黃喉擬水龜肺氣腫病病原菌的分離鑒定及其藥敏特性分析

胡舒 黎江 徐騰 謝業(yè)揚 雷坤 王邦杰 陸專靈 韋友傳

摘要：【目的】明確黃喉擬水龜肺氣腫病的病原菌及其藥敏特性，為該病的臨床診斷與治療提供科學依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^微生物常規(guī)分離、人工感染試驗、生理生化鑒定及16S rDNA序列分析等方法分離鑒定黃喉擬水龜肺氣腫病的病原菌，測定該病原菌對黃喉擬水龜?shù)陌胫滤绖┝浚↙D50），并采用K-B藥敏紙片擴散法測定其藥敏特性?！窘Y(jié)果】從患肺氣腫病黃喉擬水龜?shù)姆闻K組織中分離獲得一株優(yōu)勢菌株（命名為GXNN1），其生理生化特性與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）完全一致;經(jīng)腹腔人工注射感染，黃喉擬水龜表現(xiàn)出與自然發(fā)病相同的癥狀，腹腔內(nèi)有少量血水，腸壁充血，肺臟充血膨脹;菌株GXNN1對黃喉擬水龜?shù)腖D50為0.63×103 CFU/g。菌株GXNN1與肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA序列同源性為99.4%～99.9%，從基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也發(fā)現(xiàn)，菌株GXNN1與肺炎克雷伯氏菌聚為一支。綜合其形態(tài)特征、生理生化特性、人工感染試驗及16S rDNA序列分析結(jié)果，可確定黃喉擬水龜肺氣腫病的致病菌（菌株GXNN1）為肺炎克雷伯氏菌。藥敏試驗結(jié)果表明，菌株GXNN1對先鋒必和舒普深敏感，對氨芐青霉素、氯霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、阿莫西林等15種藥物已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）。【結(jié)論】肺炎克雷伯氏菌是引起黃喉擬水龜肺氣腫病的主要病原菌，LD50為0.63×103 CFU/g，生產(chǎn)中可使用舒普深和先鋒必等藥物進行治療。

關(guān)鍵詞： 黃喉擬水龜;肺氣腫病;肺炎克雷伯氏菌;半致死劑量（LD50）;藥敏試驗

中圖分類號： S947.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2566-07

Isolation，identification and antibiotic sensitivity of pathogenic bacteria causing pulmonary emphysema from Mauremys mutica

HU Shu1， LI Jiang1， XU Teng1， XIE Ye-yang1， LEI Kun1， WANG Bang-jie1，

LU Zhuan-ling2*， WEI You-chuan1*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，

Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】The pathogens and drug-sensitive properties of the Mauremys mutica pulmonary emphysema were clarified to provide scientific basis for the clinical diagnosis and treatment of the disease. 【Method】The pathogens of M. mutica emphysema were isolated and identified using routine microbial isolation technology， artificial infection test， physiological and biochemical identification， 16S rDNA sequence analysis. The median lethal dose（LD50） of the pathogen to M. mutica was determined and the drug sensitivity characteristics of the pathogen were analyzed using Kirby-Bauer paper flakes diffusion method. 【Result】A dominant strain（GXNN1） was isolated from the lung tissue of M. mutica with emphysema， physiological and biochemical reactions were consistent with Klebsiella pneumoniae. After intraperitoneal injection of GXNN1 to M. mutica， showing small amount of blood in abdominal cavity， intestinal wall hyperemia， lungs hyperemia and inflation occurred， which was the same symptoms as natural infection. The LD50 of GXNN1 to M. mutica was 0.63×103 CFU/g. The 16S rDNA sequences homology between GXNN1 and K. pneumoniae were 99.4%-99.9%. Phylogenetic trees based on homology of 16S rDNA sequences revealed that GXNN1 clustered with the same branch of K. pneumoniae. Synthetic morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics， artificial infection test and 16S rDNA sequence analysis results confirmed that the pathogen（GXNN1）causing M. mutica emphysema was K. pneumoniae. Drug sensitivity tests showed that GXNN1 isolate was highly sensitive to cefobid and sulperazone， and resistant（insensitive） to 15 antibiotics such as ampicillin， chloramphenicol， doxycycline， gentamicin， norfloxacin and amoxicillin. 【Conclusion】K. pneumoniae is the main pathogen causing M. mutica with emphysema. The LD50 was 0.63×103 CFU/g. Sulperazone and cefobid can be used for treatment in aquaculture production.

