HPLC和TLC法對藍(lán)色簽字筆墨水分類鑒定研究

陳明星等

[摘 要] 結(jié)合薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC），分析市售32種不同廠家、不同品牌以及同一品牌不同規(guī)格的藍(lán)色簽字筆油墨成分。首先采用正丁醇：無水乙醇：水：冰醋酸=6：2：2：1（體積比）為展開劑，用TLC法對32支不同產(chǎn)地不同牌號(hào)藍(lán)色簽字筆字痕分析，再以甲醇-NH4HCO3緩沖鹽體系為流動(dòng)相，流速0.8mL/min進(jìn)行高效液相色譜分析。根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，可將32種藍(lán)色簽字筆分成9類。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜； 薄層色譜； 藍(lán)色簽字筆； 分類

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）04-061-04

[Abstract] Thin layer chromatography （TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） were employed to analyze the components contained in 32 different blue gel pen inks in this study. The components of 32 blue gel pen inks were analyzed by TLC with developing solvent containing n-butanol： ethanol： water： glacial acetic acid=6： 2： 2： 1. A better separation was archived using HPLC with mobile phases containing ammonium acid carbonate. The two methods are complementary to each other. This analysis of blue gel pen inks was found to be effective and credible.

[Key words] High performance liquid chromatography；Thin layer chromatography；Blue gel pen inks；Classification

前言

簽字筆由于具有書寫流暢、色彩鮮艷及價(jià)廉、環(huán)保等特點(diǎn)，逐漸成為人們最常用的筆種之一。在各類刑事、經(jīng)濟(jì)案件及民事糾紛中，經(jīng)常涉及到有關(guān)藍(lán)色簽字筆字跡檢驗(yàn)和鑒定。簽字筆墨水主要由溶劑、染料、增稠劑、穩(wěn)定劑和添加劑等組成。不同廠家或同廠家不同牌號(hào)簽字筆中成分有所不同，特別是其中的染料組成會(huì)有一些差異，這就為簽字筆種類鑒別提供依據(jù)。目前有關(guān)墨水分析的光譜法有紅外光譜法[1-2]、拉曼光譜法[3]；色譜法有薄層色譜法[4-5]，高效液相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳[8-9]等；還有用質(zhì)譜法鑒定墨水中染料的研究[10]。在這些分析方法中，光譜法特別是紅外和拉曼光譜法是無損分析，在墨水分類鑒定中發(fā)揮很大作用，但是由于墨水成分復(fù)雜，這些方法識(shí)別率相對較低[11-13]。與無損方法相比，有損和半有損的色譜方法識(shí)別率相對較高[14-16]。為此，本文首先用TLC對收集的藍(lán)色簽字筆進(jìn)行分析，根據(jù)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、顏色以及比移值將其分為9類。在此基礎(chǔ)上，使用HPLC以NH4HCO3緩沖鹽體系為流動(dòng)相，進(jìn)行分離、分類。將HPLC與TLC分類結(jié)果進(jìn)行比較，為更準(zhǔn)確地區(qū)分藍(lán)色簽字筆墨水種類提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器，Waters 717 Plus自動(dòng)進(jìn)樣器（Waters公司，美國）；色譜柱為Purospher STAR C18色譜柱（Merck公司，德國），Millipore超純水器（Millipore公司，美國）；微孔濾膜（0.45μm）。

1.1.2 試劑 甲醇、無水乙醇、異丙醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丁酮、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等為分析純。乙腈、甲醇為色譜純（Merck公司，德國）。

1.1.3 樣品 由中國、美國、英國、日本、德國以及中國臺(tái)灣等地生產(chǎn)的32支市售藍(lán)色簽字筆。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件 薄層色譜條件：實(shí)驗(yàn)使用德國Merck硅膠GF254層析板。展開劑為正丁醇： 無水乙醇： 水： 冰醋酸=6： 2： 2： 1。

HPLC條件：采用甲醇（A）-碳酸氫銨（0.01mol/L）（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，A相起始比例為45%，20min內(nèi)上升至67%，保持該比例至60min；柱溫：25 ℃；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長580nm。

1.2.2 樣品制備 將每支染料型藍(lán)色簽字筆在紙張上書寫筆道，用潔凈手術(shù)刀片取長2cm、寬0.5cm的筆道，剪碎，加入200μL60%甲醇，提取10min后，移出色痕提取液，用0.45μm濾膜過濾，使用HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)色簽字筆字跡提取液TLC結(jié)果

對市售的32支不同國家和地區(qū)、不同牌號(hào)的藍(lán)色簽字筆字痕提取液進(jìn)行TLC分析。通過斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、顏色、比移值Rf差異可以將藍(lán)色簽字筆分為9類（見表1）。

