超臨界CO₂流體萃取苦丁茶多糖的工藝優(yōu)化

韋曉潔 銀慧慧 孟菲 趙武 劉偉 姜源明 覃振華 孫建華 陳海蘭

摘 要：為了探討超臨界CO2萃取廣西苦丁茶中多糖的工藝條件，該研究采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)分離苦丁茶多糖，利用苯酚-硫酸法對(duì)苦丁茶多糖含量進(jìn)行測(cè)定，并考察不同萃取溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、萃取壓力（20、25、30、35、40、45、50 MPa）、萃取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、夾帶劑（甲醇、95%甲醇、50%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、50%乙醇）以及夾帶劑（95%乙醇）用量（2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0 mL·min-1）對(duì)多糖得率的影響，通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)超臨界CO2萃取廣西苦丁茶多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)考察了苦丁茶多糖提取的主要影響因素，得到的最佳萃取工藝條件為萃取溫度50 ℃，萃取壓力40 MPa，夾帶劑流量3.5 mL·min-1，萃取時(shí)間150 min；采用苯酚-硫酸法對(duì)苦丁茶多糖含量進(jìn)行測(cè)定。在最優(yōu)萃取條件下得到的苦丁茶多糖的提取率為7.05%。由此可知，采用超臨界CO2流體萃取，具有提取溫度低、萃取率高、萃取周期短、低耗以及污染小等優(yōu)點(diǎn)，適用于苦丁茶多糖的提取。

關(guān)鍵詞：超臨界CO2，苦丁茶，多糖，單因素，正交實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q946.889

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）05-0590-06

Abstract：In order to discuss the process conditions for extracting polysaccharides from Ilex kudingcha by supercritical CO2 fluid，the polysaccharides from I. kudingcha were extracted and analyzed by supercritical CO2 fluid extraction. Phenol-sulfuric acid method was applied for the determination of polysaccharides. Effects of different extraction temperatures （35，40，45，50，55，60 ℃），extraction pressures （20，25，30，35，40，45，50 MPa），extraction time （30，60，90，120，150 min），cosolvents （methanol，95% methanol，50% methanol，ethanol，95% ethanol，50% ethanol） and cosolvent flow rates （95% ethanol） （2.0，2.5，3，3.5，4.0，4.5，5.0 mL·min-1） on the polysaccharides extraction rate were investigated and the process conditions for extracting polysaccharides from I. kudingcha by supercritical CO2 fluid were optimized through orthogonal experiments. Single factor and orthogonal experiments were used to investigate the factors on the yield of polysaccharides. The optimal operation conditions included extraction temperature 50 ℃，extraction pressure 40 MPa，extraction time 150 min，cosolvent flow rate 3.5 mL·min-1. The concentration of polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method and the extraction rate was 7.05% under the optimal extraction conditions. The results showed that supercritical CO2 fluid extraction technology was favorable for extracting polysaccharides from I. kudingcha with the advantages of low extraction temperature，high extraction rate，short extraction period，the environment-friendly and energy-saving.

Key words：supercritical CO2 fluid，Ilex kudingcha，polysaccharides，single factor，orthogonal experiments

苦丁茶（Ilex kudingcha），屬于冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，主要分布在我國(guó)兩廣地區(qū)和福建等地（Li et al，2013）。其含有茶多酚、黃酮、多糖、生物堿以及多種微量元素等藥效成分（車彥云等，2017）。茶多糖是一種復(fù)合多糖，作為一種天然活性物質(zhì)已被證實(shí)具有防治心血管疾病、抗氧化、降血脂、抗病毒以及降血糖等保健及藥用功效（Zhu et al，2014）。隨著對(duì)苦丁茶有效成分的研究，苦丁茶多糖得到了越來(lái)越多研究者的重視（Xu et al，2015）。目前，提取多糖的傳統(tǒng)方法有熱水浸提（謝旻皓等，2015）、酸提法（許春平等，2014）、醇提取法（Zha et al，2014）、水浴回流法（孫小梅等，2014）以及超聲波提取法（Li et al，2015）等。其中：酸提法的提取時(shí)間和溫度控制較嚴(yán)格，提取條件不易掌控；熱水浸提、水浴回流等提取法容易導(dǎo)致多糖物質(zhì)產(chǎn)生氧化、分解等反應(yīng)，極大地影響多糖類物質(zhì)的生物活性。這些方法都存在溶劑消耗大、環(huán)境污染、操作繁瑣、提取率低等缺點(diǎn)。超臨界CO2流體萃取技術(shù)（Sharif et al，2014； de Melo et al，2014）是一種新型的綠色提取技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品、化工、生物、中藥等研究中（Sahena et al，2009）。該技術(shù)能夠防止多糖物質(zhì)被氧化，使其生物活性得到最大限度保留，并且操作簡(jiǎn)便，在萃取過(guò)程中無(wú)試劑殘留、無(wú)污染以及低耗等。目前尚未見有超臨界CO2萃取苦丁茶多糖的相關(guān)報(bào)道，因此使用超臨界CO2萃取工藝改革傳統(tǒng)的苦丁茶多糖提取工藝具有重要意義。

