薄層色譜和高效液相色譜用于矮地茶多糖的單糖組成分析

肖作奇+文曉柯+潘濤

[摘要] 目的 分析矮地茶多糖中的單糖組成及摩爾比值。 方法 采用硫酸水解多糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法和薄層色譜法同時(shí)分析矮地茶多糖的單糖組成和摩爾比，Agilent TC-C18色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-pH為7.0的磷酸緩沖液（20∶80，0.1%），檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，流速：1 mL/min；柱溫：25℃。 結(jié)果 薄層色譜法和高效液相色譜法結(jié)果皆表明矮地茶多糖由葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）組成，高效液相色譜法顯示矮地茶多糖中Glu和Gal的摩爾比值約為1∶2.36。 結(jié)論 薄層色譜法可用于矮地茶多糖的單糖組成的快速鑒別，方法快速、準(zhǔn)確；高效液相色譜法可用于矮地茶多糖中單糖組成的鑒別和摩爾比值測(cè)量，方法簡(jiǎn)單、靈敏、分離效率高。

[關(guān)鍵詞] 矮地茶；多糖；高效液相色譜；薄層色譜；單糖組成

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（c）-0130-04

[Abstract] Objective To analyze the monosaccharide composition and the molar ratio of Ardisia japonica Polysaccharide （AJP）. Methods Sulfuric acid was used to hydrolyze AJP. Pre-column 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazalone （PMP） derivation HPLC and TLC method were developed to determine the monosaccharide compositions and the molar ratio of AJP. The mobile phase was acetonitrile-pH 7.0 phosphate buffer （20∶80， 0.1%） with Agilent TC-C18 column. The detection wavelength was 250 nm， the flow rate was 1 mL/min， and the column temperature was 25 ℃. Results The results of TLC and HPLC analysis showed that AJP were consisted of glucose （Glu） and galactose （Gal）. Meanwhile， HPLC analysis showed that the molar ratio of AJP was 1∶2.36. Conclusion TLC which is fast and accurate， can be used for the rapid identification the monosaccharide composition in AJP. HPLC which is simple， sensitive and high separation efficiency， can be used for the quantitative analysis of the monosaccharide composition in AJP.

[Key words] Ardisia Japonica； Polysaccharide； HPLC； TLC； Monosaccharide Composition

矮地茶是紫金?？浦参顰rdisia japonica（Thumb.） Blume的干燥全草，收錄于《中國(guó)藥典》2015年版[1]，具有止咳平喘、清利濕熱、活血化瘀的功效?，F(xiàn)代研究證明，矮地茶水提取物具有良好的止咳、抗病毒、抗乙肝等生物活性[2-4]，其中主要化學(xué)成分除了內(nèi)酯類（巖白菜素）、黃酮（槲皮素）等成分外[5-8]，還含有大量的多糖成分，多糖可能是矮地茶潛在的藥效成分之一。同時(shí)，越來(lái)越多的中外學(xué)者認(rèn)為植物多糖是天然藥物中的主要藥效成分[9-10]。目前，關(guān)于矮地茶多糖的研究報(bào)道非常少，對(duì)多糖的單糖組成進(jìn)行研究是多糖結(jié)構(gòu)和生物活性深化研究的前提，基于此，筆者采用水提取、多次醇沉得到矮地茶多糖（AJP），用硫酸對(duì)AJP進(jìn)行水解，參照相關(guān)文獻(xiàn)[11-20]，采用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）兩種方法對(duì)矮地茶多糖中單糖組成和摩爾比進(jìn)行分析，為矮地茶多糖的深入研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電子分析天平（Mettler Toledo XS205型，德國(guó)，d=0.01 mg），超聲清洗器（上海科導(dǎo)，HS-2060），色譜柱（安捷倫TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），薄層層析硅膠（硅膠G板，10 cm×20 cm，中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司），0.22 μm微孔濾膜（針式濾器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津，LC-20A型），柱溫箱（日本島津，CTO-10AS），二極管陣列檢測(cè)器（日本島津，SPD-M20A）。