2.2 藍(lán)色簽字筆字痕提取液的分析

采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波段掃描，發(fā)現(xiàn)藍(lán)色簽字筆中染料最大吸收波長在670～500nm之間?？疾旒垙堉形镔|(zhì)如增白劑等對簽字筆色譜峰影響，發(fā)現(xiàn)紙張中物質(zhì)最大吸收峰位置均在350nm以下，可以認(rèn)為紙張對簽字筆墨水分析沒有影響。

用HPLC對這些簽字筆樣品進(jìn)行分離、分析，通過色譜圖中主要峰保留時(shí)間及所對應(yīng)的紫外光譜圖差異，也可將藍(lán)色簽字筆墨水分為9類，各類藍(lán)色簽字筆字痕提取液色譜圖（見圖1）。

由于各染料成分最大吸收波長不同，在580nm波長下，可以看到大部分物質(zhì)色譜峰（圖1），但是有個(gè)別物質(zhì)的色譜峰在圖上很小甚至看不到，需要在其他波長下才能看到，如第八類中的峰7的最大吸收峰為520nm，第九類中的峰9在660nm有最大吸收峰（見圖2）。

2.3 TLC斑點(diǎn)和HPLC色譜峰比對分析

為了確定TLC中的斑點(diǎn)與HPLC中色譜峰對應(yīng)關(guān)系，將每支筆樣品在薄層板上平行點(diǎn)20個(gè)樣，經(jīng)薄層展開后將顏色相同且Rf值相同的斑點(diǎn)刮下收集，加入一定量60%甲醇后過微孔濾膜，然后進(jìn)行HPLC分析。

經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，在TLC分析中所得到的斑點(diǎn)并不一定是純的化合物，有些是由2個(gè)或3個(gè)色譜峰組成，如Rf 0.39的銅綠斑點(diǎn)，其主要成分對應(yīng)第一至五類色譜圖中的峰1（lmax=630nm）。另外，在這個(gè)色譜峰前面還有一個(gè)含量較少的物質(zhì)，其最大吸收波長也是630nm。這種現(xiàn)象主要是由于染料不純造成，例如甲基紫染料實(shí)際上是由結(jié)晶紫、甲基紫和堿性品藍(lán)3種物質(zhì)的混合物；堿性艷藍(lán)B和堿性艷藍(lán)BO中也都含有少量脫甲基和脫乙基衍生物[10]。

將薄層色譜所得到分類結(jié)果與液相色譜法分類結(jié)果進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)：第一至五類色譜峰，均有一個(gè)Rf 0.39銅綠色的斑點(diǎn)，其對應(yīng)色譜圖峰1（t=10.4min，lmax=630nm）。對于第二、三、四、六類筆，都有Rf 0.46的亮粉紅色斑點(diǎn)，在色譜圖上對應(yīng)為峰2（t=30.0min，lmax=560nm）。在第一、三、七、九類色譜圖可以看出在38.2min位置都有一個(gè)較大的主峰，對比薄層的斑點(diǎn)，可知該峰對應(yīng)Rf 0.60藍(lán)色斑點(diǎn)，為峰4（t=38.2min，lmax=610nm）。對應(yīng)于Rf 0.60紫色斑點(diǎn)物質(zhì)的最大吸收波長可在590nm下觀察到的，其存在于在第六和八類色譜圖中，對應(yīng)峰3（t=37.8min，lmax=593nm）。第四類薄層上有Rf 0.7藍(lán)色斑點(diǎn)，對應(yīng)其色譜圖上峰5（t=52.1min，lmax=615nm）。第五類薄層上有Rf 0.7的紫色斑點(diǎn)對應(yīng)于色譜峰6（t=31.1min，lmax=615nm）。觀察第八類和第五類色譜圖，圖上的峰7（t=30.0min，lmax=520nm）和峰8（t=45.4min，lmax=550nm）分別對應(yīng)于具有熒光性質(zhì)的Rf 0.85的黃色和Rf 0.8的淺粉紅色斑點(diǎn)。峰6與峰7位置相近，區(qū)別在于峰6物質(zhì)最大吸收波長為615nm，而峰7最大吸收波長520nm，并非同一物質(zhì)。峰7對應(yīng)物質(zhì)色譜峰只有在520nm下才能看到（圖1-b）。第九類圖中峰9（t=2.5min，lmax=660nm）對應(yīng)薄層中Rf 0.0銅綠色

