瑤藥冷骨風(fēng)質(zhì)量控制方法研究

陸崢琳 薛亞馨 黃瑞松 蘇青

摘 要：瑤藥冷骨風(fēng)來源于睡蓮科植物萍蓬草（Nuphar pumilum）的干燥根莖，為瑤族人習(xí)用藥材，具有止咳補(bǔ)虛、除蒸止汗、祛瘀調(diào)經(jīng)、止血的作用，目前歷版《中國藥典》和地方標(biāo)準(zhǔn)并未有收載其質(zhì)量控制方法。該研究收集了10批冷骨風(fēng)藥材，采用生藥鑒別方法對冷骨風(fēng)藥材性狀進(jìn)行顯微鑒別，用TLC（薄層色譜）法對藥材進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對沒食子酸含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：（1）色譜柱為Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為272 nm，柱溫為室溫。（2）建立了冷骨風(fēng)藥材性狀、顯微、TLC鑒別方法。（3）含量測定中沒食子酸在0.072 1～0.360 5 μg范圍時，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為103.66%，RSD為2.03%（n=6）。（4）10 批樣品沒食子酸含量為0.82%～1.23%，平均含量為0.94%。因此，建立的瑤藥冷骨風(fēng)質(zhì)量控制方法具有較強(qiáng)的科學(xué)性，可用于冷骨風(fēng)藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：瑤藥，冷骨風(fēng)，性狀，顯微鑒別，薄層色譜，含量測定

中圖分類號：Q946.33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）05-0552-08

Abstract：Yao medicine Lenggufeng is the dried rhizome of Nuphar pumilum，which was commonly used by Yao people. The herb medicine can be widely used for relieving cough，reinforcing deficiency，eliminating steam，hidroschesis，removing blood stasis，regulating menstruation and hemostasis. But the method for quality control of N. pumilum is not recorded in different versions of Chinese Pharmacopoeias or local quality standard of herbal medicine. Ten batches of herb medicine were collected in this study. The traits and microscopes of Nuphar pumilum were identified by crude drug identification method，the qualitative determination were performed by TLC，and the contents of gallic acid in these samples were determined by HPLC. The results were as follows：（1） The column was Welch Ultimate XB-C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm） with mobile phase of methanol-0.05% phosphoric acid（5∶95） at a flow rate of 1.0 mL·min-1，detection wavelength was 272 nm，column temperature was room temperature. （2） The identification method for the traits，microscopes and TLC were established. （3） The gallic acid showed a good linear relationship within the range of 0.072 1-0.360 5 μg ，whose average recovery （n=6） was 103.66%，with the RSD of 2.03%. （4） Gallic acid contents for the ten batches of samples were 0.82%-1.23%，and the average content was 0.94%. This established quality control method has strong scientificity and can be used for the quality control of N. pumilum.

Key words：Yao medicine， Nuphar pumilum，traits， microscopic identification， TLC，content detemination

冷骨風(fēng)，瑤語“南迸崩”，俗稱萍蓬草、水蓮藕、魚虱草等，為瑤族習(xí)用藥材。廣西瑤醫(yī)在長期實(shí)踐中逐漸形成了瑤族“老班藥”，包括了瑤藥的“九牛五虎七十二風(fēng)”，冷骨風(fēng)則為“七十二風(fēng)”的“風(fēng)藥”之一（戴斌，2009）。經(jīng)考證，本品為睡蓮科植物萍蓬草（Nuphar pumilum）的干燥根莖。冷骨風(fēng)原植物主要分布于黑龍江、吉林、河北、江蘇、浙江、江西、福建、廣東、廣西等地（中國科學(xué)院中國植物志編輯員會，1979；全國中草藥匯編編寫組，1990；國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會，1999），廣西主要分布于金秀、恭城、龍勝、全州、桂林、陽朔等地（覃海寧和劉演，2010； 黃瑞松，2015），生于湖沼或水塘中?，庒t(yī)認(rèn)為，冷骨風(fēng)性寒、味甘，屬風(fēng)藥，具有止咳補(bǔ)虛，除蒸止汗，祛瘀調(diào)經(jīng)，止血作用，臨床用于尼椎改悶（腎虛腰痛），哈路（肺結(jié)核），悲寐?lián)潱ㄉ窠?jīng)衰弱），辣給昧對（月經(jīng)不調(diào)），泵卡西眾（消化不良）及沖翠臧（外傷出血）等。