1.2 藥品和試劑

水（娃哈哈純凈水），乙腈（Tedia，美國(guó)，色譜純）。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，P109105-100 g，批號(hào)：L1401046）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖（Glu，10010518，批號(hào)：20150630）、木糖（Xly，63012034，批號(hào)：20151010）、鼠李糖（Rha，63010234，批號(hào)：20150526）、果糖（Fru，63003034，批號(hào)：20150505）和半乳糖（Gal，63004434，批號(hào)：20141211）對(duì)照品購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。矮地茶藥材購(gòu)自湖南省衡東縣中藥飲片廠（批號(hào)：20141026），藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬二醫(yī)院王竹鑫主任藥師鑒定為正品。其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 矮地茶多糖的制備

取矮地茶藥材粉末100 g，加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，過(guò)濾；濾渣再次加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮至200 mL；加入無(wú)水乙醇使醇濃度達(dá)到80%，4℃靜置6 h，過(guò)濾，取濾渣；濾渣再次加入200 mL水溶解，加入無(wú)水乙醇使醇濃度達(dá)到80%，4℃靜置6 h，過(guò)濾，取濾渣，即得AJP。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，AJP糖純度為96.8%。

2.2 試劑配制

2 mol/L的硫酸溶液：取850 mL水加入1L容量瓶中，量取109 mL濃硫酸沿著容量瓶壁緩慢加入，放冷至室溫，加水定容，搖勻，即為2 mol/L的硫酸溶液。0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液：精密稱取8.00 g氫氧化鈉于1 L容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。4 mol/L的氫氧化鈉溶液：精密稱取16.0 g氫氧化鈉于100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。0.1 mol/L的鹽酸溶液：量取9.0 mL濃鹽酸于1 L容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。0.5 mol/L的PMP溶液：精密稱取PMP 8.80 g于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液配制：分別稱取Gal（23.93 mg）、Rha（22.01 mg）、Fru（20.82 mg）、Xly（24.44 mg）和Glu（23.47 mg）于5 mL容量瓶中，加水定容，即得單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取各種單糖于同一5 mL容量瓶中，加水定容，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 矮地茶多糖的水解

取矮地茶多糖約50 mg于具塞試管中，加入2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴水解2 h。水解完成后，加2 mL 4 mol/L的氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，加少量水洗具塞試管兩次，洗液也轉(zhuǎn)移至同一容量瓶，加水定容，即為AJP水解液，備用。

2.4 TLC分析

取硅膠板105℃下活化30 min，取單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和矮地茶多糖水解液點(diǎn)樣，點(diǎn)樣順序?yàn)镕ru、Rha、Xly、Glu、Gal、AJP、AJP，點(diǎn)樣體積為5 μL。兩次展開(kāi)，展開(kāi)劑1∶正丁醇∶丙酮∶水體積比=4∶3∶1；展開(kāi)劑2∶正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶水體積比=8∶4∶7∶3。先用展開(kāi)劑1展開(kāi)至10 cm高度，取出晾干，再用展開(kāi)劑2展開(kāi)至10 cm高度，取出，晾干。顯色劑為2%二苯胺丙酮溶液∶2%苯胺丙酮溶液∶85%磷酸體積比=5∶5∶1。顯色條件為置105℃烘箱中加熱30 min。拍照記錄，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，AJP水解產(chǎn)物與Glu和Gal在相同位置顯示相同顏色斑點(diǎn)，在其余位置無(wú)斑點(diǎn)，表明AJP由Glu和Gal組成。

2.5 單糖對(duì)照品和樣品衍生化

分別精密量取單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（Fru、Rha、Xly、Glu、Gal）、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和AJP水解液100 μL放入編號(hào)的7支具塞試管中，進(jìn)行PMP衍生。步驟為：加入0.2 mol/L的NaOH水溶液500 μL，再加入0.5 mol/L的PMP溶液500 μL，混合均勻，在80℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后取出試管與自來(lái)水中冷卻至室溫，再加入0.1 mol/L的HCl水溶液1000 μL中和反應(yīng)液中的NaOH。用2 mL氯仿萃取三次，除去反應(yīng)剩余的PMP，取水層溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得衍生化樣品，供HPLC分析用。