Key words： Mauremys mutica; pulmonary emphysema; Klebsiella pneumoniae; median lethal dose（LD50）;drug sensitivity test

0 引言

【研究意義】黃喉擬水龜（Mauremys mutica）俗稱石龜或石金錢龜，隸屬于淡水龜亞科（Batagurinae）擬水龜屬（Mauremys），為國家二級保護動物，自然分布于越南、日本及我國的東部和南部地區(qū)（趙忠添等，2007），因其具有較高的藥用和觀賞價值，已成為我國尤其是南方地區(qū)的重要養(yǎng)殖龜類。隨著黃喉擬水龜人工養(yǎng)殖和苗種培育等技術(shù)的快速發(fā)展，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，但也導致養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化及病害頻發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟損失（王德芬等，2016;孫有恒等，2017）。因此，加強黃喉擬水龜疫病病原菌鑒定及其科學防治，對促進其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】目前，關(guān)于黃喉擬水龜致病菌的分離鑒定已有研究報道。何成偉等（2006）從黃喉擬水龜甲殼病灶中分離鑒定出腦膜炎膿毒性黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum）和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），并證實這兩種病原菌均可分解甲殼幾丁質(zhì)，是引起甲殼腐爛的主要病因;鄧厚群（2009）研究表明，無色桿菌（Achromobacter sp.）、氣單胞菌（Aeromonas）及假單胞菌（Pseudomonadaceae）感染均可引發(fā)黃喉擬水龜腐皮病;黎小正等（2010）從廣西某養(yǎng)殖場發(fā)病黃喉擬水龜?shù)母闻K和肺臟分離鑒定出摩氏摩根菌（Morganella morganii），經(jīng)人工感染試驗確定該致病菌可引起病龜肝臟腫大壞死、腎臟出血等癥狀;蘭云等（2014）從黃喉擬水龜腐皮組織中分離鑒定出類香味菌（Myroides sp.），并通過人工感染和藥敏試驗確定該病原菌與其腐皮病有關(guān);陸專靈等（2016）從患白眼病黃喉擬水龜稚龜中分離鑒定到肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），經(jīng)人工回歸感染試驗證實該致病菌與黃喉擬水龜白眼病有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】2017年9月廣西南寧市武鳴縣某龜場的黃喉擬水龜發(fā)生嚴重肺氣腫病，臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡、行動遲緩、口吐泡沫及食欲不振等，剖檢發(fā)現(xiàn)肺部充氣腫脹、腸道內(nèi)無內(nèi)容物、肝膽腫大;成年龜和稚龜均有發(fā)病，且臨床診斷不及時，死亡率極高，因此急需鑒定其病因并科學用藥以減少該病對養(yǎng)殖帶來的經(jīng)濟損失?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過微生物常規(guī)分離、人工感染試驗、生理生化鑒定及16S rDNA序列分析等方法分離鑒定黃喉擬水龜肺氣腫病的病原菌，并采用K-B藥敏紙片擴散法測定其藥敏特性，為該病的臨床診斷與治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

病龜由廣西南寧市武鳴縣某黃喉擬水龜養(yǎng)殖場送檢，體重82.34 g/只，8月齡。人工感染試驗所用健康黃喉擬水龜（共160只，體重22.41±5.32 g/只）由廣西南寧市武鳴縣某龜場提供，暫養(yǎng)7 d后再用于人工感染試驗。藥敏紙片和細菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司;兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基自行配制;PCR反應試劑和DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 病原菌形態(tài)學及生理生化鑒定

從病龜肺臟取樣劃線接種到兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)14～16 h，觀察菌落形態(tài)、大小，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢病菌的形態(tài)特征;按細菌生化微量鑒定管說明對分離菌株進行生理生化鑒定。

1. 3 人工感染試驗及半致死劑量（LD50）測定

預試驗：取純化后的分離菌株在30 ℃下?lián)u床（220 r/min）擴大培養(yǎng)12 h，計數(shù)后以PBS按5倍系列稀釋制備9個濃度梯度的菌懸液。將健康黃喉擬水龜隨機分為10組，每組10只。每個濃度注射一組，每只龜腹腔注射菌懸液0.1 mL;另一組為對照組，腹腔注射等量滅菌的PBS。統(tǒng)計各處理組2周內(nèi)的死亡情況，確定致死率為100%的最低細菌濃度及致死率為0的最高細菌濃度。同時對死亡黃喉擬水龜進行剖檢及病原菌分離鑒定。