經(jīng)查歷版《中國藥典》和地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，均未見收載有冷骨風(fēng)的標(biāo)準(zhǔn)。該藥材長期以來處于無標(biāo)準(zhǔn)控制的狀態(tài)中，致使該藥材質(zhì)量無法控制，給臨床用藥安全有效及藥材的開發(fā)利用帶來了諸多問題。據(jù)文獻(xiàn)（彭海鵬，1997）記載，同屬植物日本萍蓬草的根狀莖和果實(shí)含有沒食子酸和生物堿等成分。前人的藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑菌、心血管保護(hù)、降血糖、防治神經(jīng)退行性疾病等活性（Inoue et al，2000；Ruohola et al，1995；鐘振國等，2009；許維國等，2012）。為了制訂冷骨風(fēng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究采集10批冷骨風(fēng)藥材樣品，并對其藥材性狀、顯微、TLC和以沒食子酸為指標(biāo) （魏學(xué)軍等，2015；付煜榮等，2006；于波濤等，2011）對含量測定等方法進(jìn)行研究，建立瑤藥冷骨風(fēng)質(zhì)量控制方法，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：Agilent 1100 HPLC；島津LC-20AT HPLC；寧波新芝SB3200DTS雙頻超聲清洗儀；梅特勒XS205B電子分析天平（1/105）；熱電EASYPURE Ⅱ超純水器。試劑：沒食子酸對照品為中國食品藥品檢定研究院提供；液相流動相甲醇為色譜純（德國默克股份兩合公司）；其余試劑為分析純。材料：冷骨風(fēng)藥材共收集10批，各批次藥材信息見表1。其中，1號藥材同時采集了對號植物臘葉標(biāo)本，見圖1。廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授和廣西食品藥品檢驗(yàn)所黃燮才主任技師對標(biāo)本進(jìn)行鑒定，確定其為睡蓮科植物萍蓬草（Nuphar pumilum），本研究中將其作為對照藥材。

1.2 藥材真?zhèn)舞b別

1.2.1 性狀鑒別 采用經(jīng)驗(yàn)方法（眼看、手摸、鼻聞、口嘗），對10批冷骨風(fēng)藥材的大小、質(zhì)地、形狀、性味進(jìn)行觀察，確定藥材的性狀。

1.2.2 顯微鑒別 （1）橫切面觀察：取冷骨風(fēng)的根莖，按石蠟切片法制作橫切面片，進(jìn)行橫切面觀察。（2）粉末觀察：取干燥藥材粉碎，過60目篩，將粉末放置載玻片上，滴加水合氯醛1～2滴透化，再滴加稀甘油1～2滴裝片，或直接滴加稀甘油裝片，觀察，確定藥材的顯微特征。

1.2.3 TLC鑒別 （1）鑒別1：取本品粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，作為供試品溶液；取萍蓬草對照藥材0.5 g，參照上述方法制成對照藥材溶液；取沒食子酸對照品，加甲醇制成濃度為1 mg·mL-1溶液，作為對照品溶液。在同一硅膠H薄層預(yù)制板上點(diǎn)樣，供試品、對照藥材和對照品溶液點(diǎn)樣量為1～3 μL，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（5∶4∶0.5∶0.5），顯色為噴以1%鐵氰化鉀溶液-1%三氯化鐵溶液（1∶1）混合溶液（臨用配制），放置至斑點(diǎn)顯示清晰。（2）鑒別2：取鑒別1項(xiàng)下制備的相應(yīng)溶液作為供試品溶液和對照藥材溶液。在同一硅膠G薄層預(yù)制板上點(diǎn)樣，供試品和對照藥材溶液點(diǎn)樣量為3～5 μL，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（8∶1∶1），顯色為噴以改良碘化鉍鉀試液，放置至斑點(diǎn)顯示清晰。（3）耐用性實(shí)驗(yàn)：分別對不同品牌薄層預(yù)制板（青島海洋化工廠分廠和煙臺市化工研究所提供）、不同展開溫度（8和26 ℃）、不同展開相對濕度（50%和88%）和不同點(diǎn)樣方式（點(diǎn)狀和條帶狀點(diǎn)樣）進(jìn)行考察。