2.6 色譜條件

色譜柱：C18，進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：乙腈-pH為7.0的磷酸緩沖液（20∶80，0.1%），檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，流速：1 mL/min；柱溫：25℃，分析時(shí)間35 min。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.7 線性關(guān)系考察

TLC結(jié)果表明，AJP中僅含有葡萄糖和半乳糖兩種單糖，所以該研究?jī)H對(duì)葡萄糖和半乳糖的線性關(guān)系進(jìn)行考察。分別取葡萄糖單糖標(biāo)準(zhǔn)液0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL于1 mL容量瓶中，加水定容至1 mL，按“2.5”項(xiàng)下條件衍生化，同法制備半乳糖不同濃度衍生化樣品。衍生化后進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖和半乳糖線性方程分別為：Y=2697.63X-28.69（r2=0.999 8）和Y= 3057.15 X - 56.83 （r2=0.999 5），線性范圍分別為：0.045～2.235 μg和0.046～2.279 μg。

2.8 精密度試驗(yàn)

取經(jīng)過(guò)衍生化后的單糖對(duì)照品溶液，按“2.6”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)行6次HPLC分析，記錄峰面積，葡萄糖和半乳糖的RSD分別為0.9%和1.0%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取AJP水解液PMP衍生化后的溶液，分別于放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)后，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，葡萄糖和半乳糖RSD分別為1.5%和1.1%，證明AIP水解液衍生化后在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次AJP樣品6份，每份約50 mg，按“2.3”項(xiàng)下條件水解，按“2.5”項(xiàng)下條件衍生化，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，計(jì)算樣品中葡萄糖和半乳糖含量。結(jié)果顯示葡萄糖和半乳糖含量RSD分別為1.7%、1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取同一批次已知葡萄糖和半乳糖含量的AJP樣品6份，每份約25 mg，按表1中的量加入葡萄糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按“2.3”項(xiàng)下條件水解，按“2.5”項(xiàng)下條件衍生化，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明方法加樣回收率符合含量測(cè)定要求。見(jiàn)表1。

2.12 矮地茶多糖中單糖組成分析

分別按上述方法測(cè)定三批AJP樣品的單糖組成，計(jì)算結(jié)果表明AJP由葡萄糖和半乳糖組成，三批次摩爾比分別為1∶2.36、1∶2.32、1∶2.40，平均值為1∶2.36。

3 討論

筆者考察了三氟乙酸、鹽酸、硫酸等三種酸溶液對(duì)矮地茶多糖進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)三氟乙酸水解不完全，而鹽酸水解條件不易控制，所以選擇效果最佳的硫酸溶液，通過(guò)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴2 h能完全將矮地茶多糖水解，且不會(huì)出現(xiàn)碳化現(xiàn)象。同時(shí)，本研究對(duì)PMP衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致衍生產(chǎn)物HPLC峰面積降低，80℃下衍生1 h以上能達(dá)到最大峰面積[21-33]。

通過(guò)TLC和HPLC兩種方法對(duì)矮地茶多糖中的單糖組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖兩種單糖組成。TLC方法簡(jiǎn)單快捷，可用于多糖中單糖組成的快速鑒別，操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器依賴程度低，但其缺點(diǎn)是不能進(jìn)行單糖摩爾比值等定量分析。HPLC方法操作相對(duì)較復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)衍生化后才能進(jìn)行檢測(cè)，但方法靈敏度高，分析單糖組成復(fù)雜的多糖其結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，同時(shí)可用于單糖摩爾比值等定量分析。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：361.

[2] 謝晶曦，王琳，劉春雪，等.草藥矮地茶止咳成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及合成[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1981，16（6）：425-427.

[3] 歐天芝.抗 “非典” 民族藥的整理[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2004（5）：279-281.

[4] 鄭民實(shí)，鄭有方.1000 種中草藥抑制乙型肝炎病毒表面抗原的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)雜志，1989，30（11）：687.

[5] 付成效，劉高峰，鄒渭洪，等.反相高效液相色譜法測(cè)定生地茶止咳合劑中巖白菜素的含量[J].中南藥學(xué)，2012， 10（2）：96-98.

