鼠胚胎成纖維細(xì)胞三維培養(yǎng)修復(fù)大鼠全層皮膚缺損的效果及其機(jī)制

陳鳳超+陳民才+顏彤彤

[摘要] 目的 觀察鼠胚胎成纖維細(xì)胞三維培養(yǎng)修復(fù)大鼠全層皮膚缺損的效果，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析。 方法 采用組織塊法培養(yǎng)鼠胚胎成纖維細(xì)胞，將鼠尾膠原溶液和以血清重懸的鼠胚胎成纖維細(xì)胞溶液混合后形成凝膠構(gòu)建組織工程皮膚，移植于大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組30只全層皮膚缺損大鼠采用組織工程皮膚進(jìn)行修復(fù)。對(duì)照組30只全層皮膚缺損大鼠不做任何處理。兩組創(chuàng)面分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，計(jì)算微血管密度，觀察其愈合過程。 結(jié)果 術(shù)后20 d實(shí)驗(yàn)組用組織工程皮膚覆蓋的大鼠背部創(chuàng)面已完全愈合，新生上皮外觀與結(jié)構(gòu)和正常皮膚相似；對(duì)照組創(chuàng)面仍有痂皮覆蓋，去除痂皮可見肉芽組織紅潤致密，創(chuàng)面周圍新生上皮呈粉紅色，邊緣銳利皺縮。實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織中CD31表達(dá)及微血管密度均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 鼠胚胎成纖維細(xì)胞三維培養(yǎng)對(duì)動(dòng)物皮膚全層缺損的修復(fù)有很好的效果，在修復(fù)皮膚損傷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 胚胎成纖維細(xì)胞；三維培養(yǎng)；皮膚缺損；微血管密度

[中圖分類號(hào)] R641 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of three dimensional culture of rat embryonic fibroblasts in the treatment of full-thickness skin defect in rats. Methods Full-thickness skin wound was created on the back of rats. Tissue block method was used to culture rat embryonic fibroblast cells. The rat embryonic fibroblast cells resuspended in serum were mixed with tail collagen solution to structure tissue engineered skin. In the experimental group， full thickness skin defect rats （n=30） were transplanted with tissue engineered skin in the wound area. In the control group， full-thickness skin defect rats （n=30） were not given any special treatment. The microvascular density was calculated and the healing process was observed by HE staining and immunohistochemistry method. Results 20 d after operation， in the experimental group the wound areas transplanted with tissue engineering skin on the back of rat were completely healed； the appearances and structures of newborn epithelium were similar to the normal skin. The wounds of the control group did not show healing and were covered with scar； removing scab skin visibled granulation tissues were ruddy and compact； there were pink wounds around new epithelium， and shrinkage around tissue edges. In the experimental group， and the expression of CD31 and microvessel density in wound tissues were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. Conclusion Three dimensional culture of rat embryonic fibroblast cells has good curative effect for repairing the whole layer of skin defect in rats. This culture method may have a good clinical application prospects in the repair of skin damage.

[Key words] Embryo fibroblast； Three-dimensional culture； Skin defect； Microvessel density

皮膚是體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲的屏障。皮膚軟組織缺損嚴(yán)重可導(dǎo)致皮膚自我修復(fù)困難，經(jīng)久不愈，感染，甚至危及生命。目前臨床上主要采用自體皮膚移植或自體異體混合移植進(jìn)行修復(fù)[1-3]，異體皮膚移植容易產(chǎn)生免疫排斥，嚴(yán)重影響創(chuàng)面修復(fù)效果。成纖維細(xì)胞膠原凝膠（fibroblast populated collagen gel）是指用膠原溶液制備凝膠，對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維立體培養(yǎng)而形成的一種修復(fù)皮膚破損的體外模型。該模型在結(jié)構(gòu)和功能上都和皮膚的真皮層非常相近，有利于修復(fù)創(chuàng)面及改善預(yù)后效果[4-6]。本研究將成纖維細(xì)胞三維培養(yǎng)作為真皮替代物觀察對(duì)大鼠全層皮膚缺損修復(fù)的效果，為成纖維細(xì)胞膠原凝膠在皮膚組織工程及臨床中的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

孕齡16～19 d的SD大鼠10只；雄性SD大鼠60只，5月齡，體重200～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要儀器

VD-1320潔凈工作臺(tái)（德國Hermle），3111CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo），倒置生物顯微鏡（北京市半導(dǎo)體設(shè)備廠），培養(yǎng)皿，手術(shù)刀柄、刀片，巾鉗，持針器，有齒鑷，藥杯，彎盤，縫合針，蚊式鉗，消毒鉗，剪刀，眼科剪，眼科鑷，縫合線等。