1.3 藥材沒食子酸的含量測定

1.3.1 溶液制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加水制成30 μg·mL-1的水溶液，作為對照品溶液；取冷骨風(fēng)樣品粉末（過四號篩）0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10 mL 10%鹽酸溶液，回流2 h，放冷，濾過，取濾液定容至置100 mL，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；取10%鹽酸溶液作為陰性對照溶液。

1.3.2 測定條件 采用Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95）；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為272 nm；柱溫為室溫；理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

1.3.3 專屬性考察 分別精密吸取上述1.3.1項(xiàng)的對照品、供試品和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照1.3.2項(xiàng)條件測定，記錄色譜圖。

1.3.4 線性關(guān)系考察 取沒食子酸對照品適量，加水制成濃度為144.20 μg·mL-1的溶液，備用。分別精密吸取以上對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，各加10%鹽酸定容至10 mL。各精密吸取上述不同濃度對照品溶液10 μL進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程及r值。

1.3.5 方法學(xué)考察 （1）精密度實(shí)驗(yàn)：取6號樣品的同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以考察儀器的精密性。（2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取6號樣品粉末，照1.3.1項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，測定各自含量，以考察方法的重復(fù)性。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取6號樣品同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測定，以考察供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。（4）回收率實(shí)驗(yàn)：取沒食子酸對照品，加10%鹽酸制成濃度為 0.122 mg·mL-1的溶液，另取6號樣品粉末6份，每份約0.1 g，分別精密稱定，各精密加入上述對照品溶液10 mL，照1.3.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率。

1.3.6 耐用性試驗(yàn) （1）色譜柱的考察：采用同一臺液相色譜儀，對Welch Ultimate XB-C18、依利特Hypersil ODS2-C18、菲羅門Gemini C18 三根色譜柱（規(guī)格均為4.6 mm × 250 mm，5 μm）進(jìn)行考察，分別測定6號樣品中沒食子酸的含量。（2）色譜儀的考察：采用同一根色譜柱，分別對Agilent 1100、島津LC-20AT兩臺色譜儀進(jìn)行考察，分別測定6號樣品中沒食子酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥材性狀特征

冷骨風(fēng)藥材呈長條狀類圓柱形或不規(guī)則形，直徑2～5 cm。外表黃白色至棕黃色或棕黑色，具多數(shù)突起的根痕及葉痕。質(zhì)輕脆，易折斷。斷面黃白色至淡棕色，密布圓孔，有筋脈點(diǎn)散在。氣微香，味淡。結(jié)果如圖2所示。

2.2 顯微特征

2.2.1 橫切面特征 表皮細(xì)胞1列，類方形。外皮層細(xì)胞排列緊密，壁稍有加厚。內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞數(shù)個相連組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成大小不一的通氣道，細(xì)胞內(nèi)含淀粉粒。維管束外韌型， 散布在薄壁組織中。結(jié)果如圖3所示。

2.2.2 粉末特征 灰白色至黃棕色。淀粉粒眾多，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、一字型、人字形，直徑8～55 μm，復(fù)粒淀粉由2～4單粒組成。導(dǎo)管主要為螺紋和梯紋導(dǎo)管，直徑15～67 μm。表皮細(xì)胞黃色，類方形（圖4）。