斑點(diǎn)。

簽字筆是近20年左右出現(xiàn)的新筆種，由于商業(yè)秘密原因，人們對其中染料成分知道的并不多，但是可以通過TLC分離其中成分并根據(jù)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、顏色和比移值進(jìn)行分析鑒定，也可以利用高效液相色譜法或毛細(xì)管電泳法來進(jìn)行分析、分離鑒定。

2.4 藍(lán)色簽字筆的樹形分類圖

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分類及對比，建立如下樹形模式識(shí)別（見圖3）。在此基礎(chǔ)上，對于組成相同的筆，可以選擇特定波長下（如580nm）各個(gè)色譜峰的相對面積比進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分[7， 9]。

3 結(jié)論

用薄層色譜法和高效液相色譜系統(tǒng)地對32支藍(lán)色簽字筆書寫字跡中染料進(jìn)行研究，能夠在所得實(shí)驗(yàn)條件下很好地分離藍(lán)色簽字筆中各類不同染料，對比2種方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可將藍(lán)色簽字筆墨水分為9類。將這2種分析方法結(jié)合使用，可以快速、準(zhǔn)確地對藍(lán)色簽字筆墨水進(jìn)行分類。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Zieba-Palus J， Kumicki M. Application of the micro-FTIR spectroscopy， Roman spectroscopy and XRF method examination of inks [J]. Forensic Science International，2006，185（5）：164-172.

[2] Kher A， Mulholland M， Green E， et al. Forensic classification of ballpoint pen inks using high performance liquid chromatography and infrared spectroscopy with principal components analysis and linear discriminant analysis [J]. Vibrational Spectroscopy，2006，40：270-277.

[3] 徐徹，湯純，楊延勇，等. 顯微激光拉曼光譜法鑒別黑色圓珠筆油墨的初步研究[J]. 法醫(yī)學(xué)雜志，2000，16（4）：244-245.

[4] 黃娟娟，賀江南. 藍(lán)色中性筆色痕種類的薄層色譜法分析[J]. 中國人民公安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，56（1）：1-4.

[5] 王志勇，王炳娟，鄒洪. 薄層色譜法鑒別黑色簽字筆油墨的種類[J]. 理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊，2009，45（1）：14-15.

[6] Samanidou V F， Nikolaidou K I， Papadoyannis I N. Development and validation of a gradient-HPLC-PDAD method for the identification of ballpoint pen ink components： study of their decomposition on aging for forensic science applications [J]. Journal of liquid chromatography & related technologies，2004，27（2）：215-235.

[7] 許榮富，劉克林，王燕軍，等. 高效液相色譜法用于藍(lán)色圓珠筆分類的研究[J]. 理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊，2008，23（5）：281-283.

[8] Fakhari A R， Breadmore M C， Macka M， et al. Non-aqueous capillary electrophoresis with red light emitting diode absorbance detection for the analysis of basic dyes [J]. Analytica Chimica Acta，2006，580（2）：188-193.

[9] Zou Hong， Wang Zhiyong， Ye Nengsheng， et al. NACE discrimination of black pen inks [J]. Chromatographia，2008，67（6）：483-486.

[10] Ng L K， Lafontanie P， Brazeau L. Ballpoint pen inks：characterization by positive and negative ion-electrospray ionization mass spectrometry for the forensic examination of writing inks [J]. Journal of Forensic Science，2002，47（4）：1238-1247.

[11] Dirwono W， Park J S， Agustin-Camacho M R， et al. Application of micro-attenuated total reflectance FTIR spectroscopy in the forensic study of questioned documents involving red seal inks [J]. Forensic Science International，2010，199（3）：6-8.

[12] Causin V， Casamassima R， Marega C， et al. The discrimination potential of ultraviolet-visible spectrophotometry， thin layer chromatography， and Fourier transform infrared spectroscopy for the forensic analysis of black and blue ballpoint inks [J]. Journal of Forensic Sciences，2008，53（6）：1468-1473.

[13] Huang T H， Wu T M. Spectral analysis of ball pen script by FTIR microscope with ATR objective [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis，2007，27（11）：2200-2202.

[14] Yao Y T， Song J， Yu J， et al. Differentiation and dating of red ink entries of seals on documents by HPLC and GC/MS [J]. Journal of Separation Science，2009，32（17）：2919-2927.

[15] Wang X F， Yu J， Xie M X， et al. Identification and dating of the fountain pen ink entries on documents by ion-pairing high-performance liquid chromatography [J]. Forensic Science International，2008，180（1）：43-49.

[16] Poon N L， Ho S S H， Li C K. Differentiation of coloured inks of inkjet printer cartridges by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography [J]. Science & Justice，2005，45（4）：187-194.