基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚類分析

許子欣 冉志芳 楊小彤 郝慶秀 余意 周潔 郭蘭萍

摘要：【目的】基于psbA-trnH和rDNA ITS序列進(jìn)行不同地理居群巴戟天聚類分析，探討不同地理居群巴戟天遺傳變異與地理分布之間的相關(guān)性，為其道地性研究提供理論參考。【方法】以13個(gè)來自廣東、廣西和福建的不同地理居群巴戟天為研究對象，采用改良CTAB法提取其新鮮葉片DNA，以其為模板分別擴(kuò)增psbA-trnH和rDNA ITS序列。采用ClustalX 1.81進(jìn)行多重對位排列，應(yīng)用MEGA 6.06中K2P（Kimura 2-parameter）模型計(jì)算遺傳距離，并運(yùn)用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。【結(jié)果】不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列長度為306 bp，GC含量為27.2%，保守率83.33%，變異率16.67%，簡約信息率26.14%;不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列長度為571 bp，GC含量為64.1%，保守率91.42%，變異率8.58%，簡約信息率14.19%。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列遺傳距離為0～0.128，其中廣東省的5個(gè)樣品間遺傳距離整體較小;福建省的4個(gè)樣品與廣西和廣東的樣品間遺傳距離整體較大。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列遺傳距離為0～0.102，其中福建省的永定2號(hào)與其他樣品遺傳距離均較大?；趐sbA-trnH和rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均將廣東省的5個(gè)巴戟天樣品聚為一支，但rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹還將廣西區(qū)的4個(gè)巴戟天樣品聚為一支，說明其可較好地區(qū)分廣東省和廣西區(qū)不同地理居群的巴戟天?！窘Y(jié)論】巴戟天遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布存在一定的相關(guān)性，深入研究巴戟天遺傳變異與地理分布間的相關(guān)性時(shí)應(yīng)以rDNA ITS序列為主、psbA-trnH序列為輔。

關(guān)鍵詞： 巴戟天;居群;psbA-trnH;rDNA ITS;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;聚類分析

中圖分類號(hào)： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）12-2364-07

Cluster analysis of Morinda officinalis How in different geographical populations based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences

XU Zi-xin1， RAN Zhi-fang2， YANG Xiao-tong2， HAO Qing-xiu3，

YU Yi4*， ZHOU Jie1*， GUO Lan-ping3

（1 School of Biological Science and Technology，University of Jinan，Jinan? 250022， China; 2 School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan? 250022， China; 3 The State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijng? 100700， China; 4 Infinitus（China） Company Ltd.，

Guangzhou? 510627， China）

Abstract：【Objective】Cluster analysis of Morinda officinalis How located in different geographical populations were analyzed based on PsbA-trnH and rDNA ITS sequences， and the relationship between genetic variation and geographical distribution was explored， which provided basic data for the researches of geoherb. 【Method】A modified CTAB method was used to extract fresh leaf DNA from 13 different geographical populations of M. officinalis from Guangdong， Guangxi and Fujian. Specific primers were designed to amplify psbA-trnH and rDNA ITS sequences. The software of Clustal X 1.81 was used for multiple sequence alignment， and the pairwise distance was calculated based on K2P（Kimura 2-parameter） model by MEGA 6.06 software， and the phylogenic tree was constructed by Neighbor-joining method. 【Result】The psbA-trnH sequences of M. officinalis from different geographical populations were 306 bp， the GC content was 27.2%， the conserved rate was 83.33%， the mutation rate was 16.67%， and the simple information rate was 26.14%. The rDNA ITS sequences of M. officinalis from different geographical populations were 571 bp， the GC content was 64.1%， the conserved rate was 91.42%， the mutation rate was 8.58%， and the simple information rate was 14.19%. The genetic distances of psbA-trnH sequences of M. officinalis from different geographical populations ranged from 0 to 0.128， among which the genetic distances among the five samples in Guangdong were small as a whole. And the genetic distances between four samples from Fujian and those from Guangxi and Guangdong were large. The genetic distances of rDNA ITS sequences of M. officinalis from different geographical populations ranged from 0 to 0.102. The genetic distances between Yongding 2 in Fujian and other samples were large. The phylogenetic tree based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences could cluster five M. officinalis samples from Guangdong into one branch， but the phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence could cluster four M. officinalis samples from Guangxi into one branch， which showed that the phylogenetic tree could better distinguish M. officinalis from different geographical populations in Guangdong and Guangxi. 【Conclusion】There is certain correlation between genetic structure and geographical distribution of M. officinalis. The intensive study of the correlation between genetic variation and geographical distribution of M. officinalis should be based on ITS sequence and supplemented by psbA-trnH sequence.

