高血壓心衰大鼠證候本質及藥物干預研究

李欣春 梁昊 胡志希 胡思遠 鐘森杰 李琳 李杰 簡維雄 郭志華

〔摘要〕 目的 研究參附注射液和參麥注射液對高血壓心力衰竭大鼠的療效差異，通過“以方測證”理論推測高血壓心衰大鼠所屬中醫(yī)證型。方法 將60只Dahl鹽敏感性大鼠分為對照組、模型組、參附組和參麥組，每組15只，對照組使用低鹽飼料，其余三組使用8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)大鼠20周并予以相應干預，檢測大鼠血清氨基末端腦鈉肽前體（n-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP），彩色超聲多普勒檢測大鼠左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）及觀察HE染色心肌細胞。結果 與對照組比較，模型組LVEF和LVFS值均降低（P<0.05），NT-proBNP值升高（P<0.01）；與模型組比較，參附組LVEF和LVFS值明顯降低（P<0.05），NT-proBNP值升高（P<0.01）；參麥組LVFS值升高（P<0.05），NT-proBNP值降低（P<0.01）；與參附組比較，參麥組LVEF和LVFS值均升高（P<0.05）。結論 參麥注射液對高血壓心衰大鼠的療效顯著，參附注射液對高血壓心衰大鼠無效；高血壓心衰大鼠模型不屬于心陽虛證，最可能是心氣陰虛證；LVEF值保留及血壓升高可能是應用參附注射液的禁忌指標。

〔關鍵詞〕 高血壓；心力衰竭，方證對應；大鼠動物模型；中醫(yī)證型

〔中圖分類號〕R285.5；R541.3 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the traditional Chinese medicine （TCM） syndrome types in rats with hypertensive heart failure based on the theory of "Syndrome Differentiation Through Formula" by investigating the clinical efficacy of Shenfu injection versus Shenmai injection in rats with hypertensive heart failure. Methods A total of 60 Dahl salt sensitive rats were equally and randomly divided into control group， model group， Shenfu injection group （Shenfu group）， and Shenmai injection group （Shenmai group）. The control group was fed with low-salt feed， while the other three groups were fed with high-salt （8% NaCl） feed for 20 weeks and given respective interventions. The serum level of N-terminal-pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） was measured. The left ventricular ejection fraction （LVEF） and the left ventricular fractional shortening （LVFS） were determined by color Doppler ultrasound. And the myocardial cells with HE staining was observed under an electron microscope. Results Compared with the control group， the model group had significantly decreased LVEF and LVFS （P<0.05） and a significantly increased serum level of NT-proBNP （P<0.01）. Compared with the model group， the Shenfu group had significantly decreased LVEF and LVFS （P<0.05） and a significantly increased serum level of NT-proBNP （P<0.01）； the Shenmai group had a significantly increased LVFS （P<0.05） and a significantly decreased serum level of NT-proBNP （P<0.01）. Compared with the Shenfu group， the Shenmai group had significantly increased LVEF and LVFS （P<0.05）. Conclusion In rats with hypertensive heart failure， Shenmai injection has significant clinical efficacy， while Shenfu injection has no effect. The rat model of hypertensive heart failure is not identified as heart-Yang deficiency syndrome and is most likely to be heart-Qi and Yin deficiency syndrome. The preserved LVEF and increased blood pressure may be the contraindications for Shenfu injection.