1.3 主要試劑及藥品

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、膠原酶、小牛血清，均購于美國GIBCO公司；人IL-6、TGF-β1 ELISA試劑盒，購于北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；蘇木精染色液、伊紅染色液，購于廣州市欣源貿(mào)易有限公司，批號(hào)分別為474077、C0109。

1.4 方法

1.4.1 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 將10只處于妊娠16～19 d的大鼠處死，酒精浸泡消毒，無菌條件下分離胚胎，取鼠胚胎皮膚，用含雙抗的PBS清洗2～3次，將皮膚切成1～1.5 mm2小塊。用鑷子將切好的組織塊貼到培養(yǎng)瓶內(nèi)，在CO2孵箱內(nèi)孵育4 h，加入少量培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，然后將培養(yǎng)基加至正常量，隔2 d換1次液，當(dāng)成纖維細(xì)胞達(dá)到60%～70%，傳代培養(yǎng)。

1.4.2 鼠尾膠原制備 將上述處死的大鼠的尾部剪下，用75%乙醇浸泡消毒30 min，在無菌條件下抽出肌腱，用生理鹽水反復(fù)沖洗，剪碎，置于0.1%乙酸溶液中浸泡48 h。4℃低溫離心（10 000 r/min，30 mim）后取上清。放置在4℃冰箱過夜，取出后用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值，用100 g/L氯化鈉溶液反復(fù)鹽析，離心（1000 r/min，5 min）棄上清。用0.1%的乙酸溶解，保存在4℃冰箱備用。

1.4.3 成纖維細(xì)胞膠原凝膠制備 取上述第5代鼠胚胎成纖維細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長期時(shí)用胰蛋白酶37℃消化10 min，加入小牛血清終止反應(yīng)，20℃離心（1000 r/min，5 min）棄去上清液，加DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×1010個(gè)/L。細(xì)胞懸液∶5×DMEM∶膠原溶液按1∶2∶7比例混勻，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH為6。置于35℃培養(yǎng)箱孵育10 min，再加入適量的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

1.4.4 全層皮膚缺損模型制備及分組 SD雄性大鼠稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛（0.01 mL/g）麻醉。背部術(shù)區(qū)去毛，碘伏消毒，用眼科剪在背部中央剪去一個(gè)1 cm×1 cm大小的創(chuàng)面，制成全層皮膚缺損模型。根據(jù)皮膚修復(fù)方法不同將實(shí)驗(yàn)大鼠分為兩組，每組30只。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物采用胚胎成纖維細(xì)胞膠原凝膠移植修復(fù)，對(duì)照組動(dòng)物不做處理。各組創(chuàng)面均用紗布覆蓋。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)SD雄性大鼠背部造成全層皮膚缺損，分別在修復(fù)治療后5、10、15、20 d觀察各組大鼠皮膚愈合情況，愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合的創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%，拍照記錄。術(shù)后5、10、15、20 d各處死大鼠6只，取創(chuàng)面組織，冰凍切片，一組進(jìn)行HE染色，并于顯微鏡下觀察。另一組石蠟包埋，切0.5 μm薄片，用抗CD31單克隆抗體對(duì)皮膚組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。先用低倍光學(xué)顯微鏡觀察，選擇CD31陽性表達(dá)密度較高的6個(gè)區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)血管數(shù)，計(jì)算微血管密度（micro vessel density，MVD），即每平方毫米的微血管數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合情況

實(shí)驗(yàn)組（胚胎成纖維細(xì)胞膠原凝膠）修復(fù)的創(chuàng)面在術(shù)后5、10、15、20 d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的愈合率均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見表1。術(shù)后5 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面無感染，對(duì)照組出現(xiàn)紅腫、感染等不良反應(yīng)。術(shù)后10 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面邊緣呈粉紅色，新生肉芽紅潤、致密，觸之易出血，可見上皮生長明顯加速；對(duì)照組創(chuàng)面周圍紅腫，有白色膿苔覆蓋，去除膿苔可見蒼老水腫肉芽組織，創(chuàng)面邊緣圓鈍，新生上皮爬行不明顯。術(shù)后15 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面明顯縮小，新生上皮呈粉白色，發(fā)亮，肉芽新鮮紅潤致密；對(duì)照組創(chuàng)面有所縮小，仍有白色膿苔覆蓋，去除膿苔可見創(chuàng)面邊緣較圓鈍，肉芽水腫。術(shù)后20 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合，個(gè)別可見干燥痂皮，周圍上皮皺縮并可見有細(xì)毛長出；對(duì)照組創(chuàng)面明顯縮小，創(chuàng)面肉芽組織紅潤致密，創(chuàng)面周圍新生上皮呈粉紅色，邊緣銳利皺縮。