Key words： Morinda officinalis How; populations; psbA-trnH; rDNA ITS; phylogenetic tree; cluster analysis

0 引言

【研究意義】巴戟天（Morinda officinalis How）為茜草科巴戟天屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、海南等地，其干燥根是我國“四大南藥”之一，性甘、辛，微溫，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效（國家藥典委員會(huì)，2015）。近年來，巴戟天需求急劇增加，不同產(chǎn)地的巴戟天不斷涌入市場，導(dǎo)致藥材品質(zhì)良莠不齊，給臨床用藥帶來巨大挑戰(zhàn)（劉瑾，2009;丁平等，2012;盧洪梅等，2018）。道地藥材是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)藥材，其表型是基因型與環(huán)境飾變的結(jié)果，其中基因型是決定道地藥材品質(zhì)的重要因素（黃璐琦和張瑞賢，1997;黃璐琦等，2008）。因此，探究不同地理居群巴戟天的遺傳變異對其藥材道地性研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生藥學(xué)的發(fā)展，藥用植物的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究迅速開展，基因序列是常用分子標(biāo)志（張君毅，2007;柏國清等，2017;林爽等，2017;王明強(qiáng)等，2017）。psbA-trnH序列為psbA基因和trnH基因間的一段非編碼序列，是葉綠體基因組中進(jìn)化速率最快的基因間隔區(qū)之一（姬生國等，2011;彭小鳳等，2015），但psbA-trnH基因在序列和結(jié)構(gòu)上相對保守，廣泛應(yīng)用于較近分類群及地理種群的研究。已有較多學(xué)者將psbA-trnH序列用于山東丹參（Salvia shandongensis）（李曉娟等，2013）、茜草（Rubia cordifolia Linn.）（夏至等，2016）等藥用植物及其近緣種的快速鑒別。rDNA ITS序列具有較多的拷貝數(shù)，可提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，是研究生物類群系統(tǒng)與進(jìn)化的重要分子標(biāo)記（李亞，2013;李亞等，2013）。已有較多學(xué)者將rDNA ITS序列用于山藥（Dioscoreae rhizoma）（吳志剛等，2014）、玫瑰花（Rosae rugosae Flos）（李洪芹等，2015）等藥用植物不同種質(zhì)的鑒別，但應(yīng)用于巴戟天遺傳分析的研究報(bào)道較少，僅丁平等（2012）采用rDNA ITS序列分析研究不同地理居群巴戟天的基因分化。【本研究切入點(diǎn)】至今，鮮見將psbA-trnH序列與rDNA ITS序列相結(jié)合對不同地理居群巴戟天進(jìn)行聚類分析的文獻(xiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以13個(gè)不同地理居群的巴戟天為材料，對其rDNA ITS序列和psbA-trnH序列進(jìn)行擴(kuò)增，并基于遺傳變異情況進(jìn)行聚類分析，為巴戟天藥材的道地性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