〔Keywords〕 hypertension； heart failure； syndrome differentiation through formula； rat model； traditional Chinese medicine syndrome type

心力衰竭（心衰）是多種心臟病的終末期階段，發(fā)病率高[1-2]，隨年齡增加呈明顯上升趨勢，5年存活率與惡性腫瘤相仿，是嚴重威脅老年人健康的危重病、多發(fā)病[3]。盡管醫(yī)療技術飛速發(fā)展，但心衰的病死率和住院率依然居高不下[4]。

臨床研究表明[5]參附注射液治療舒張性心力衰竭療效顯著，并提出治療機制可能與改善心肌重構、抑制神經內分泌過度激活有關；然而又有臨床研究提出[6]，參麥注射液治療氣陰兩虛型舒張性心力衰竭有確切的療效；且多項研究表明二者在心力衰竭治療上均表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，比單純西藥治療效果更佳[7-8]。

但是，參附注射液在臨床上常用于治療陽虛證、陰竭陽脫證患者；參麥注射液臨床上廣泛用于氣陰兩虛型患者；參附注射液和參麥注射液適應中醫(yī)證型不同。因此，我們推測由不同病理機制導致的心衰大鼠模型存在中醫(yī)證型上的差異。為此，我們以高血壓心衰大鼠為研究對象，對比兩種注射液的療效差異，推測其中醫(yī)證候與病理本質。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Dahl鹽敏感性大鼠60只，體質量（220±10） g，由北京維通利華動物公司提供，動物合格證編號為：11400700134072，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級實驗室內。

1.2 儀器與主要試劑

超低溫冰箱Forma 900series，美國Thermo公司；5417R型小型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，深圳開立科技有限公司；智能無創(chuàng)血壓計BP-2010A，北京Softron公司；大鼠NT-proBNP ELISA試劑盒96T，CUSABIO公司，產品批號：CSB-E08752r；參麥注射液20 mL/瓶，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：1402225；參附注射液10 mL/瓶，雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：140205010。

1.3 造模方法

將60只Dahl鹽敏感性大鼠隨機分為對照組、參附注射液組（簡稱參附組）、參麥注射液組（簡稱參麥組）和模型組。每組15只，每3只老鼠一籠。對照組大鼠喂養(yǎng)0.3%NaCl低鹽飼料，其余3組大鼠喂養(yǎng)8%NaCl高鹽飼料，每籠每天喂養(yǎng)飼料60 g，自由取水，每2天換洗籠子1次。

1.4 模型評價

與對照組比較，參附注射液組、參麥注射液組和模型組3組大鼠血壓和血清NT-ProBNP含量顯著升高（P<0.01），LVEF、LVFS顯著下降（P<0.01），心肌HE染色病理檢查結果也有顯著變化，成功建立高血壓心力衰竭模型[9]。

1.5 干預方法

均通過腹腔注射方式給藥。查表得知以人的注射劑量作為參照系數(shù)（A1=36）換算大鼠用藥劑量系數(shù)（A2=6），按照人體質量（W1=60 Kg），大鼠體質量（W2=0.2 Kg），人體每日靜脈注射參附或參麥注射液（D1=60 mL）計算[10-11]，200 g大鼠參麥注射液與參附注射液每天的給藥劑量D2=（D1/W1）×（A1/A2）×W2為1.2 mL，每天1次，共給藥15 d。模型組大鼠注射等容量的注射滅菌用水。

1.6 檢測方法與指標

1.6.1 超聲心動圖檢測 用SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，在二維超聲引導下用M型超聲經胸骨左心室長軸切面測量左室舒張末期內徑（LVEDD），左室收縮末期內徑（LVESD），求3個心動周期的平均值，并按照Teichholtz公式計算左心室射血分數(shù)（LVEF）及左室短軸縮短率（LVFS）。

1.6.2 血壓檢測 將大鼠放入一端用網狀鐵絲封住的加熱套筒內，套筒溫度設置在38 ℃，用特制帆布裹住大鼠臀部并露出尾巴。加熱3～5 min后，將測壓儀套入距離尾根部3～5 cm處，開始測壓。選取3 min內連續(xù)測得收縮壓波動范圍不超過5 mmHg的3組血壓值，并取3組收縮壓平均值做為每只大鼠的血壓監(jiān)測值。在飼養(yǎng)的20周內，每15天測量大鼠血壓1次。

