蒼附導痰湯對米非司酮誘導PCOS大鼠卵巢形態(tài)及雄激素的影響

和夢珂 張靜 李昕 李凌楠 石靜紋 郭健

〔摘要〕 目的 探討蒼附導痰湯對米非司酮誘導多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome， PCOS）大鼠卵巢形態(tài)及雄激素的影響。方法 60只Wistar大鼠分為正常組、模型組、二甲雙胍組和蒼附導痰湯高、中、低劑量組。采用皮下注射米非司酮造模并以陰道涂片監(jiān)測大鼠發(fā)情周期，造模成功后各組灌胃干預9 d，處死動物，稱量雙側卵巢質(zhì)量，HE染色觀察卵巢形態(tài)及卵泡發(fā)育情況，放射免疫法測定血清睪酮水平。結果 和正常組比較，模型組大鼠血清睪酮水平、卵巢指數(shù)、竇前卵泡及初級卵泡數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；和模型組比較，中藥組及二甲雙胍組大鼠血清睪酮、竇前卵泡數(shù)量、初級卵泡數(shù)量都明顯降低（P<0.05）。結論 蒼附導痰湯作用于米非司酮誘導的PCOS大鼠，可降低血清睪酮水平，使PCOS大鼠竇前卵泡、初級卵泡數(shù)量明顯減少，改善卵巢多囊樣改變。

〔關鍵詞〕 蒼附導痰湯；米非司酮；多囊卵巢綜合征；卵巢形態(tài)；睪酮；竇前卵泡

〔中圖分類號〕R285.5；R711.75 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Cangfu Daotan Decoction on ovarian morphology and androgen in rats with mifepristone-induced polycystic ovarian syndrome（PCOS）. Methods Sixty Wistar rats were divided into normal group， model group， metformin group， high-dose Cangfu Daotan Decoction group， medium-dose Cangfu Daotan Decoction group， and low-dose Cangfu Daotan Decoction group. A rat model of PCOS was established by subcutaneous injection of mifepristone. The oestrous cycle was monitored by vaginal smear. The rats received drugs by gavage for 9 days after successful establishment of the model. The rats were sacrificed， and both ovaries were weighted. HE staining was used to observe the ovarian morphology and follicular development. Radioimmunoassay was used to measure the level of serum testosterone. Results The model group had significantly increased serum testosterone， ovary index， and numbers of preantral and primary follicles than the normal group （P<0.05）. The Cangfu Daotan Decoction groups and the metformin group had significantly reduced serum testosterone and numbers of preantral and primary follicles compared with the model group （P<0.05）. Conclusion For rats with mifepristone-induced PCOS， Cangfu Daotan Decoction can reduce the level of serum testosterone and the numbers of preantral and primary follicles. As a result， the quality of the ovary in rats is reduced and the polycystic changes in the ovary are improved.

〔Keywords〕 Cangfu Daotan Decoction； mifepristone； polycystic ovarian syndrome； ovarian morphology； testosterone； preantral follicle

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome， PCOS）是婦科常見的內(nèi)分泌代謝紊亂綜合征，發(fā)病率占生育年齡婦女的5%～10%。PCOS導致的高度不孕率對患者的身心造成了極大的傷害，但由于PCOS發(fā)病原因不明、病理涉及多系統(tǒng)、臨床表現(xiàn)多態(tài)性，使得PCOS的治療出現(xiàn)多法多方[1-3]。臨床常見PCOS的中醫(yī)分型有腎陰虛、腎陽虛、痰濕阻滯、肝經(jīng)濕熱、氣滯血瘀等[4]。針對痰濕阻滯型PCOS患者，臨床應用蒼附導痰湯療效顯著[5-9]，然具體的作用機制有待進一步研究，本實驗主要探討蒼附導痰湯對米非司酮誘導的PCOS大鼠卵巢形態(tài)及雄激素的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6周齡Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20） g，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SYXK（京）2014-0010。60只大鼠先隨機分出正常組6只，實驗組54只。實驗組中44只大鼠造模成功，再隨機分為模型組8只，二甲雙胍組及蒼附導痰湯高、中、低劑量組各9只。

1.2 藥品及試劑

蒼附導痰湯由蒼術10 g，香附10 g，半夏10 g，陳皮10 g，茯苓15 g，膽南星5 g，枳殼10 g，生姜6 g，炙甘草10 g組成[10]，購于北京中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，制成顆粒劑。蒼附導痰湯高劑量組、中劑量組、低劑量組濃度比為4∶2∶1。鹽酸二甲雙胍（北京京豐制藥有限公司，國藥準字H11021518）；米非司酮片（北京紫竹藥業(yè)有限公司，國藥準字H10950003）； PBS干粉、瑞氏染液、蘇木素、伊紅購于北京百諾威生物科技有限公司；甲醛、乙醇購于北京健力園醫(yī)療器械有限公司。