于2017年8月從廣東、廣西和福建3個(gè)?。▍^(qū)）野外采集巴戟天新鮮葉片，迅速放入硅膠中干燥保存，存放于濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物標(biāo)本館，并由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定，詳見表1。樣品名稱由筆者根據(jù)采集地命名。主要試劑：Taq-HS PCR Forest Mix（2×）購自江蘇愚公生命科技有限公司;柱式植物提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。主要儀器設(shè)備：NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（Thermo，美國）、臺(tái)式多用離心機(jī)（Thermo，美國）、T100PCR儀（Bio-Rad，美國）、Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽（Bio-Rad，美國）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海析達(dá)儀器有限公司）和ChampGel? 5000全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 參照柱式植物DNAOUT提取試劑盒提取不同地理居群巴戟天新鮮葉片基因組DNA，并以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量（110 V 30 min），電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察拍照;采用超微量分光光度計(jì)測定其濃度;采用分光光度法測定其在260和280 nm下的吸光值（A），計(jì)算二者比值（A260/A280）（Shahzadi et al.，2010）。

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì)及合成 參考姬生國等（2011）、丁平等（2012）設(shè)計(jì)的特異性引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增和測序 psbA-trnH和rDNA ITS序列的PCR反應(yīng)體系50.0 ?L：Taq-HS PCR Forest Mix 15.0 ?L、10 ?mol/L上、下游引物各2.0 ?L、DNA模板5.0 ?L，ddH2O補(bǔ)足至50.0 ?L。rDNA ITS序列的擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。psbA-trnH序列的擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 50 s，55 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（110 V，30 min），電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察拍照，切取目標(biāo)條帶進(jìn)行純化，并送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。

1. 3 序列分析

采用CodonCode Aligner V6.0.6對測序結(jié)果進(jìn)行校對拼接，并刪除序列兩端低質(zhì)量序列;利用ClustalX 1.81的Alignment進(jìn)行多重對位排列（Multiple alignments）;應(yīng)用MEGA 6.06中K2P（Kimura 2-parameter）模型計(jì)算遺傳距離并構(gòu)建遺傳距離矩陣;采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并以Bootstrap（自展法）進(jìn)行1000次可信度檢測（張兵鋒等，2017）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DNA提取結(jié)果

采用超微量分光光度計(jì)測定DNA濃度，并稀釋至20 ng/?L，其A260/A280為1.75～1.83，表明DNA純度較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1和圖2可知，psbA-trnH和rDNA ITS序列的PCR產(chǎn)物分別約400和600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，且條帶清晰，亮度大，表明PCR擴(kuò)增效率高，經(jīng)純化后可直接用于測序。

2. 3 psbA-trnH和rDNA ITS序列分析結(jié)果

基于GenBank數(shù)據(jù)庫中同科屬物種psbA-trnH序列的注釋，去除其兩端的psbA和trnH基因。采用MEGA 6.06進(jìn)行psbA-trnH序列分析，并將排序后的序列組成數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)果如表3所示。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列長度為306 bp，GC含量為27.2%;保守位點(diǎn)有255 bp，占序列總長度的83.33%（保守率）;變異位點(diǎn)為51 bp，占序列總長度的16.67%（變異率）;簡約信息位點(diǎn)為80 bp，占序列總長度的26.14%（簡約信息率）。

將rDNA ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中發(fā)布的巴戟天rDNA ITS序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷酸序列相似度為96.7%，該序列包含ITS序列全長及18S和26S部分序列，表明PCR擴(kuò)增條帶為rDNA ITS序列。采用MEGA 6.06進(jìn)行rDNA ITS序列分析，并將排序后的序列組成數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)果如表3所示。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列長度為571 bp，GC含量為64.1%，保守位點(diǎn)為522 bp，占序列總長度的91.42%（保守率）;變異位點(diǎn)為49 bp，占序列總長度的8.58%（變異率），其中堿基的缺失和替換是主要的變異類型;包含簡約信息位點(diǎn)為81 bp，占序列總長度的14.19%（簡約信息率）。rDNA ITS序列中的5.8S具有極大的保守性，不存在變異位點(diǎn)。