2.2 HE染色結(jié)果

術(shù)后5 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠愈合處標(biāo)本顯示有大量纖維細(xì)胞、微血管分布，并分泌大量膠原；對(duì)照組創(chuàng)面無明顯修復(fù)現(xiàn)象，部分有炎性反應(yīng)。術(shù)后10 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面可見新生皮膚附屬器及各層結(jié)構(gòu)開始分化，膠原纖維排列緊密；對(duì)照組膠原纖維排列疏松，膠原分泌少。術(shù)后15 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面表皮層次清晰，皮膚附屬器及各層結(jié)構(gòu)新生分化完全；對(duì)照組膠原纖維排列緊密，膠原分泌增多，皮膚結(jié)構(gòu)與周圍正常皮膚相似。術(shù)后20 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面可以觀察到表皮的基底層、顆粒層和角質(zhì)層；對(duì)照組創(chuàng)面亦可見大量纖維細(xì)胞和膠原，但各層新生結(jié)構(gòu)都處于修復(fù)階段。見圖1（封三）。

2.3 創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)及微血管密度

術(shù)后5 d，實(shí)驗(yàn)組CD31陽性細(xì)胞圍成很多大小不一的血管腔，對(duì)照組部分血管腔呈類圓形，部分無明顯管腔。術(shù)后5、10、15、20 d各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織微血管密度較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）、表2。

3 討論

目前研究的組織工程皮膚和生物敷料種類繁多，存在著耐磨性差、免疫排斥、培養(yǎng)時(shí)間長、治療費(fèi)用昂貴等突出問題[7-8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，體外擴(kuò)增同種異體鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，并用來修復(fù)鼠皮膚缺損，同時(shí)觀察其治療效果，這可能是一條修復(fù)皮膚缺損行之有效的途徑[9]。

成纖維細(xì)胞膠原凝膠是指用膠原溶液制備凝膠，對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維立體培養(yǎng)而形成的一種組織樣結(jié)構(gòu)。鼠胚胎成纖維細(xì)胞易于獲取，可以在體外進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并有性質(zhì)穩(wěn)定、增殖力強(qiáng)、持續(xù)分泌、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)，是非常理想的組織工程種子細(xì)胞[10-11]。膠原是存在于結(jié)締組織并由三條肽鏈形成的螺旋狀纖維狀蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)、動(dòng)物韌帶以及肌腱的主要組成部分，具有無毒、無害、生物相容性好、降解產(chǎn)物可被肌體吸收等優(yōu)點(diǎn)[12]。臨床與實(shí)驗(yàn)證明膠原有促進(jìn)表皮細(xì)胞生長、引導(dǎo)上皮細(xì)胞長入損傷區(qū)、促進(jìn)細(xì)胞再生和皮膚組織合成代謝的作用[13-14]，其主要作用機(jī)制是膠原（蛋白）含有細(xì)胞代謝所需要的必需氨基酸，可以加速成纖維細(xì)胞增殖分化，并且其三維空間結(jié)構(gòu)可以在細(xì)胞遷移時(shí)起支持和潤滑的作用[15-16]。除此之外，使用成纖維細(xì)胞膠原凝膠覆蓋傷口，可以加速局部皮膚的血管化速度，促進(jìn)血液循壞和新陳代謝，從而有利于缺損皮膚的修復(fù)[17-19]。

體內(nèi)細(xì)胞的生長環(huán)境都是三維的，是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)相互作用形成的一個(gè)和諧統(tǒng)一的整體。所以，三維培養(yǎng)的細(xì)胞才能夠更合理地反映體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)特征[20]。三維細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)合物更加接近皮膚的天然結(jié)構(gòu)，更有利于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鼠胚胎成纖維細(xì)胞三維培養(yǎng)修復(fù)大鼠全層皮膚缺損進(jìn)行研究，結(jié)果表明，三維培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞依附于鼠膠原纖維可較好地修復(fù)皮膚破損，愈合率高，術(shù)后20 d創(chuàng)面基本愈合，無免疫排斥，而對(duì)照組大鼠術(shù)后都不同程度出現(xiàn)皮膚紅腫、感染、肉芽組織蒼老水腫、上皮生長明顯緩慢等問題。實(shí)驗(yàn)組的新生血管MVD值術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）。對(duì)照組創(chuàng)面愈合遲緩，分析新生血管化障礙和/或延遲可能是其難以愈合的重要原因之一；而實(shí)驗(yàn)組胚胎成纖維細(xì)胞組織工程皮膚可以促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)殘存的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，促進(jìn)創(chuàng)面血管化，使得局部血供增加，抗感染能力明顯加強(qiáng)，從而加速創(chuàng)面愈合。通過HE染色可以看出，移植的胚胎成纖維細(xì)胞在體內(nèi)能夠繼續(xù)分泌膠原和細(xì)胞生長因子，促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，刺激成纖維細(xì)胞增殖和分化，從而有利于肉芽組織形成，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合。本研究為成纖維細(xì)胞膠原凝膠在皮膚組織工程及創(chuàng)傷整形外科中的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 尹凱，申傳安，馬麗，等.自體表皮細(xì)胞懸液移植修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2016，30（2）：219-223.

