核桃葉多酚含量的測定和抗氧化能力的研究

魏歡 顏小捷 楊建文 李典鵬

摘 要：核桃又稱胡桃，全身是寶，除核桃仁可以直接食用外，其青皮、葉、枝、花、殼等均可入藥，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值。為了進(jìn)一步開發(fā)和利用核桃屬植物資源，該研究以核桃葉為材料，采用Folin-酚法，測定核桃葉75%乙醇提取物及石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后的各部分多酚的含量，通過DPPH·和ABTS·自由基清除法評價其抗氧化能力，并分析多酚含量與抗氧化能力的關(guān)系。結(jié)果表明：核桃葉提取物及其各萃取部分均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部分、正丁醇部分的IC50均高于VC，核桃葉75%乙醇粗提物（Ext.）與VC相當(dāng)，且多酚的含量和抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。這說明核桃葉的提取物可以作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品、保健品等行業(yè)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用核桃資源和提高核桃的經(jīng)濟(jì)效益提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：核桃葉，多酚，含量測定，抗氧化能力

中圖分類號：Q946，R931.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）05-0596-06

Abstract：Walnut is priceless and has important economic and medicinal values. Besides walnuts can be directly eaten，the green skin，leaves，branches，flowers，shells and so on can be used as medicines. In order to further develop the use of walnut plant resources，we determined polyphenols contents in 75% ethanol extracts of walnut leaves and petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol respectively，evaluated the antioxidant abilities of the extracts，and analyzed the relationship between polyphenols contents and antioxidant capacities. Polyphenols contents were determined by F-C method，and the antioxidant capacities were evaluated by DPPH· and ABTS· radical scavenging. The extracts of walnut leaves and their extracts and fractions showed some antioxidant activities. IC50 of ethyl acetate extract fraction and n-butanol extract fraction were higher than VC，Ext. and VC，and the polyphenols contents and antioxidant capacities showed a positive correlation. The extract of walnut leaves could be used as natural antioxidant in food，drugs，cosmetics，health care and other industries. The results of this experiment can provide some theoretical basis for the further development and utilization of walnut resources.

Key words：walnut leaf，polyphenols，content determination，antioxidant capacity

核桃（Juglans regia）是胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Juglans）落葉喬木，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，華北、西北、西南各省都有栽培，主要以山東、河南、陜西、甘肅、四川、貴州及新疆的南部所產(chǎn)最多（圖爾貢江·伊力亞則等，2015；翟梅枝等，2011）。近年來對核桃的研究主要集中在核桃仁、核桃青皮、核桃油等果實的利用方面，然而對于核桃葉的研究相對較少。常仁龍等（2009）研究表明核桃葉中除了含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、胡蘿卜外，還含有大量的醌類、多酚類、苷類、黃酮類等具有生物活性的物質(zhì)。核桃葉的藥理功能，我國民間早有記載，其制劑能改善新陳代謝，促進(jìn)肌體強(qiáng)壯，對患維生素缺乏癥、喉頭炎、淋巴結(jié)、甲狀腺腫大、結(jié)核病、黃膽病、婦科病、皮膚病等均有較好療效（潘亞琴等，2008）；核桃葉制茶，保健食品等方面的開發(fā)也有報道。尉芹等（2001）用乙醇、丙酮、水等提取溶劑提取核桃葉，結(jié)果表明提取物均有很強(qiáng)的抗氧化作用，其中以丙酮提取物抗氧化作用最強(qiáng)。何麗波等（2012）通過比較不同的采摘月份核桃葉提取物的抗氧化性，分析采摘時間與抗氧化性之間的關(guān)系，結(jié)果表明9月份采摘的核桃葉丙酮提取物的抗氧化能力最強(qiáng)。然而關(guān)于抗氧化作用的具體化合物的酚類結(jié)構(gòu)類型，以及多酚的含量與抗氧化能力之間的量效關(guān)系的研究很少報道。

植物多酚是多羥基類化合物的總稱，又稱為單寧，為植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于植物的皮、根、葉、果實中，易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，不溶于氯仿、苯等有機(jī)溶劑（趙揚帆和鄭寶東，2006）。近年來的研究發(fā)現(xiàn)植物多酚具有防治心血管疾病、抗炎、抗癌、抗氧化、抗衰老等廣泛的藥理活性，引起了人們的極大關(guān)注。為進(jìn)一步地研究核桃葉中多酚的含量，并建立一個測量核桃葉中多酚的測定方法，同時研究多酚的含量與其抗氧化能力之間的關(guān)系。本研究采用乙醇作為提取溶劑，并分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，并測定各部分的多酚含量及抗氧化能力，研究其生物活性，既可為醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等各行業(yè)提供研究思路和方法，又可以使核桃屬植物的副產(chǎn)物得到合理的利用，減少資源的浪費和環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的核桃葉于2016年7月購買于廣西壯族自治區(qū)河池市鳳山縣，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為胡桃科（Juglandanceae）胡桃屬核桃（Juglans regia），憑證標(biāo)本保存于廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室。