2. 4 遺傳距離分析結(jié)果

采用MEGA 6.06中的K2P模型計(jì)算不同巴戟天樣品psbA-trnH序列和ITS序列的遺傳距離并構(gòu)建遺傳距離矩陣，結(jié)果如表4和表5所示。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列遺傳距離為0～0.128，其中廣東省的5個(gè)樣品間遺傳距離整體較小;福建省的4個(gè)樣品與廣西和廣東的樣品間遺傳距離整體較大。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列遺傳距離為0～0.102，其中福建的永定2號(hào)與其他樣品遺傳距離均較大，表明巴戟天不同居群間的遺傳距離與地理距離在一定程度上呈正相關(guān)。

2. 5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果

采用鄰接法對不同居群巴戟天樣品進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。其中，基于psbA-trnH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，3個(gè)不同省（區(qū)）的巴戟天樣品可聚成八個(gè)分支，其中廣東省的5個(gè)巴戟天樣品聚為一支，自展支持率為71%;廣西區(qū)的岑溪1號(hào)和岑溪2號(hào)聚成一支，自展支持率為80%;廣西區(qū)的蒼梧1號(hào)和蒼梧2號(hào)及福建的4個(gè)巴戟天樣品均單獨(dú)為一支。

基于rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖4所示，3個(gè)不同?。▍^(qū)）的巴戟天樣品可聚成三大分支，其中廣東省的5個(gè)巴戟天樣品聚為一支，自展支持率為78%;廣西區(qū)的4個(gè)巴戟天樣品聚為一支，自展支持率為65%;福建省的4個(gè)巴戟天樣品中南靖2號(hào)和南靖1號(hào)聚為一支，永定1號(hào)和永定2號(hào)均單獨(dú)為一支。

可見，巴戟天遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布存在一定的相關(guān)性，且與psbA-trnH序列相比，基于rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可較好地區(qū)分廣東省和廣西區(qū)不同地理居群的巴戟天樣品。

3 討論

psbA-trnH和rDNA ITS序列進(jìn)化速率較快、多態(tài)性位點(diǎn)豐富，在中藥材領(lǐng)域多用于分子系統(tǒng)樹構(gòu)建和物種鑒別，尤其是近緣屬間、屬內(nèi)及種內(nèi)居群間的遺傳差異研究。徐紅等（2001）基于rDNA ITS序列，成功構(gòu)建基于ITS1+ITS2的石斛屬植物分子系統(tǒng)樹，結(jié)果表明該序列在石斛屬種內(nèi)較保守，種間變異較大，可用作黃草石斛分子鑒定的標(biāo)記。白明明等（2012）基于psbA-trnH序列分析發(fā)現(xiàn)，不同地理居群何首烏[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]遺傳特性與地理分布具有一定的相關(guān)性。金艷蕾等（2011）基于psbA-trnH和trnL-trnF序列分析頭花蓼居群間的DNA序列變異與地理分布的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貴州和云南的頭花蓼類群存在明顯基因變異。本研究分析不同地理居群巴戟天的psbA-trnH和rDNA ITS序列，并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于rDNA ITS序列和psbA-trnH序列分析結(jié)果均在一定程度上揭示不同居群間巴戟天的遺傳變異情況，其中，rDNA ITS序列中GC含量高、保守率高、變異率低、簡約信息率適中，基于其構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可較好地將廣東省和廣西區(qū)不同地理居群的巴戟天樣品區(qū)分，與丁平等（2012）的研究結(jié)論一致。本研究基于psbA-trnH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，廣東省的5個(gè)巴戟天樣品聚為一支，表明psbA-trnH序列可作為鑒別廣東省不同巴戟天居群的分子標(biāo)記。同樣，張宏意等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，何首烏psbA-trnH序列可作為其道地種源即德慶種源與其他種源分子鑒定的依據(jù)。在今后研究中，為準(zhǔn)確深入探討不同居群巴戟天遺傳變異與地理分布間的相關(guān)性，可以rDNA ITS序列為主，psbA-trnH序列為輔。

4 結(jié)論

巴戟天遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布存在一定的相關(guān)性，深入研究巴戟天遺傳變異與地理分布間的相關(guān)性時(shí)應(yīng)以rDNA ITS序列為主、psbA-trnH序列為輔。

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