仙子益真膠囊對卵巢早衰小鼠外周血清性激素水平的影響

黃晉琰 林夏靜 徐珉

〔摘要〕 目的 觀察補(bǔ)腎填精中藥仙子益真膠囊對卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）模型小鼠性激素調(diào)節(jié)作用，初步探討仙子益真膠囊治療卵巢早衰的可能機(jī)制。方法 選用動情周期規(guī)律的SPF級雌性C57BL/6J性小鼠隨機(jī)分為空白對照組、造模組。造模組使用雷公藤多苷片造模成功后，再隨機(jī)分為模型組，益真低、中、高劑量組和西藥組，并予以相應(yīng)干預(yù)。治療結(jié)束后ELISA測定血清中雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）的含量。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組E2含量下降，F(xiàn)SH、LH含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，益真低劑量組、益真中劑量組、益真高劑量組、西藥組E2含量上升，F(xiàn)SH、LH含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)腎填精中藥仙子益真膠囊可以提高POF模型小鼠血清E2的含量，降低FSH、LH的含量，改善POF小鼠生殖內(nèi)分泌環(huán)境。

〔關(guān)鍵詞〕 卵巢早衰；仙子益真膠囊；中醫(yī)藥療法；性激素

〔中圖分類號〕R285.5；R711.75 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effect of Xianzi Yizhen Capsule， a Chinese patent drug for nourishing kidney-essence， on sex hormones in mice with premature ovarian failure（POF） and the possible mechanism of Xianzi Yizhen Capsule in the treatment of POF. Methods The specific pathogen-free female C57BL/6J mice with a regular estrous cycle were randomly divided into blank control group and model group. The mice in the model group were treated with Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets to establish a mouse model of POF and were then randomly divided into model group， low-， middle-， and high-dose Yizhen groups， and Western medicine group， and corresponding treatment was given. After the treatment ended， ELISA was used to measure the serum level of estradiol （E2）， follicle-stimulating hormone （FSH）， and luteinizing hormone （LH）. Results Compared with the blank control group， the model group had a significant reduction in E2 and significant increases in FSH and LH （P<0.01）. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose Yizhen groups and the Western medicine group had a significant increase in E2 and significant reductions in FSH and LH （P<0.01）. Conclusion In mice with POF， the kidney essence-nourishing traditional Chinese medicine Xianzi Yizhen Capsule can improve the serum level of E2， reduce the serum levels of FSH and LH， and improve reproductive endocrine environment.

〔Keywords〕 premature ovarian failure； Xianzi Yizhen Capsule； traditional Chinese medicine treatment； sex hormone

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲以前發(fā)生的排卵和卵巢分泌激素功能的紊亂和停止，出現(xiàn)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）升高，而雌二醇（estradiol，E2）降低，臨床主要表現(xiàn)為繼發(fā)性閉經(jīng)、絕經(jīng)、不孕，可能伴有圍絕經(jīng)期癥狀，如潮熱、出汗、煩躁以及骨質(zhì)疏松等。本病的發(fā)病率呈逐年上升且有低齡化趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，本病在40歲之前的發(fā)病率為1%～2%，在30歲之前的發(fā)病率為0.1%[2]，在20歲以前發(fā)病率為0.01%[3]。對于卵巢早衰，古代醫(yī)學(xué)無此病名，根據(jù)臨床癥狀屬“月經(jīng)過少”“血枯”“血隔”“閉經(jīng)”“月水先閉”“經(jīng)水早斷”等范疇。古今醫(yī)家對POF病因病機(jī)的認(rèn)識并不統(tǒng)一，但大抵認(rèn)為腎虛為該病的關(guān)鍵，且與心、肝、脾有關(guān)，故各醫(yī)家對POF的治療多從補(bǔ)腎著手[4-5]。

補(bǔ)腎填精中藥制劑仙子益真膠囊為廣東省名中醫(yī)李麗蕓教授經(jīng)驗(yàn)方，由熟地黃、女貞子、旱蓮草、川斷、菟絲子、淫羊藿組成，有滋腎養(yǎng)陰、益精養(yǎng)血之功，在治療月經(jīng)失調(diào)、不孕不育等疾病中有較好的臨床療效。既往研究顯示，補(bǔ)腎中藥周期療法可促進(jìn)腎中陰陽平衡及其協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化，達(dá)到健全黃體功能以助孕的目的[6]；給予補(bǔ)腎填精中藥益真膠囊治療后，通過觀察圍排卵期經(jīng)陰道多普勒超聲下卵子大小、形態(tài)及卵巢間質(zhì)血流的變化，提示可改善高齡不孕婦女圍排卵期卵巢間質(zhì)血流，加快卵泡生長，減少小卵泡排卵，具有改善卵子質(zhì)量、提高卵巢儲備的作用[7]。

