢桿菌屬可產(chǎn)生抗菌蛋白、肽類物質及酶活性物質等抗菌物質，具有較強的生防潛力，可能參與宿主的抗逆作用（魯紅學和周燚，2008）。黃翅大白蟻（Macrotermes barneyi）腸道中可培養(yǎng)的纖維單胞菌能以幾丁質為唯一碳源生長，且產(chǎn)生較強的木質纖維素降解酶活，說明其體內可培養(yǎng)細菌參與了宿主的營養(yǎng)和消化過程（孫新新等，2017）。本研究在桉樹枝癭姬小蜂冬季雌成蟲體內分離到芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、微桿菌屬、纖維單胞菌屬、葡萄球菌屬和埃希菌屬等的細菌，但其對宿主是否具有相似的功能有待進一步探究。NA培養(yǎng)基雖然廣泛應用于分離培養(yǎng)細菌，但可能有些細菌在特定的培養(yǎng)基上才能生長。因此，要全面了解桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的種類與數(shù)量，還需要選用多種特定的培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)試驗。

昆蟲體內含有大量的微生物，二者在長期協(xié)同進化中已形成了密切的共生關系，且對昆蟲的生命活動產(chǎn)生重要影響。探明昆蟲體內可培養(yǎng)細菌的種類組成、群落結構及生物功能等信息，有利于了解昆蟲的生命活動過程，進而為利用昆蟲體內可培養(yǎng)細菌開發(fā)生物防治藥劑打下理論基礎。本研究通過探討冬季桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌的群落結構組成，可為今后研究體內可培養(yǎng)細菌對桉樹枝癭姬小蜂的生理功能和生態(tài)作用打下基礎，最終為從微生物角度防治該害蟲提供新思路。

4 結論

桉樹枝癭姬小蜂體內可培養(yǎng)細菌具有豐富的多樣性，主要包括芽孢桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、片球菌屬、類芽孢桿菌屬、微桿菌屬、纖維單胞菌屬和埃希氏桿菌屬等，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢種群。研究結果可為今后不同細菌間的相互關系及其功能研究提供參考。

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