1.3 主要儀器

德國Sartorius BAS223S精密電子天平；上海一恒科學儀器有限公司DHG-9055A鼓風干燥箱；德國Leica RM2245石蠟切片機；日本Olympus Optical BX53光學顯微鏡。

1.4 造模方法與干預

采用孕激素拮抗劑米非司酮造模的方法進行PCOS大鼠造模。正常組大鼠連續(xù)9 d皮下注射0.2 mL橄欖油。實驗組大鼠連續(xù)9 d皮下注射米非司酮，用量為4 mg/0.2 mL橄欖油；第7、8、9天，監(jiān)測陰道涂片，若連續(xù)2 d以上觀察到同一只大鼠陰道有角化細胞出現(xiàn)提示造模成功。造模成功后，二甲雙胍組給予10 mg/（kg·d），蒼附導痰湯高、中、低劑量組分別給予1 965.7 mg/（kg·d），982.9 mg/（kg·d），491.4 mg/（kg·d），正常組、模型組給予蒸餾水10 mg/（kg·d）。共干預9 d。

1.5 標本采集及觀察指標[11-12]

各組大鼠每天灌胃前稱量并記錄大鼠體質(zhì)量。（1）干預9 d后，腹腔麻醉，剝離雙側卵巢觀察記錄卵巢大體形態(tài)并稱質(zhì)量，計算并記錄卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。（2）雙側卵巢福爾馬林固定后石蠟切片脫蠟、梯度酒精水化、HE染色后光學顯微鏡觀察各級卵泡發(fā)育情況：首先在（HE×40）分左上、左下、右上、右下四個視野分別記錄各級卵泡數(shù)量并計算總和，對于不能明確分級的卵泡于（HE×100）、（HE×400）進一步確定。（3）腹主動脈取血，離心取上層血清，2 000 r/min離心10 min，分離上層血清，-20 ℃保存，交由北京北方生物技術研究所測定睪酮濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用？字2檢驗。計量資料用“x±s”表示；數(shù)據(jù)首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，當滿足正態(tài)分布及方差齊性時：造模前后、用藥后大鼠質(zhì)量變化采用配對樣本t檢驗，其他計量資料采用數(shù)據(jù)組間單因素方差分析；當不滿足正態(tài)分布或方差不齊時，造模前后、用藥后大鼠質(zhì)量變化采用配對樣本非參數(shù)檢驗，其他計量資料采用數(shù)據(jù)組間獨立樣本秩和檢驗。P<0.05認為所檢驗的差異有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 大鼠質(zhì)量、卵巢指數(shù)、血清睪酮水平

大鼠質(zhì)量正常組、各給藥組與模型組間比較均無差異（P<0.05）；與正常組比較，模型組大鼠卵巢指數(shù)明顯升高（P<0.05），給藥后低劑量組大鼠卵巢指數(shù)較模型組明顯降低（P<0.05）；與正常組比較，模型組大鼠血清睪酮水平明顯升高（P<0.05），干預后各給藥組大鼠血清睪酮水平較模型組均明顯降低（P<0.05）。

2.2 卵巢形態(tài)

大鼠卵巢呈卵圓形。正常組大鼠卵巢鮮紅；模型組大鼠卵巢顏色較為蒼白；各給藥組大鼠卵巢顏色偏紅。光鏡下正常組可見分布較為均勻的各個階段卵泡，顆粒細胞層多為8～10層。模型組可見竇前卵泡及閉鎖卵泡明顯增多且聚集明顯，卵泡顆粒細胞層明顯減少至2～4層，成熟卵泡及黃體數(shù)量減少。各給藥組可見各個階段卵泡，卵泡發(fā)育情況良好，顆粒細胞層多為3～7層，竇前卵泡及閉鎖卵泡較少，成熟卵泡和黃體數(shù)量較模型組有所增加。見圖1。2.3 卵巢處于不同發(fā)育期的卵泡個數(shù)

正常組及各給藥組竇前卵泡個數(shù)、初級卵泡個數(shù)均明顯小于模型組（P<0.05）。見表2。

3 討論

根據(jù)PCOS患者的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學多將PCOS歸于“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇。《丹溪心法·子嗣》云：“若是肥盛婦人，稟賦甚厚，恣于酒食之人，經(jīng)水不調(diào)，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰?！倍鳳C0S患者約一半伴有肥胖，絕大多數(shù)有月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)的癥狀，部分因不孕而就診?！度~天士女科診治秘方》中提到：“肥盛婦人無子者，宜服蒼附導痰丸?！币蚨?，針對痰濕阻滯型PCOS患者，臨床治療常以蒼附導痰湯加減。趙娜等[13]認為胰島素抵抗是PCOS發(fā)病的主要病理機制，二甲雙胍可以提高胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗，黃曉等[14]通過文獻研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可改善PCOS的激素水平、促進排卵功能、改善并發(fā)癥發(fā)病率；歐幸甘等[15]通過對PCOS患者服用二甲雙胍后BMI、WHR、激素水平統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療PCOS安全、有效，副作用少，值得應用。