[2] 呂淑坤.表皮干細(xì)胞在組織工程創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用[J].中國組織工程研究，2012，16（27）：5126-5130.

[3] 孫寧，黃益洲，張憶，等.人胎盤蛻膜基層來源MSCs參與大鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)的研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2016，30（5）：631-637.

[4] Alastair S， Garfield. Derivation of Primary Mouse Embryonic Fibroblast（PMEF）Cultures [M]. New Jersey：Humana Press，2010，6（33）：19-27.

[5] 于姝媛，王蘋，湯勇，等.成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架促進(jìn)中耳黏膜上皮細(xì)胞的增殖[J]. 中國老年學(xué)雜志，2015， 35（20）：5730-5732

[6] 胡三強(qiáng)，王妍妍，馬永賓，等. 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)層制備[J].中國組織工程研究，2014，18（45）：7306-7311.

[7] 梁文清，周國芳，錢宇，等.多孔微球種子細(xì)胞儲(chǔ)庫型組織工程肌腱支架體外構(gòu)建[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2016， 24（1）：9-12.

[8] 阮洪江，李來峰，范存義，等.Smad7在肌腱粘連組織中的表達(dá)及對(duì)肌腱成纖維細(xì)胞纖維化的作用[J].中國矯形外科雜志，2016，24（5）：448-454.

[9] 劉輝輝，郭善禹.皮膚組織損傷修復(fù)的研究進(jìn)展[J].外科理論與實(shí)踐，2013，18（2）：188-192.

[10] Kim HS，Heo JI，Park SH，et al. Transcriptional activation of p21（WAF1/CIP1）is mediated by increased DNA binding activity and increased interaction between p53 and Sp1 via phosphorylation during replicative senescence of human embryonic fibroblasts [J]. Molecular Biology Reports，2014，41（4）：397-408.

[11] 王敏，薛曉東，謝沛霖，等.局部應(yīng)用NGF-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)的影響[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2013，27（2）：182-188.

[12] Rath G，Hussain T，Chauhan G，et al. Collagen nanofiber containing silver nanoparticles for improved wound-healing applications [J]. Journal of Drug Targeting，2015，24（6）：1-10.

[13] Thoma CR， Zimmermann M，Agarkova I，et al. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2014，69（70）：29-41.

[14] Silva EJNL，Senna PM，De-Deus G，et al. Cytocompatibility of Biodentine using a three-dimensional cell culture model [J]. International Endodontic Journal，2015， 49（6）：74-80.

[15] Mccorry MC，Puetzer JL，Bonassar LJ. Characterization of mesenchymal stem cells and fibrochondrocytes in three-dimensional co-culture： analysis of cell shape， matrix production， and mechanical performance [J]. Stem Cell Research&Therapy，2016，7（1）：1-10.

[16] Michiya M，Charles PC，Mitsuru A. Three-dimensional cell culture technique and pathophysiology [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2014，7（74）：95-103.

[17] 雷靜，劉旭昭，陳淡嫦，等.凝膠型膠原敷料修復(fù)糖尿病皮膚缺損及促進(jìn)血管再生[J].中國組織工程研究，2014， 18（52）：8456-8462.

[18] 董麗，馬紹英，徐勇杰，等.同基因細(xì)胞源組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2012，26（11）：1375-1380.

[19] 王敏，蘭亞，胡皓，等.以膠原水凝膠為支架構(gòu)建肝細(xì)胞三維培養(yǎng)系統(tǒng)[J].中國組織工程研究，2013，17（29）：5323-5330.

[20] 鄧鑫，羅茂，李蓉，等.血管周細(xì)胞在腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移過程中的作用研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床，2013，40（8）：483-485.

（收稿日期：2016-07-05 本文編輯：程 銘）