1.6.3 血清樣本制備及微觀指標檢測 在取材前大鼠經10%水合氯醛按4 mL/kg計量腹腔注射麻醉后，使用采血針和采血管給大鼠腹主動脈取血，采血完畢常溫靜置20 min后，以3 500 r/min離心10 min，立即提取上清液分裝在離心管里，置-80 ℃冰箱里保存。待測時，先將血清室溫放置2 h后，1 000 r/min離心15 min，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對血清樣本進行NT-proBNP含量檢測。

1.6.4 心肌細胞染色 取出大鼠心臟后經固定、脫水、包埋以及切片后，將心臟切片用蘇木精—伊紅染色法染色，在光鏡下以400倍觀察各組心肌細胞形態(tài)學變化。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據以“x±s”表示，經正態(tài)性檢驗，方差齊性檢驗，當滿足方差齊性時，兩兩比較采用LSD法；方差不齊則采用Dunnetts T3法；P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠存活情況

造模期間，對照組15只大鼠全部存活，無一死亡；模型組15只大鼠死亡5只，剩余10只；參附組死亡8只，剩余7只；參麥組死亡7只，剩余8只；治療期間，各組大鼠均無死亡。

2.2 血壓監(jiān)測圖

從圖1可以看出，模型組、參附組和參麥組大鼠血壓從低于140 mmHg開始逐步上升至200 mmHg，最終模型組穩(wěn)定在此階段，而從第120天開始參附組和參麥組組內平均血壓有所下降，或與飼養(yǎng)后期大鼠因死亡數(shù)量下降有關；而對照組大鼠血壓一直穩(wěn)定在140 mmHg左右。因此，可確定該模型組大鼠長期存在高血壓，可能對心臟有損害。

2.3 各組大鼠心肌細胞形態(tài)學觀察

觀察結果顯示（圖2），對照組心肌結構清晰，心肌閏盤、橫紋清晰，心肌細胞核位于邊緣，核大小、形態(tài)正常；模型組心肌結構模糊，心肌閏盤不清，橫紋消失，肌纖維呈波浪形排列，細胞間縫隙增大，心肌細胞水腫增大或溶解，出現(xiàn)大量的炎癥細胞；與模型組比較，參附組改善作用不顯著，而參麥組心肌細胞結構清晰，肌纖維排列整齊，無水腫等病理變化。

2.4 各組大鼠LVEF、LVFS和NT-proBNP比較

與對照組比較，模型組LVEF和LVFS值均降低（P<0.05），說明成模質量較好；與模型組比較，參附組LVEF和LVFS值明顯降低 （P<0.05），參麥組LVFS值升高（P<0.05）；與參附組比較，參麥組LVEF和LVFS值均升高（P<0.05）；與對照組比較，模型組大鼠NT-proBNP值升高（P<0.01），提示造模方法較好，模型較為成功；與模型組比較，參附組NT-proBNP值升高（P<0.01），參麥組NT-proBNP值降低 （P<0.01）。見表1。

3 討論

由于方劑與證型之間的多效性，一個證型可以用不止一首方治療后有確切的療效。又根據“以方測證”的理論，即依據方劑的功效或其組成藥物的功效推測或反證其對應證候的屬性。不管運用何種辨證方法，最后總要落實到一個證和一個或幾個與之相對應的方劑上，方劑乃是根據證而立法選藥、配伍組合而成，證與方劑之間愈是絲絲入扣，療效就愈佳[12]。為了更合理確定動物模型的中醫(yī)證型，所以在選擇治療藥物時，應從藥物治療功效上將其所治療的中醫(yī)證型區(qū)分開[13]。因此，我們選擇了參附注射液和參麥注射液作為對比治療藥物。參附注射液主要成分為紅參和附子，具有益氣溫陽、回陽救逆的功效，在臨床上常用于治療陽虛證、陰竭陽脫證患者；參麥注射液源自古方生脈散，為紅參和麥冬提取物，具有益氣復脈、養(yǎng)陰生津的功效，臨床上廣泛用于氣陰兩虛型患者。有研究表明[14-15]，參附注射液能提高充血性心力衰竭患者心輸出量、射血分數(shù)，增強心臟的收縮功能，改善心功能不全的臨床癥狀和體征。參麥注射液則能改善心臟的舒張功能，同時也能改善心衰患者的射血分數(shù)。