為了進(jìn)一步闡述補(bǔ)腎填精中藥仙子益真膠囊治療卵巢早衰的作用，本實(shí)驗(yàn)通過雷公藤多苷片建立卵巢早衰小鼠模型，觀察仙子益真膠囊對小鼠外周血清性激素水平的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雌性C57BL/6J小鼠42只，體質(zhì)量（21.24±0.93） g，由廣東省中醫(yī)院科研動物實(shí)驗(yàn)中心提供，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011，動物合格證號為11400700203531。所有小鼠均經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查動情周期正常。清潔環(huán)境飼養(yǎng)，恒溫（24 ℃）、恒濕（60%）、自然晝夜節(jié)律光照，給予足夠的水和食物，通風(fēng)良好。

1.1.2 藥物與試劑 所有實(shí)驗(yàn)藥物均購自廣東省中醫(yī)院藥房。雷公藤多苷片，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司出品，規(guī)格為10 mg/片（批號20161001）。仙子益真膠囊為廣東省中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批號160904），其主要成分為熟地黃、女貞子、旱蓮草、川斷等。由院內(nèi)制劑室按上述藥物組成分別選料，經(jīng)過清潔、干燥、粉碎、消毒、浸泡、提取、制粒，粉碎裝膠囊，每粒重0.5 g，約含生藥量1.65 g。補(bǔ)佳樂（戊酸雌二醇片），由拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品，1 mg/片（批號2016278A）。

小鼠血清分析試劑為上海滬鼎生物科技有限公司的Mouse E2 ELISA Kit（貨號E-20380），Mouse FSH ELISA Kit（貨號E-20418），Mouse LH ELISA Kit（貨號E-20638）。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（型號為Multiskan FC，美國Thermo Fisher Scientific公司），微孔板恒溫振蕩器（型號為MB100-4P，杭州匯爾儀器）。

1.2 方法

1.2.1 造模 選擇性周期正常的健康雌性C57BL/6J小鼠42只隨機(jī)分為2組，空白對照組7只，造模組35只?？瞻讓φ战M予等容量生理鹽水灌胃。造模組參照文獻(xiàn)[8-9]造模方法，用雷公藤多苷片50 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃14 d造模。模型建立開始，每天通過觀察小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，了解小鼠動情周期變化，當(dāng)出現(xiàn)動情周期延長，陰道角化上皮細(xì)胞減少，有核上皮細(xì)胞混雜，表示建立模型成功。

1.2.2 分組及干預(yù) 造模成功后，將模型小鼠分為模型組及治療組。其中治療組包括益真低、中、高劑量組和西藥組。益真低劑量組：仙子益真膠囊0.75 g/（kg·d），益真中劑量組：仙子益真膠囊1.5 g/（kg·d）。益真高劑量組：仙子益真膠囊3 g/（kg·d），西藥組：補(bǔ)佳樂0.15 mg/（kg·d），模型組及空白對照組等容量生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)21 d。

1.2.3 檢測指標(biāo) 末次給藥結(jié)束后，各組小鼠禁食24 h，不禁水，取血3 mL，將所取血靜置30 min，2 000 r/min，離心10 min，取血清，ELISA 法測定血清E2、FSH、LH的含量，具體操作嚴(yán)格按藥盒說明進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以“x±s”表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，方差齊者，對兩個變量之間計(jì)量資料的比較行t檢驗(yàn)，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白對照組比較，模型組E2含量下降，F(xiàn)SH、LH含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從激素水平提示造模成功。與模型組比較，益真低劑量組、益真中劑量組、益真高劑量組、西藥組E2含量上升，F(xiàn)SH、LH含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。可見通過補(bǔ)腎填精中藥治療，改善了POF小鼠的性激素分泌水平。見表1。

3 討論

POF目前尚無理想的治療方法。對于無生育要求的患者，目前國內(nèi)外的治療均以激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）治療為主，維持其月經(jīng)周期來潮及體內(nèi)激素水平的穩(wěn)定。但大量的研究證實(shí)長期應(yīng)用HRT將增加乳腺癌、冠心病、卒中、阿爾茨海默病等的風(fēng)險[10]。開拓新的治療方法，是POF治療中需面臨的問題。

