金桑芪抗毒滴丸HPLC特征指紋圖譜研究

劉鴻雁　吳晶　劉麗娜

摘要：目的 建立金桑芪抗毒滴丸HPLC特征指紋圖譜，對該制劑進行質(zhì)量控制。方法 采用Waters XSELECT CSH-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為260 nm。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素和甘草酸銨為參照物，對10批金桑芪抗毒滴丸進行相似度分析。結(jié)果 金桑芪滴丸特征圖譜共有24個共有峰，比對出了貫葉連翹、桑白皮、黃芪和甘草的特征峰，各批樣品的相似度均在0.9以上。結(jié)論 采用HPLC特征圖譜可對金桑芪抗毒滴丸實現(xiàn)全面和整體的評價，為有效提高該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：金桑芪抗毒滴丸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；蘆??；甘草苷；金絲桃苷；槲皮素；甘草酸銨；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.022

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0090-05

Research on HPLC Fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills

LIU Hong-yan1， WU Jing2，3， LIU Li-Na1， JIA Zhong1，2

1. Lanzhou Pulmonary Hospital， Lanzhou 730046， China； 2. Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；

3. Lanzhou City Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730050， China

Abstract： Objective To establish fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills by HPLC； To control the quality of the preparation. Methods Waters XSELECT CSH-C18 chromatographic column （4.6 mm × 150 mm， 5 μm） was used and eluted with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid solution gradient at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 260 nm with column temperature of 30 ℃. Using calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， rutin， liquiritin， hyperoside， quercetin and ammonium glycyrrhizinate as the object references， ten batches of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills were tested and analyzed by similarity comparison. Results Fringerprint spectrum of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills had 24 common peaks in total， and characteristic spectrums of Hypericum Perforatum， Mori Cortex， Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma had been found， while similarity of HPLC fingerprint was more than 0.9 among those batches of samples. Conclusion Using HPLC fingerprint can evaluate the Jinsangqi Kangdu Dropping Pills quality totality， which can provide references for improving the quality control of the preparation.

Keywords： Jinsangqi Kangdu Dropping Pills； calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside； rutin； liquiritin； hyperoside； quercetin； ammonium glycyrrhizinate； HPLC

金桑芪抗毒滴丸組方源于蘭州市肺科醫(yī)院感染科的驗方，是在繼承前賢經(jīng)典方藥的基礎上，根據(jù)艾滋病的發(fā)病原因和致病機理，遵循中醫(yī)理法和組方原則，參考現(xiàn)代中藥研究成果，篩選組合而成。該方長期作為艾滋病患者的輔助用藥，具有一定的臨床療效。方中貫葉連翹和桑白皮的活性成分具有抑制人類免疫缺陷病毒的作用[1-4]，黃芪可增強巨噬細胞吞噬能力[5]，對機體各系統(tǒng)均具有正向調(diào)節(jié)和保護修復作用。為更好地控制生產(chǎn)工藝、確保臨床療效，本研究旨在對金桑芪抗毒滴丸原有質(zhì)量標準進行提升，采用HPLC建立金桑芪抗毒滴丸活性組分的指紋特征圖譜分析方法[6-7]。通過對特征圖譜的特征峰數(shù)據(jù)進行相似度計算，對金桑芪抗毒滴丸活性組分的特征圖譜與原料藥特征圖譜的相關(guān)性進行分析，評價不同批次金桑芪抗毒滴丸樣品間的質(zhì)量差異。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國），PDA檢測器（Waters 2998）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920- 201505）、蘆?。ㄅ?00080-201409）、甘草苷（批號111610-201607）、金絲桃苷（批號111521-201507）、槲皮素（批號100081-201509）、甘草酸銨（批號110731-201619），中國食品藥品檢定研究院；金桑芪抗毒滴丸（批號分別為20161014、20161028、20161108、20161124、20161212、20161228、20170110、20170124、20170217、20170314），蘭州市肺科醫(yī)院制劑室。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters XSELECT CSH-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，流動相為乙腈（A）-

0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15%～43%A；20～38 min，43%～80%A；38～40 min，80%A），流速為1.0 mL/min，檢測波長為260 nm，進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）20 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，混勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 陰性對照溶液的制備

按金桑芪抗毒滴丸處方分別制備不含貫葉連翹、桑白皮、黃芪、甘草提取物的陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素、甘草酸銨適量，分別用70%乙醇溶解，配成濃度分別為0.049 4、1.273、1.970、0.100、1.190、0.198 mg/mL的單一對照品溶液。分別吸取各對照品溶液1000、100、200、1300、60、1000 ?L置于5 mL量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻，得濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.011 88 mg/mL、蘆丁0.025 46 mg/mL、甘草苷0.078 8 mg/mL、金絲桃苷0.026 0 mg/mL、槲皮素0.014 28 mg/mL、甘草酸銨0.039 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一批號金桑芪抗毒滴丸供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以金絲桃苷作為參照峰，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD為0.038%～0.131%，相對峰面積的RSD為1.143%～1.672%，表明精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批號金桑芪抗毒滴丸樣品5份，每份5.0 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣檢測。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.066%～0.471%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.212%～1.825%，表明重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取金桑芪抗毒滴丸同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.083%～1.238%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.463%～2.167%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及共有峰的指認