本研究對(duì)超臨界CO2萃取廣西苦丁茶中多糖的工藝條件進(jìn)行了分析，采用苯酚-硫酸法對(duì)苦丁茶多糖含量進(jìn)行測(cè)定，考察了萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑以及夾帶劑濃度對(duì)多糖得率的影響，通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為苦丁茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、應(yīng)用以及藥物開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：泰爾超臨界CO2萃取系統(tǒng)Thar-SFE-5000；Milli-Q超純水儀（Millipore公司）；F160型粉碎機(jī)（ 北京中興偉業(yè)）；SQP型（精度0.01 mg）電子天平（德國(guó)Sartorious公司）；CAP225D型（精度0.1 mg）電子天平（德國(guó)Sartorious公司）；氣體CO2（99.99%，購(gòu)于廣西柳州富斯特工業(yè)氣體有限責(zé)任公司）。材料：苦丁茶（購(gòu)于廣西太華醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)地為廣西崇左）。

1.2 方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orosz et al，2016） 根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件以及影響超臨界CO2萃取的各因素的重要性，選取萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑、萃取夾帶劑用量5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察苦丁茶多糖的萃取得率。實(shí)驗(yàn)萃取溫度分別選擇35、40、45、50、55、60 ℃；萃取壓力分別為20、25、30、35、40、45、50 MPa；萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min以及夾帶劑分別選擇甲醇、95%甲醇、50%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、50%乙醇；夾帶劑（95%乙醇）用量選擇分別為2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0 mL·min-1。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以苦丁茶多糖得率為實(shí)驗(yàn)的考察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)從中選擇合適的萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間以及夾帶劑用量進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)（Zhao et al，2013）。因素水平表見表1。

1.2.3 苦丁茶多糖測(cè)定 采用苯酚-硫酸法（黃敏桃等，2014）對(duì)苦丁茶多糖進(jìn)行測(cè)定：精密稱取無(wú)水葡萄糖純品12.45 mg，超純水定容于50 mL容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 mL，置10 mL棕色容量瓶中，隨后再分別加入1.0 mL的6%苯酚溶液，輕搖混勻后再加入7.0 mL硫酸，混勻后于室溫下放置30 min，以超純水定溶，混勻，于482 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以橫坐標(biāo)為葡萄糖含量（mg·mL-1），縱坐標(biāo)為吸光度值做曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.049 9 C-0.001 5 （n=7），r=0.999 1。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算萃取得到的苦丁茶樣品中多糖的質(zhì)量濃度C，并計(jì)算萃取率（李加興等，2013）。

苦丁茶多糖萃取率（%）=C×V/m×100。

式中，C為苦丁茶多糖的質(zhì)量濃度，m為苦丁茶的質(zhì)量（g），V為經(jīng)超臨界萃取所得總苦丁茶多糖樣品溶液的體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 萃取壓力對(duì)萃取率的影響 采用95%乙醇作為夾帶劑，在萃取實(shí)驗(yàn)溫度為40 ℃、夾帶劑流量為2.0 mg·mL-1、萃取時(shí)間為60 min的條件下，分別測(cè)定不同萃取壓力下對(duì)苦丁茶多糖萃取率的影響（圖1）。由圖1可知，苦丁茶多糖的萃取率隨著萃取壓力的增高而升高，當(dāng)壓力超過(guò)40 MPa時(shí)，苦丁茶多糖的萃取率變化不大，甚至有下降的趨勢(shì)。當(dāng)增大萃取壓力時(shí)，使得萃取過(guò)程中超臨界CO2的密度增加，溶質(zhì)和溶劑之間的傳質(zhì)效率得到了提高，從而增大了苦丁茶多糖的溶解度，提高了萃取率。當(dāng)萃取壓力升高到一定程度時(shí)，目標(biāo)萃取物的萃取率并無(wú)明顯變化，并且，壓力過(guò)高使得萃取成本增高，同時(shí)高壓力不安全因素也增多。根據(jù)方差分析，萃取率在低于或高于40 MPa時(shí)具有顯著差異（P<0.05）。因此，選取萃取壓力為35、40、45 MPa進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響 在萃取壓力為40 MPa，提取時(shí)間為60 min，夾帶劑（95%乙醇）流量為2.0 mL·min-1的條件下，考察不同萃取溫度（35、40、45、50、55、60 ℃） 對(duì)苦丁茶多糖萃取率的影響（圖2） 。圖2結(jié)果顯示，苦丁茶多糖的萃取率隨溫度增高而升高，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，過(guò)高的溫度使得CO2的密度降低溶解能力也隨之下降，從而使得苦丁茶多糖的溶解度發(fā)生下降，同時(shí)過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致苦丁茶多糖的不穩(wěn)定性增加，使得其提取含量受到一定影響。根據(jù)此單因素實(shí)驗(yàn)，選擇正交實(shí)驗(yàn)的萃取溫度為45、50、55 ℃。