正式試驗：參照預試驗結(jié)果，以PBS按對數(shù)間距制備5個濃度梯度的菌懸液。將剩余的60只健康黃喉擬水龜隨機均分為6組（5組為試驗組，1組為對照組），注射方法及劑量與預試驗同。注射后在相同環(huán)境下飼養(yǎng)2周，觀察記錄各處理組黃喉擬水龜?shù)陌l(fā)病癥狀和死亡情況;并參照顧兵等（2009）測定菌液毒力的方法，運用SPSS 20.0計算病原菌對黃喉擬水龜?shù)腖D50。

1. 4 16S rDNA序列擴增

根據(jù)DNA提取試劑盒說明提取病原菌DNA。以上游引物（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和下游引物（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增16S rDNA序列，反應體系25.0 ?L：2×Premix Taq 12.5 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各1.0 ?L，DNA模板2.0 ?L，ddH2O 8.5 ?L。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，按膠回收試劑盒說明純化回收后連接pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送至廣州華大生物科技有限公司測序。

1. 5 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化分析

使用SeqMan拼接序列，并應用在線軟件BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）、DNASTAR和MEGA 5.05分別進行同源基因搜索、同源性分析及構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育進化樹（設(shè)定Bootstraps為1000）。

1. 6 藥敏試驗

采用K-B藥敏紙片擴散法（譚瑤等，2010）測定病原菌的藥敏特性：以純化培養(yǎng)的菌懸液均勻涂布于滅菌普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，將各種藥敏紙片均勻分散緊貼于培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)16～18 h后測定抑菌圈直徑，分析其藥敏特性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 分離菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

從患肺氣腫病黃喉擬水龜?shù)姆闻K組織中分離獲得一株優(yōu)勢菌株（命名為GXNN1），在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)18 h后，可形成灰白色、光滑、圓形、中間隆起、邊緣整齊、黏稠的菌落（圖1-A），菌落直徑1.0～2.0 mm。革蘭氏染色呈陰性，10×100倍油鏡下觀察，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為1～2 ?m，單獨、成雙或連續(xù)排列（圖1-B）。菌株GXNN1的生理生化特性鑒定結(jié)果見表1，其中，酒石酸鹽、明膠水解、氧化酶、硫化氫和M.R.試驗結(jié)果均呈陰性，而葡萄糖、肌醇和檸檬酸等19項反應呈陽性，與肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）的生理生化特性完全一致。

2. 2 分離菌株的致病性

菌株GXNN1擴大培養(yǎng)12 h后，以PBS稀釋制成9個濃度梯度（2.50×108、0.50×108、1.00×107、2.00×106、4.00×105、0.80×105、1.60×104、3.20×103、0.64×103 CFU/mL）的菌懸液用于人工感染預試驗，結(jié)果顯示，2周內(nèi)黃喉擬水龜致死率達100%的最小細菌濃度為1.00×107 CFU/mL，而致死率為0的最高細菌濃度為3.20×103 CFU/mL。在正式試驗中，試驗組黃喉擬水龜從感染第2 d開始食欲不振、鼻孔有分泌物;感染第6～9 d其嘴角出現(xiàn)黏液，且伴有呼吸急促的癥狀;從感染第8 d開始出現(xiàn)死亡，至感染第13 d第1試驗組的黃喉擬水龜全部死亡;對照組黃喉擬水龜未出現(xiàn)任何異常癥狀及死亡現(xiàn)象。剖檢感染發(fā)病黃喉擬水龜，發(fā)現(xiàn)其腹腔內(nèi)有少量血水，腸壁充血，肺臟充血膨脹（圖2-B），與自然發(fā)病癥狀（圖2-A）相似，均有別于對照組健康黃喉擬水龜?shù)姆闻K（圖2-C）。根據(jù)正式試驗結(jié)果（表2）計算得到，菌株GXNN1對黃喉擬水龜?shù)腖D50為1.26×105 CFU/mL，即0.63×103 CFU/g。Probit回歸方程為y=-4.837+0.948x，其中，y為劑量回歸幾率單位，x為劑量對數(shù)。95%可信限范圍為3.70×104～4.38×105 CFU/mL。

2. 3 分離菌株的分子鑒定結(jié)果

菌株GXNN1的16S rDNA序列PCR擴增電泳結(jié)果顯示，在1500 bp附近出現(xiàn)單一的清晰條帶（圖3），與預期結(jié)果相符;送至廣州華大生物科技有限公司測序，確定16S rDNA序列長度為1503 bp。同源性比對分析結(jié)果表明，菌株GXNN1與肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA序列同源性達99.4%～99.9%，與其他參考菌株的同源性為96.3%～98.6%（表3）。從基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也發(fā)現(xiàn)，菌株GXNN1與肺炎克雷伯氏菌聚為一支（圖4）。