1.2 儀器

HH-S型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FN101-2A 鼓風(fēng)干燥箱（長沙儀器儀表廠）；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi Labortechnik AG CH-9230）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英予華儀器廠）；JA2003N 電子天平（上海菁海儀器有限公司）；電子天平XS225A-SCS（Precisa）；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試劑

無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司，批號為110601）；無水碳酸鈉（AR，廣州化學(xué)試劑廠，批號為830902）；沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所）；福林酚試劑（GOLDWHEAT）；抗壞血酸（VC，中國藥品生物制品檢定所）；純凈水；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma 公司）； 2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，美國Sigma公司）；其它試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 多酚的含量測定 有關(guān)對照品溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，參考之前的研究（顏小捷等，2013； 王亞鳳等，2016），以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用稍加改進(jìn)的Folin-酚比色法測定核桃葉提取物及各萃取部分的多酚含量。

1.4.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密吸取0，60，120，180，240，300 μL沒食子酸對照品溶液于試管中，加入Folin-酚試劑1 mL，混勻后靜置5 min，加入7.5%的Na2CO3溶液3 mL，加水至10 mL，于40 ℃水浴暗置60 min。760 nm波長下測定樣品的吸光度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 14.339X+0.003 7（n=7，R2=0.999 4），說明沒食子酸在0～36 μg范圍內(nèi)吸光度與含量具有良好的線性關(guān)系。

1.4.3 供試樣品溶液的配制 新鮮的核桃葉2.35 kg，陰干后粉粹，加入40 L 75%的乙醇，室溫浸泡提取3次，每次5 d，減壓濃縮提取液后，得浸膏434.7 g 。浸膏分別用適量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，然后濃縮干燥，得石油醚部分（24.9 g），乙酸乙酯部分（25 g），正丁醇部分（24.4 g），水部分（85.8 g）。分別精密稱取石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分、Ext.干浸膏20 mg，各加入50%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定容到刻度，搖勻，備用。分別精確移取上述供試樣品0.1 mL，按1.4.2顯色方式顯色，測得各部分樣品吸光度。

1.4.4 DPPH·自由基清除能力 采用80%的乙醇溶液分別配制核桃葉的提取物及各萃取部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75 mg·mL-1），精密移取0.5 mL的樣品溶液于PE試管中，再加入0.5 mL的DPPH·乙醇溶液（0.394 g·L-1）混勻，37 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，于室溫下測定各樣品在517 nm的吸光度，抗壞血酸（VC）作陽性對照，按照以下公式計算DPPH·清除率，并計算提取物及各部分樣品的半清除率質(zhì)量濃度（IC50）值（劉春麗等，2014；朱霞等，2014；WANG et al，2015）。

DPPH·清除率= [A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%。

式中，A空白為0.5 mL DPPH·溶液與0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液的吸光度，A對照為0.5 mL 80%乙醇溶液和0.5 mL樣品溶液的吸光度。

1.4.5 ABTS·自由基清除能力 采用80%的乙醇溶液分別配制提取物及各部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0、12.5、25、37.5、50、75、100 μg·mL-1）精密移取0.2 mL樣品溶液，再加入1 mL的ABTS·溶液，混勻，于室溫下黑暗處理反應(yīng)30 min后，在734 nm下測定樣品的吸光度，抗壞血酸（VC）作陽性對照，按照以下公式計算ABTS·清除率，并計算提取物及各部分樣品的半清除率質(zhì)量濃度（IC50）值（劉春麗等，2014；朱霞等，2014；Wang et al，2015）。

ABTS·清除率=[A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%。

式中，A空白為1 mL的ABTS·溶液與0.2 mL 80%的乙醇溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液的吸光度，A對照為0.2 mL樣品溶液和1 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃葉的多酚含量

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立的曲線方程為Y=14.339X+0.003 7（n=7，R2=0.999 4），曲線如圖1所示。

精密度實驗中計算得到RSD值為0.045%，說明該儀器精密度良好。穩(wěn)定性實驗中經(jīng)過計算得到RSD值為0.19%，表明該樣品在顯色后210 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。重現(xiàn)性實驗中計算得到RSD值為0.52%，說明該方法重現(xiàn)性良好。通過精密度實驗、 穩(wěn)定性實驗、重現(xiàn)性實驗表明該方法用來測定樣品的總酚含量科學(xué)有效。加樣回收率實驗中，得到樣品的平均回收率為99.45%，RSD為0.97%表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。

2.1.2 核桃葉提取物及各萃取部分的多酚含量測定 由表1可知，核桃葉提取物及其各萃取部分均含多酚類物質(zhì)，其中萃取后，乙酸乙酯部分和正丁醇部分多酚得到富集，含量更高。