[6] 徐昌艷，張麗艷，汪毅，等.苗藥矮地茶的 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材，2014（9）：1570-1573.

[7] 謝娟，宋良科，王恒，等.矮地茶的槲皮素與山奈酚含量測(cè)定[J].特產(chǎn)研究，2008，30（1）：55-57.

[8] 曹慶生，李志超，楊寶友，等.矮地茶黃酮對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].華西藥學(xué)雜志，2016，31（1）：43-45.

[9] 安曉娟，馮琳，宋紅平，等.植物多糖的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47（16）：1271-1275.

[10] 張怡，張甘霖，王笑民.中藥多糖抗腫瘤機(jī)制研究概況及思考[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（10）：2321-2323.

[11] 吳巖斌，張秀才，易駿，等.柱前衍生化 HPLC 法測(cè)定不同基源金線蓮多糖的單糖組成[J].中國(guó)藥房，2015，26（15）：2116-2119.

[12] 秦亞?wèn)|，汪榮斌，周娟娟，等.白芍多糖中單糖的組成分析[J].中藥材，2015（11）：2335-2338.

[13] 龔力民，劉偉，卓海燕，等.五倍子多糖相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成的測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（24）：34-36.

[14] 肖作奇.中藥多糖質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（4）：159-164.

[15] 李婭麗，張?jiān)椒?，劉哲，?響應(yīng)曲面法優(yōu)化人參皂苷及多糖微波輔助提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（16）：42-47.

[16] 萬(wàn)強(qiáng)，吳學(xué)昊，范華均，等.HPLC 衍生化法分析決明子多糖水解產(chǎn)物中單糖組分及其多糖組成特征的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33（11）：1231-1236.

[17] 尚姝，于青.HPLC-ELSD 法分析破壁靈芝孢子粉的多糖組成[J].中成藥，2015，37（6）：1272-1275.

[18] 曾榮香，張清華，管詠梅，等.柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定地稔多糖中單糖組成[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（10）：73-76.

[19] 饒君鳳，呂偉德，倪承珠，等.離子色譜法測(cè)定三葉青多糖中單糖組成[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（12）：42-44.

[20] 肖作奇.湖北麥冬多糖質(zhì)量控制與抗糖尿病活性研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2014.

[21] 孫彩華，付迎，蔣毅超.高效液相色譜法對(duì)生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016， 13（1）：9-12.

[22] 張璇，鄭兆浠，鄭劍斌，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定小鼠血漿中FG-4592濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（9）：14-17.

[23] 陳英紅，周婷婷，王穎.反相高效液相色譜法測(cè)定婦炎舒膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（6）：150-152.

[24] 張曉旭，王洪平，楊陽(yáng)，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速鑒別生曬參中的皂苷類成分[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（9）：130-136.

[25] 喬立業(yè)，巖林蘋(píng)，汪玥.高效液相色譜法測(cè)定通塞益腦口服液中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（21）：4-7.

[26] 鄒曉華，何偉康，戴安印，等.高效液相色譜法測(cè)定感冒熱毒清合劑中連翹苷的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（15）：117-119.

[27] 張彥飛，李智萌，蔡廣知.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定中藥茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（15）：124-127.

[28] 李洪亮.高效液相色譜法測(cè)定艾附暖宮丸中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（36）：21-23.

[29] 錢文慧，陸崟，廖欣.高效液相色譜法測(cè)定金寶腎片中卡托普利的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（12）：125-128.

[30] 李天鳳，李連坤，張美玲.反相高效液相色譜法測(cè)定不同方法炮制關(guān)木通中馬兜鈴酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（21）：14-17.

[31] 孫曉，郭耀武，楊瑞瑞.高效液相色譜法測(cè)定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（25）：95-98.

[32] 韓成花，白玉華，于春月，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（7）：91-93.

[33] 馬靜，賈燕花，王曉青，等.高效液相色譜法測(cè)定氯霉素泡騰片中氯霉素含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（19）：93-95.

（收稿日期：2016-07-20 本文編輯：趙魯楓）