2. 5 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果

由表4可知，菌株GXNN1對先鋒必和舒普深表現(xiàn)為敏感，對氨芐青霉素、氯霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、紅霉素、克林霉素、卡那霉素、林可霉素、四環(huán)素和甲氧嘧啶等15種藥物已生產(chǎn)耐藥性（不敏感）。

3 討論

肺炎克雷伯氏菌是一類人畜共患病病原，可引起社會公共衛(wèi)生安全問題，因此受到廣泛關(guān)注。馬磊等（2011）從患病竹鼠中分離獲得肺炎克雷伯氏菌，臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽，剖檢發(fā)現(xiàn)其肺部腫脹且有血水;郝中香等（2015）從患病扭角羚中分離得到肺炎克雷伯氏菌，剖檢發(fā)現(xiàn)扭角羚的肺臟充血腫大、肝臟和脾臟淤血腫大。此外，徐海圣和舒妙安（2002）、李景云等（2003）、王亨等（2008）、盧玉婷等（2014）也先后從中華鱉、人類、奶牛和鯉魚中分離鑒定出肺炎克雷伯氏菌，但其臨床癥狀與病理變化各不相同?？梢?，肺炎克雷伯氏菌對多種動物均具有致病性，且易引起肺炎、支氣管炎及尿道感染等疾?。˙risse and Duijkeren，2005;林星宇等，2015;蒙正群等，2017）。本研究從患肺氣腫病黃喉擬水龜?shù)姆闻K中分離獲得一株優(yōu)勢菌株，綜合其形態(tài)特征、生理生化特性、人工感染試驗及16S rDNA序列分析結(jié)果，可確定黃喉擬水龜肺氣腫病的致病菌為肺炎克雷伯氏菌。

剖檢發(fā)現(xiàn)，患肺氣腫病黃喉擬水龜?shù)闹饕±碜兓憩F(xiàn)為肺臟充氣腫脹、肝臟和膽囊腫大，但與陶錦華等（2002）報道的病理變化略有不同。由肺炎克雷伯氏菌引起的黃喉擬水龜白眼病，其臨床表現(xiàn)為眼部發(fā)炎出血，外部有白色分泌物，張口呼吸，肺部有積液等（陸專靈等，2016）。據(jù)此推測，肺炎克雷伯氏菌可在同種動物引起多種疾病，并表現(xiàn)出不同的臨床癥狀與病理變化。在本研究的人工感染試驗中，試驗組黃喉擬水龜表現(xiàn)出與自然發(fā)病相同的癥狀，腹腔內(nèi)有少量血水，腸壁充血，肺臟充血膨脹;肺炎克雷伯氏菌對黃喉擬水龜?shù)腖D50為0.63×103 CFU/g，明顯低于蠟樣芽孢桿菌對羅非魚的LD50（楊移斌等，2017）及粘質(zhì)沙雷氏菌對中華鱉的LD50（楊移斌等，2018），表明其毒力較強，給黃喉擬水龜?shù)酿B(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重危害。

肺炎克雷伯氏菌是臨床上常見的條件致病菌，致病性強，已對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性機制為細胞膜的通透性降低、膜成分改變、藥物轉(zhuǎn)運功能喪失、酶的修飾作用等（沈定霞等，1998）。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明，肺炎克雷伯氏菌對先鋒必和舒普深敏感，對氨芐青霉素、氯霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、紅霉素、克林霉素、卡那霉素、林可霉素、四環(huán)素和甲氧嘧啶等15種藥物已生產(chǎn)耐藥性（不敏感），可能與養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中大規(guī)模濫用抗生素有關(guān)，同時暗示肺炎克雷伯氏菌具有超強的環(huán)境適應力。過去很長一段時間內(nèi)，碳青霉烯類抗生素是防治肺炎克雷伯氏菌感染的首選藥物（劉保光等，2014），但由于長期濫用而致使其耐藥性逐年加強。因此，在黃喉擬水龜肺氣腫病防治過程中需慎重使用藥物治療，生產(chǎn)過程中應積極轉(zhuǎn)變養(yǎng)殖理念，防重于治;龜群一旦發(fā)病后要及時診斷，并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果科學合理用藥。

4 結(jié)論

肺炎克雷伯氏菌是引起黃喉擬水龜肺氣腫病的主要病原菌，LD50為0.63×103 CFU/g，生產(chǎn)中可使用舒普深和先鋒必等藥物進行治療。

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