本模型通過長期維持大鼠高血壓狀態(tài)，最終導致大鼠心臟損傷，從而引起心力衰竭，與人類高血壓心臟病造成的心力衰竭非常類似。多項研究表明高血壓心衰不同于普通心衰，它不僅伴隨血壓升高，而且多為射血分數(shù)保留的心力衰竭[16-17]。NT-proBNP是當前診斷心力衰竭最為準確的生物學指標，半衰期時間長，體外穩(wěn)定時間長達24 h，在血液中有累積作用，且不受所選藥物的影響，因此有較高的靈敏度和特異度[18]。NT-proBNP水平受心肌張力強度影響，能反映心衰的嚴重程度，對預后有重要的參考價值[19]。結合模型組大鼠血壓一直保持在180 mmHg以上，并且心肌細胞溶解斷裂情況嚴重，射血分數(shù)和左室短軸縮短率降低，NT-proBNP水平升高，提示模型組大鼠存在因高血壓導致的心肌細胞重塑，左室舒張功能減退，射血功能降低符合心衰的病理變化。

實驗結果表明，參附注射液組治療后NT-proBNP水平升高，LVEF和LVFS降低，心肌細胞染色結果與模型組對比差異不明顯，說明病情不但沒有好轉，反而比模型組加重；而參麥注射液組NT-proBNP比模型組降低，大鼠LVEF、LVFS和心肌組織形態(tài)學結果明顯好轉，證實參麥注射液對高血壓心衰有良好的治療效果而參附注射液沒有，因此，我們從“以方測證”角度說明了該模型不屬于心陽虛證，最可能是心氣陰虛證；LVEF值保留及血壓升高可能是應用參附注射液的禁忌指標。結合本課題組前期研究結果[20-22]，說明通過不同方式造成的大鼠心衰模型確實存在中醫(yī)證型的差異，為中醫(yī)證候模型研究提供了新的思路，也是對我們課題組前期基于不同心衰模型的證本質研究的重要補充。

本次實驗仍有不足之處。心衰后水液代謝明顯障礙，或由于長期大量攝入鈉鹽極易引起腎小球濾過功能降低、近端小管及遠端小管重吸收能力減弱導致大量蛋白丟失、血容量下降、腸道蠕動減弱[23]，以至于大鼠生命后期體格瘦小，腹部膨隆，經解剖發(fā)現(xiàn)明顯腸梗阻，這也是飼養(yǎng)后期大鼠死亡的主要原因，與臨床中腎衰竭合并腸梗阻的病理相符[24]，值得深入研究。

參考文獻：

[1] BUI A L， HORWICH T B， FONAROW G C. Epidemiology and risk profile of heart failure[J]. Nat Rev Cardiol，2011，8（1）：30-41.

[2] 王 文，朱曼璐，王擁軍，等.《中國心血管病報告2012》概要[J].中國循環(huán)雜志，2013，28（6）：408-412.

[3] STEWART S， EKMAN I， EKMAN T， et al. Population Impact of Heart Failure and the Most Common Forms of Cancer A Study of 1162309 Hospital Cases in Sweden （1988 to 2004）[J]. Circulation： Cardiovascular Quality and Outcomes， 2010， 3（6）： 573-580.

[4] ROSS J S， CHEN J， LIN Z， et al. Recent national trends in readmission rates after heart failure hospitalization[J]. Circulation： Heart Failure， 2010， 3（1）： 97-103.

[5] 楊 萍，李 華，章永南，等.參附注射液治療舒張性心力衰竭的臨床療效及機制研究[J].中藥藥理與臨床，2014，30（4）：116-119.