2.4.1 指紋圖譜的建立

取10批金桑芪抗毒滴丸樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定，得到10批金桑芪抗毒滴丸HPLC指紋圖譜（見圖1）。確定了24個共有峰，且共有峰的總面積占總峰面積的90%，因此確定該24個色譜峰為金桑芪抗毒滴丸的指紋圖譜共有峰。

以5號峰（金絲桃苷）為參照峰，計算10批金桑芪抗毒滴丸樣品指紋圖譜各色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表1、表2?？梢?，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，說明該10批金桑芪抗毒滴丸樣品的成分及各成分含量均較為穩(wěn)定。

2.4.2 各共有峰的指認

分別精密吸取金桑芪抗毒滴丸供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各20 μL進樣測定。結(jié)果表明，10批樣品特征圖譜的色譜峰均在40 min內(nèi)全部出完，對所得特征圖譜進行指認，選擇穩(wěn)定性好、吸收強、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標定了24個峰（見圖2）。其中2、3、4、5、13、19號峰分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素和甘草酸銨峰。

通過對金桑芪抗毒滴丸供試品溶液圖譜和貫葉連翹、桑白皮、黃芪、甘草陰性對照溶液圖譜進行比較分析，確定各特征峰的藥材歸屬。根據(jù)各共有峰的保留時間及紫外光譜信息，確認了23個特征峰的來源，其中1個峰未得到歸屬。在特征圖譜的24個共有峰中，1、3、5、8、9、13號峰為貫葉連翹提取物中成分，其中3號峰為蘆丁，5號峰為金絲桃苷，13號峰為槲皮素；6、11、16、21、22、23、24號峰為桑白皮提取物中成分；2、7、10、12、18號峰為黃芪提取物中成分，其中2號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4、14、15、17、19號峰為甘草提取物中成分，其中4號峰為甘草苷，19號峰為甘草酸銨；20號峰為貫葉連翹和甘草提取物成分的共有峰。

2.5 樣品相似度評價結(jié)果

通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》軟件計算得出10批金桑芪抗毒滴丸特征圖譜的相似度（見表3）。結(jié)果顯示，各批樣品相似度均大于0.95，且各色譜峰的保留時間匹配較好，相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%。由此可知，各批次藥材共有物質(zhì)出峰時間大致相同，成分較穩(wěn)定，含量也基本穩(wěn)定。

3 討論

由于中藥復方具有成分復雜、有效成分不確定等因素，目前中藥制劑的含量測定指標選擇一直難以統(tǒng)一。在質(zhì)量標準的建立過程中，往往以含量高、易檢測但可能與制劑療效無關(guān)的化學成分作為檢測指標。王翰華等[8]提出，在選擇含量測定指標時應綜合考慮各藥味所含的有效成分、特征成分、毒性成分等，建立多指標含量測定體系。本試驗是對金桑芪抗毒滴丸原有質(zhì)量標準進一步提升，通過對比研究提取條件、色譜條件和檢測波長對主要特征成分測定的影響，建立該制劑的HPLC特征指紋圖譜。

首先，試驗比較了超聲提取和回流提取之間的差異，同時比較了不同濃度乙醇提?。?0%、50%、70%）和提取時間之間的差異。結(jié)果顯示，加熱回流提取和超聲提取的金絲桃苷含量相當?？紤]到超聲提取耗能低、簡便易行，故采用超聲提取法。以金絲桃苷的含量為指標，得到最佳提取條件為50%乙醇超聲提取20 min。

其次，在流動相的選擇中，以金絲桃苷的含量為考察指標，分別評價甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同比例的流動相進行等度和梯度洗脫的效果。結(jié)果顯示，梯度洗脫以乙腈-0.1%磷酸為流動相最優(yōu)，峰形、分離度均較好，各峰的保留時間適中，且分析時間適宜，均在40 min內(nèi)完成。

第三，對樣品進行全波長掃描，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷λmax為260 nm，蘆丁λmax為257 nm，甘草苷λmax為237 nm，金絲桃苷λmax為254 nm和357 nm，槲皮素λmax為257 nm，甘草酸銨λmax為237 nm。提取不同吸收波長的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在260 nm波長處各峰吸收均較好，因此選擇檢測波長為260 nm。

本試驗共考察了10批樣品共有峰的精密度、穩(wěn)定性、重復性，其RSD和非共有峰總面積占總峰面積比值均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[9]，故由此建立的指紋圖譜可以用于金桑芪抗毒滴丸的質(zhì)量控制。

參考文獻：

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[9] 國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知[J].中成藥，2000，22（10）：671.

（收稿日期：2017-10-30）

（修回日期：2017-11-14；編輯：陳靜）