近年來，中醫(yī)藥治療POF有了很大的進(jìn)展。動物實(shí)驗(yàn)方面，張軍武[11]研究發(fā)現(xiàn)歸腎丸能夠降低POF大鼠血清中LH水平及升高E2含量，增大卵巢體積，優(yōu)化卵泡質(zhì)量，促使排卵；高慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎調(diào)沖方能使POF大鼠的卵泡數(shù)明顯增多，卵巢血供豐富，F(xiàn)SH及LH水平下降，E2水平上升。臨床治療方面，許多醫(yī)家對POF進(jìn)行分型論治，饒輝[13]將POF分為肝腎陰虛型、脾腎陽虛型、肝氣郁結(jié)型3型；黃愛萍等[14]將POF分為肝郁腎虛型、腎陽虛弱型、血虛火旺型3型治療，效果確切；另有醫(yī)家將月經(jīng)周期分為月經(jīng)后期、經(jīng)間期、經(jīng)前期、月經(jīng)期四期，根據(jù)每個時期不同的特點(diǎn)來進(jìn)行序貫用藥[15-17]；解娟等[18]采用滋腎育胎丸聯(lián)合克齡蒙治療POF，其臨床各種癥狀，LH、FSH、E2含量，子宮內(nèi)膜的改善程度均優(yōu)于單用克齡蒙。另外還有針灸治療，也取得一定的效果[19-20]。由此可見中醫(yī)藥治療POF有著一定的優(yōu)勢，己經(jīng)展現(xiàn)出廣闊的前景。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為， 腎為先天之本，藏精而主生殖，是人體生長發(fā)育、生殖的根本，故腎氣盛，則天癸按期而至，任通沖盛，月事如期而至，陰陽和而有子；腎氣盛，則腎精充足，化血有源，而血為女子月事來潮的根本，乃孕育之基礎(chǔ)。李麗蕓教授認(rèn)為，腎虛是POF的主因，是卵子難以發(fā)育成熟、排出障礙的根本原因。腎陰不足，則難以聚而為精，卵子缺乏形成的物質(zhì)基礎(chǔ)不能充分發(fā)育成熟；腎陽不足，則卵子缺乏排出的動力；腎精不足，腎陰陽俱虛，則卵巢功能不能正常發(fā)揮，這些都會導(dǎo)致無排卵，黃體功能不健，甚至卵巢早衰。因此，在治療上，調(diào)經(jīng)當(dāng)以補(bǔ)腎氣、益精血、培元固本、調(diào)養(yǎng)沖任為大法?，F(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃通過提高血中抗氧化相關(guān)酶的活性，有很好的抗氧化作用[21]；女貞子、旱蓮草有抗衰老的作用[22-23]；菟絲子可升高去勢雌性大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞雌激素受體數(shù)量[24]；淫羊藿對小鼠卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌二醇有直接刺激作用[25]。仙子益真膠囊選用熟地黃、女貞子、旱蓮草養(yǎng)血滋陰、填精益髓為君藥，川斷補(bǔ)腎暖腰膝為臣藥，佐以菟絲子、淫羊藿溫腎壯陽、補(bǔ)陽益陰，使其“陽得陰助而生化無窮，陰得陽升而泉源不竭”，以提升卵巢功能。

FSH和LH為促性腺激素，由腺垂體促性腺細(xì)胞分泌，是卵泡發(fā)育的必要激素，并能調(diào)節(jié)體內(nèi)E2的分泌。POF患者卵泡數(shù)目減少，由卵泡產(chǎn)生的E2也隨之降低，低水平的E2能夠通過下丘腦-垂體-卵巢軸的反饋?zhàn)饔茫龠M(jìn)垂體FSH分泌，從而導(dǎo)致FSH水平升高。反之，卵泡活動的恢復(fù)則表現(xiàn)為血液循環(huán)中FSH下降，E2升高[26]。本研究結(jié)果表明補(bǔ)腎填精中藥仙子益真膠囊治療POF的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸功能，從而干預(yù)應(yīng)激所致的雌性小鼠生殖內(nèi)分泌功能下降，提升卵巢功能。其作用途徑還有待于進(jìn)一步探討。

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