[6] 褚慶民，李 榮，張 瑤，等.參麥注射液治療氣陰兩虛型舒張性心力衰竭療效觀察[J].山東中醫(yī)藥大學學報，2013，37（4）：305-307.

[7] 陳弘東，謝雁鳴，王連心，等.參麥注射液輔助治療慢性心力衰竭的有效性及安全性系統(tǒng)評價[J].中國中藥雜志，2014，39（18）：3650-3661.

[8] 侯雅竹，毛靜遠，王賢良，等.參附注射液治療心力衰竭的系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學雜志，2011，11（3）：292-299.

[9] 李欣春，梁 昊，胡志希，等.高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（3）：245-248.

[10] 嚴治濤，羅文利，黃金梅，等.不同劑量參附注射液治療慢性心力衰竭的臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（2）：636-640.

[11] 楊 靖，李 霖，謝雁鳴，等.參附注射液治療冠心病臨床用藥方案實效研究[J].中國中藥雜志，2013，38（18）：3099-3103.

[12] 張?zhí)m鳳，王永炎.方證對應研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（1）：8-10.

[13] 盧林竹，胡志希，李 琳，等.“以方測證”法在動物模型研究中的運用[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（5）：570-573.

[14] 賀澤龍，鄒曉玲.參附注射液對充血性心力衰竭患者血流動力學的影響及機理探討[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2001，21（5）：386-387.

[15] 王燕麗，劉 捷，張光泰.999參麥注射液治療左室舒張功能不全60例[J].遼寧中醫(yī)雜志，1999（11）：508-509.

[16] KLOTZ S， HAY I， ZHANG G， et al. Development of heart failure in chronic hypertensive Dahl rats： focus on heart failure with preserved ejection fraction[J]. Hypertension， 2006，47（5）：901-911.

[17] KOKUBO M， UEMURA A， MATSUBARA T， et al. Noninvasive evaluation of the time course of change in cardiac function in spontaneously hypertensive rats by echocardiography[J]. Hypertens Res， 2005，28（7）：601-609.

[18] 中華醫(yī)學會心血管病學分會，中華心血管病雜志編輯委員會.中國心力衰竭診斷和治療指南2014[J].中華心血管病雜志，2014，42（2）：98-122.

[19] GERGEI I， KR？魧MER B K， SCHARNAGL H， et al. Propeptide big-endothelin， N-terminal-pro brain natriuretic peptide and mortality. The Ludwigshafen risk and cardiovascular health （LURIC） study[J]. Biomarkers， 2017，22（3/4）：315-320.

[20] 胡志希，吳 濤，李欣春，等.基于中藥制劑干預心肌梗死心衰大鼠的中醫(yī)證型研究[A].中國中西醫(yī)結合學會診斷專業(yè)委員會.中國中西醫(yī)結合學會診斷專業(yè)委員會第十次全國學術會議論文集[C].河北秦皇島：中國中西醫(yī)結合學會，2016：107-114.

[21] 胡思遠，殷宏亮，李欣春，等.運動康復聯(lián)合參附注射液對心肌病心衰大鼠血流動力學的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（7）：715-718.

[22] 董文波，胡思遠，吳 濤，等.參附注射液與參麥注射液對阿霉素誘導慢性心衰大鼠血流動力學指標的影響[A].中國中西醫(yī)結合學會診斷專業(yè)委員會.第九次全國中西醫(yī)結合診斷學術研討會論文集[C].北京：中國中西醫(yī)結合學會，2015：4.

[23] NERBASS F B， PECOITS-FILHO R， MCINTYRE N J， et al. High sodium intake is associated with important risk factors in a large cohort of chronic kidney disease patients[J]. Eur J Clin Nutr， 2015， 69（7）：786-790.

[24] 洪漢利，陳統(tǒng)清，許玉燕，等.腎病綜合征并發(fā)低位小腸梗阻1例報告[J].吉林醫(yī)學，2014，35（2）：444-445.