2.1.3 萃取時(shí)間的影響 圖3結(jié)果顯示，隨著萃取時(shí)間的增加，苦丁茶多糖的萃取率不斷增高，在萃取時(shí)間為120 min后，萃取率增加緩慢。由于萃取時(shí)間越長(zhǎng)，CO2流體能更充分地接觸苦丁茶物料，萃取越完全，并提高了萃取率。但當(dāng)萃取達(dá)到一定時(shí)間后，萃取率無(wú)明顯變化，此外萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能導(dǎo)致多糖產(chǎn)生不穩(wěn)定性而影響提取率，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的萃取還會(huì)帶來(lái)過(guò)高的萃取成本。因此，在本研究中，根據(jù)此單因素實(shí)驗(yàn)，選擇60、120、150 min萃取時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。

2.1.4 夾帶劑的影響 由于糖類化合物的羥基較多、分子量較大且極性較大，所以很難用低極性溶劑進(jìn)行萃取，因此為了提高提取率可在萃取過(guò)程中加入極性較高、選擇性好、安全的夾帶劑對(duì)多糖進(jìn)行提取。本研究分別選擇甲醇、95%乙醇、50%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、50%乙醇作為夾帶劑，考察夾帶劑在萃取過(guò)程中對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。流量為2.0 mL·min-1時(shí)，95%乙醇作為萃取夾帶劑具有較高提取率，因此，選擇95%乙醇作為苦丁茶多糖萃取的夾帶劑。

2.1.5 夾帶劑流量的影響 用萃取壓力40 MPa、萃取溫度50 ℃、提取時(shí)間90 min，分別設(shè)置夾帶劑流量在2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0 mL·min-1時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察夾帶劑流量對(duì)萃取苦丁茶多糖萃取率的影響（圖5）。方差分析表明，苦丁茶多糖得率與3.0～4.0 mL·min-1的夾帶劑流量差異顯著（P<0.05）。因此，根據(jù)此單因素實(shí)驗(yàn)，選擇3.0、3.5、4.0 mL·g-1的夾帶劑流量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)2.1的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑流量進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。 由表2可知，影響苦丁茶多糖萃取得率最顯著的因素是萃取溫度，其次為萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑流量，各因素不同水平影響次序?yàn)锳2>A3>Al，B2>B3>B1，C3>C2>Cl，D2>D3>Dl，A2B2C3D2為極差分析得到的最優(yōu)萃取條件組合，即萃取溫度50 ℃、萃取壓力40 MPa，夾帶劑流量3.5 mL·min-1、萃取120 min。在最佳工藝條件下對(duì)苦丁茶進(jìn)行3次萃取平行試驗(yàn)，平均萃取得率為7.05%。

3 討論與結(jié)論

萃取壓力（Wen et al，2015）對(duì)于目標(biāo)萃取物的萃取具有重要影響，萃取壓力是影響苦丁茶多糖超臨界CO2萃取過(guò)程中溶解度的一個(gè)重要參數(shù)。

萃取溫度對(duì)于苦丁茶多糖提取率也具有一定的影響（Dent et al，2013）。在超臨界萃取過(guò)程中夾帶劑起到助溶作用（Daporto et al，2014），能夠更有效地將目標(biāo)物提取出來(lái)。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，確定了萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間以及夾帶劑用量四個(gè)主要影響因素進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，探索出了苦丁茶多糖超臨界CO2流體萃取的最佳提取工藝，建立了一種超臨界CO2流體萃取法從苦丁茶中提取多糖的方法。相較于傳統(tǒng)的提取方法，超臨界CO2流體萃取能夠在低溫下萃取苦丁茶多糖并能夠最大限度保留多糖的生物活性；在整個(gè)萃取過(guò)程中唯一使用的有機(jī)試劑為夾帶劑（95%乙醇），能夠與CO2流體混溶提高了多糖的在CO2流體中的溶解度，并能夠在萃取結(jié)束后對(duì)夾帶劑進(jìn)行回收，無(wú)有機(jī)試劑殘留、無(wú)污染以；此外，超臨界CO2流體萃取苦丁茶多糖操作簡(jiǎn)便、低耗、生產(chǎn)周期短。

本研究建立的苦丁茶多糖超臨界CO2流體萃取法工藝條件穩(wěn)定可行，具有較好重現(xiàn)性，苦丁茶多糖的萃取得率達(dá)7.05%，優(yōu)于施思等（2010）和于淑池等（2015）的報(bào)道，與傳統(tǒng)的熱水浸提相比萃取得率提高了將近兩倍，可為苦丁茶多糖的有效提取以及苦丁茶的藥用價(jià)值以及保健作用的深入開發(fā)提供新的參考依據(jù)。

綜上所述，超臨界CO2流體萃取具有提取溫度低、萃取率高、萃取周期短、低耗以及污染小等優(yōu)點(diǎn)，適用于苦丁茶多糖的提取。

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