2.2 抗氧化能力的測定

2.2.1 DPPH·自由基清除能力 從比較表1和表2可以看出，核桃葉75%乙醇粗提物及各萃取部分對DPPH自由基均表現(xiàn)了一定的清除能力。在同一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品的多酚含量與DPPH·清除能力具有明顯量效關(guān)系。提取物及各萃取部分對DPPH·的清除能力：乙酸乙酯部分 > 正丁醇部分 > VC > 水部分 > 石油醚部分。乙酸乙酯部分、正丁醇部分的清除能力強(qiáng)于對照VC，提取物的清除能力與VC相當(dāng)，石油醚部分和水部分的清除能力明顯比VC弱。

2.2.2 ABTS·自由基清除能力 從比較表1和表3可以看出，核桃葉75%乙醇粗提物及各萃取部分對ABTS自由基均表現(xiàn)了一定的清除能力。在同一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品的多酚含量與ABTS·清除力具有很明顯的量效關(guān)系。提取物及各部分樣品對ABTS·自由基的清除能力：乙酸乙酯部分 > 正丁醇部分 > VC > 粗提物 > 水部分 > 石油醚部分。乙酸乙酯部分、正丁醇部分的清除能力比VC強(qiáng)，粗提物的清除能力與VC相當(dāng)，而石油醚部分和水部分的清除能力明顯比VC弱。

通過以上實驗結(jié)果可以說明，核桃葉75%乙醇提取物及各萃取部分對DPPH·和ABTS·自由基均表現(xiàn)出一定的清除能力，且清除能力比較強(qiáng)的部分主要集中在乙酸乙酯部分和正丁醇部分。這說明經(jīng)過簡單的萃取操作后，可使核桃葉中的活性物質(zhì)得到一定的集中，可為后續(xù)分離純化核桃葉中的多酚類化合物提供一定的依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)上述研究結(jié)果，福林-酚法具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，可用于測定核桃葉和各萃取部分多酚含量。由于多酚類成分極性比較大，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，用不同極性的溶劑對核桃葉提取物干浸膏樣品進(jìn)行預(yù)處理，單從得率來看，效果較好，總回收率達(dá)到95.46%。預(yù)處理所得各部分樣品中，多酚含量最高的是乙酸乙酯部分（11.090%），其次是正丁醇部分（9.250%），含量最少的是石油醚部分（4.324%）。經(jīng)過不同的溶劑萃取后，多酚含量的測定結(jié)果表明，核桃葉中多酚類物質(zhì)得到了一定的集中。通過DPPH·和ABTS·自由基清除結(jié)果表明，核桃葉粗提物及其各萃取部分都具有一定的抗氧化能力，而且經(jīng)過溶劑萃取后，乙酸乙酯部分和正丁醇部分的抗氧化能力明顯增強(qiáng)，甚至超過VC 的抗氧化能力。這表明核桃葉粗提物與各萃取部分的抗氧化能力與其多酚的含量成正相關(guān)。

本研究前期的結(jié)果表明，核桃葉的多酚類物質(zhì)具有抗菌、抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛和抗氧化等藥理的功效。陳宇馳等（2017）通過使用MTS（溴化噻唑藍(lán)四氮唑）檢測H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的H9c2 細(xì)胞存活率，結(jié)果表明山核桃葉總黃酮可顯著地提高氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞中p-AKT 的表達(dá)，但其作用可被PI3Ks 抑制劑LY294002 抵消。張坤等（2013）采用小鼠扭體實驗和小鼠福爾馬林實驗研究山核桃葉總黃酮苷元的鎮(zhèn)痛作用，通過小鼠耳廓腫脹實驗和棉球肉芽腫脹實驗研究山核桃葉總黃酮苷元的抗炎作用，研究結(jié)果表明山核桃葉總黃酮苷元具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。朱亞新等（2014）通過研究核桃多酚提取物及單體對于酪氨酸酶活性和黑色素合成的影響及作用機(jī)理，結(jié)果表明核桃多酚提取物有很好的抑制、抗氧化以及減少黑色素的沉積作用。Forino et al（2016）從核桃葉的提取物中分離鑒定出5種化合物，并通過深入評估其影響HepG2和Caco-2細(xì)胞系中葡萄糖攝取的潛力，表明核桃葉的提取物具有改善人類高血糖的潛力，可以通過制成含有核桃葉提取物相關(guān)功能性飲品來治療糖尿病。

本研究更進(jìn)一步地驗證并且測定了核桃葉中的多酚類物質(zhì)含量，以及多酚含量與抗氧化能力的關(guān)系，建立了一個測量核桃葉多酚含量的方法，表明核桃葉中含有豐富的多酚類物質(zhì)，可以作為一種天然的抗氧化物質(zhì)應(yīng)用于食品、醫(yī)療、美容、保健品等各行業(yè)，可以為進(jìn)一步開發(fā)利用核桃資源，提高核桃的資源利用率和經(jīng)濟(jì)效益，以及研究其抑菌、抗氧化、殺蟲、抗腫瘤等生物方面的活性提供一定的理論基礎(chǔ)。

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