根據(jù)2003年歐洲人類生殖與胚胎學會和美國生殖學會在荷蘭鹿特丹訂立的診斷標準[16]發(fā)現(xiàn)，PCOS患者多具有高雄激素血癥和卵巢形態(tài)學異常。本實驗首次采用米非司酮造模的方法進行蒼附導痰湯對PCOS大鼠卵巢形態(tài)及雄激素干預的研究。該造模方法除了內(nèi)分泌和卵巢形態(tài)學改變與PCOS類似，其對于藥物的反應性上也和PCOS患者有很大的相似度[17]，而且米非司酮誘導的PCOS大鼠具有PCOS的典型特征[11，18]，對于研究蒼附導痰湯能否改善PCOS高雄激素狀態(tài)及卵巢形態(tài)較為合適。蒼附導痰湯作用于米非司酮誘導的PCOS大鼠，可降低血清睪酮水平，使PCOS大鼠竇前卵泡、初級卵泡數(shù)量明顯減少，從而引起大鼠卵巢質(zhì)量降低。本實驗發(fā)現(xiàn)蒼附導痰湯降低米非司酮誘導的PCOS大鼠血清睪酮水平，從而減少高雄激素對卵泡選擇生長的抑制，進而減少竇前卵泡、初級卵泡數(shù)量從而達到改善PCOS的目的。在此研究的基礎上，蒼附導痰湯是否能促進優(yōu)勢卵泡發(fā)育仍有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 黃玉華.柴松巖教授學術思想與臨床經(jīng)驗總結及基于關聯(lián)規(guī)則的多囊卵巢綜合征用藥規(guī)律研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2011.

[2] 談 勇.試從現(xiàn)代婦科疾病談中醫(yī)診治理念[J].江蘇中醫(yī)藥，2004，25（3）：14-16.

[3] 盧 芳.中醫(yī)婦科學生理論與實踐能力提高的方法初探及臨床體會[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2006.

[4] 杜惠蘭.中西醫(yī)結合婦產(chǎn)科學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2013：163-164.

[5] 劉蘆屏.蒼附導痰湯治療肥胖型多囊卵巢綜合征的效果探討[J].中醫(yī)臨床研究，2012，4（8）：122.

[6] 劉桂英，廖燕飛，黎玉婷，等.加減蒼附導痰湯聯(lián)合減肥治療肥胖型多囊卵巢綜合征的療效觀察[J].中國民康醫(yī)學，2014，26（15）：6-8.

[7] 陳淑琴.蒼附導痰丸加減治療痰濕內(nèi)阻型多囊卵巢綜合征不孕癥的臨床觀察[D].福州：福建中醫(yī)藥大學，2014.

[8] 蔣孟芳.蒼附導痰湯加減治療痰濕阻滯型PCOS的臨床研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2011.

[9] 李志中.蒼附導痰湯治療痰濕阻滯型多囊卵巢綜合征的臨床研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2010.

[10] 王 巖，陳 瑩，王 昕.蒼附導痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子-α影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（2）：418-420.

[11] 楊智鶯，肖國宏，侯棚鐘，等.米非司酮誘導大鼠PCOS動物模型的實驗研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2011，20（8）：637-640.

[12] 吳克明，付 雨，吳也可，等.通脈大生片對雷公藤致卵巢損傷大鼠卵巢激素與卵泡發(fā)育的影響[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2011，34（3）：25-28.

[13] 趙 娜，楊正望，全春梅.多囊卵巢綜合征臨床分型與中醫(yī)證型的相關性分析[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（9）：966-968.

[14] 黃 曉，吉 柳，謝紅梅，等.二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征研究進展[J].中國藥房，2014，25（12）：1143-1145.

[15] 歐幸甘，覃秋萍.二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征的臨床效果觀察[J].當代醫(yī)學，2010，16（26）：66-67.

[16] The Rotterdam ESHRE / ASRM sponsored PCOS consensus workshop group. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long term health risks related to polycystic ovary syndrome[J]. Hum Report， 2004，19（1）：41.51.

[17] 陳之江.多囊卵巢綜合征——基礎與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：2.

[18] 楊智鶯.GnRH受體在米非司酮誘導PCOS大鼠垂體中的表達及意義[D].廣州：廣州醫(yī)學院，2010.