2.3 TLC鑒別結(jié)果

（1）鑒別1：在日光下，9批供試品色譜中均可檢出對照藥材和對照品色譜相對應(yīng)的藍(lán)色斑點(diǎn)，具有良好的重現(xiàn)性，結(jié)果如圖5所示。（2）鑒別2：在日光下，9批供試品色譜中均可檢出對照藥材相對應(yīng)的橙紅色斑點(diǎn)，具有良好的重現(xiàn)性，結(jié)果如圖6所示。（3）耐用性試驗(yàn)：在不同品牌薄層預(yù)制板、不同展開溫度、不同展開相對濕度和不同點(diǎn)樣方式的條件下，TLC鑒別方法均具有良好耐用性。

2.4 含量測定方法考察及樣品測定結(jié)果

2.4.1 專屬性考察結(jié)果 供試品溶液色譜圖與沒食子酸對照品溶液色譜圖在相同保留時間具有吸收峰，陰性對照液在相同時間無吸收峰，說明本方法無陰性干擾。結(jié)果如圖7所示。

2.4.2 線性關(guān)系測定結(jié)果 沒食子酸對照品進(jìn)樣量在0.072 1～0.360 5 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5 502.9X-127.1，r=0.999 6。

2.4.3 方法學(xué)考察結(jié)果 連續(xù)6次測定的沒食子酸峰面積的平均值為1 098，RSD=0.36%，表明該儀器的精密度良好；平行測定6份樣品的沒食子酸含量的平均值為1.24%，RSD=1.39%，表明該方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)測得沒食子酸含量的平均值為1.22%，RSD=1.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；沒食子酸含量的平均回收率為103.66%（n=6），RSD=2.03%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。具體結(jié)果如表2所示。

2.4.4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果 三根色譜柱測得沒食子酸含量平均值為1.24%，RSD=1.00%，表明本研究建立的測定方法對所測的不同品牌色譜柱有一定的耐用性；兩臺色譜儀測得沒食子酸含量平均值為1.25%，RSD=2.51%，表明本研究建立的測定方法對所用不同品牌色譜儀具有一定的耐用性。

2.4.5 10批樣品含量測定結(jié)果 10批樣品以藥材干燥品計(jì)算，沒食子酸含量為0.82%（8號）～1.23%（6號），平均值為0.94%?？紤]到實(shí)際中藥材來源差異情況的因素，故擬定本品按干燥品計(jì)算，沒食子酸含量不得少于0.50%（表3）。

3 討論

民族藥的標(biāo)準(zhǔn)化是民族藥發(fā)展的技術(shù)關(guān)鍵。過去，由于歷史的原因，民族藥的發(fā)展較緩慢，許多基礎(chǔ)研究一直滯后，特別是在民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，許多民族藥材一直處于無標(biāo)準(zhǔn)控制狀態(tài)中，嚴(yán)重影響了臨床用藥和生產(chǎn)的安全有效和民族藥資源的開發(fā)利用。因此，開展民族藥標(biāo)準(zhǔn)化研究，對于規(guī)范民族藥的生產(chǎn)、流通、臨床用藥具有重要意義，也為科研和檢驗(yàn)提供了法定技術(shù)依據(jù)。

藥材的真?zhèn)舞b別目前仍然以藥材性狀、顯微和TLC鑒別方法為主。過去，人們對冷骨風(fēng)藥材的生藥學(xué)研究甚少，對其鑒別多以經(jīng)驗(yàn)的性狀鑒別為依據(jù)。該文通過試驗(yàn)，建立的性狀、顯微和TLC鑒別方法具有較強(qiáng)的專屬性，可從不同方面為冷骨風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別提供技術(shù)依據(jù)。

在藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，含量測定項(xiàng)的控制具有重要意義，是評價藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，冷骨風(fēng)的化學(xué)成分方面的報道甚少，未見有冷骨風(fēng)含量測定方法的報道。為了準(zhǔn)確評價該藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，該文采用HPLC法建立了冷骨風(fēng)藥材沒食子酸含量測定方法。經(jīng)方法學(xué)考察，表明本方法專屬性強(qiáng)，無陰性干擾，精密度和準(zhǔn)確度均較高，具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性，樣品預(yù)測成分的回收率達(dá)到103.66%，說明該文建立的含量測定方法是可行的，可用于瑤藥冷骨風(fēng)的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價。

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