肝豆靈片中黃連有效成分HPLC定性定量分析

陳莉　王盛　秦秀娟

摘要：目的 優(yōu)化黃連有效成分的HPLC條件，建立肝豆靈片中黃連相關(guān)成分的定性定量分析方法。方法 采用HPLC對(duì)肝豆靈片中黃連的有效成分進(jìn)行定性定量分析。流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。結(jié)果 可以鑒別出黃連中表小檗堿、黃連堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀4個(gè)成分，且陰性對(duì)照無(wú)干擾；鹽酸小檗堿對(duì)照品進(jìn)樣量在0.058～0.580 μg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品進(jìn)樣量在0.030～0.300 μg范圍內(nèi)與吸收度峰面積值呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.18%、99.99%，RSD分別為2.40%、1.70%。結(jié)論 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于肝豆靈片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：肝豆靈片；黃連有效成分；高效液相色譜法；定性分析；定量分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.021

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0087-03

Qualitative and Quantitative Analysis of Active Components of Copditis Rhizoma in Gandouling Pills by HPLC

CHEN Li， WANG Sheng， QIN Xiu-juan， MENG Mei

The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM， State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China

Abstract： Objective To optimize the HPLC conditions for active components of Coptidis Rhizoma； To establish qualitative and quantitative analysis method for related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. Methods HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. With acetonitrile： 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution = 50：50 （per 100 mL was added 0.4 g sodium dodecyl sulfate， and then adjusted pH to 4.0 with phosphoric acid） as mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 345 nm. Results Four components of Coptidis Rhizoma can be identified， including berberine， coptisine， berberine hydrochloride and palmatine chloride， and the negative control had no disturbance. Berberine hydrochloride reference and the absorbance peak area value showed a good linear relationship within 0.058–0.580 μg sample volume， and palmatine chloride reference was the same within 0.030–0.300 μg sample volume. The average recovery was 98.18% and 99.99%， and RSD was 2.40% and 1.70%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and with good repeatability， which can be applied effectively to the quality control of Gandouling Pills.

Keywords： Gandouling Pills； active components of Coptidis Rhizoma； HPLC； qualitative analysis； quantitative analysis

作為國(guó)家重大疑難病防治中心和國(guó)家中醫(yī)藥管理局肝豆?fàn)詈俗冃詤f(xié)作組組長(zhǎng)單位，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心專家根據(jù)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，認(rèn)為痰瘀互結(jié)貫穿于該病始終，提出以化痰祛瘀為治法，總結(jié)出具有祛痰化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)功效的醫(yī)院制劑肝豆靈片（皖藥制字Z20050071），該制劑在臨床使用20余年，在改善肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呱窠?jīng)功能方面取得良好療效。為保證該制劑臨床使用的安全性和療效的穩(wěn)定性，本研究建立方中臣藥黃連主要有效成分的HPLC測(cè)定方法，以有效控制本品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（DAD紫外檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器），Analytical C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），超聲波清洗器（SK3200H，天津天有利科技有限公司），電子天平（Sartorius BP211D）。

肝豆靈片（批號(hào)20170609、20170310、20161024、20160703、20160318、20151123），安徽省中醫(yī)院制劑室；小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，屈臣蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

精密稱取鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含鹽酸小檗堿0.029 mg、鹽酸巴馬汀0.060 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取本品粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用鹽酸-甲醇（1∶100）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液

取缺黃連的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用Analytical C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0），檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。理論塔板數(shù)按小檗堿峰計(jì)算n=12 442，分離度R=3.18，拖尾因子T=0.99，均符合藥典規(guī)定。

2.3 黃連相關(guān)成分定性分析

分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定，結(jié)果供試品色譜中依次出現(xiàn)4個(gè)含量較高的色譜峰（保留時(shí)間分別為14.119、1.639、18.767、20.888 min）。色譜圖見圖1。以小檗堿為參照，4個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間（見表1）與2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》黃連項(xiàng)下含量測(cè)定項(xiàng)中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿保留時(shí)間規(guī)定值[1]的誤差均小于5%，符合要求。因此，可以初步驗(yàn)證供試品色譜呈現(xiàn)的4個(gè)色譜峰分別為黃連相關(guān)成分表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿。1、2號(hào)峰保留時(shí)間分別與鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液一致，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，從而進(jìn)一步驗(yàn)證1、2、3、4號(hào)峰分別為小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿。

2.4 鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取0.029 mg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液2、4、6、8、16、20 μL，0.006 mg/mL鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，分別以鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的線性回歸方程分別為：Y=4139.522 4X+2.032 2，r=0.999 98；Y=4844.996 8X+7.030 8，r=0.999 96。結(jié)果鹽酸小檗堿對(duì)照品進(jìn)樣量在0.058～0.580 μg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品進(jìn)樣量在0.030～0.300 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為0.33%、1.10%，表明本法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為0.23%、1.14%，表明供試品溶液中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)20140307）6份，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備并測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為2.36%、1.48%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.5 樣品的測(cè)定與含量限度的確定

取樣品，每批平行3份，分別按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量，結(jié)果見表2。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知鹽酸小檗堿含量的樣品（10.15 mg/g）適量，分別精密加入鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果見表3、表4。

3 討論

本研究建立了肝豆靈片中黃連相關(guān)成分HPLC定性定量分析方法，對(duì)制劑中黃連的4個(gè)成分表小檗堿、黃連堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀進(jìn)行了定性分析，并對(duì)鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀進(jìn)行了含量測(cè)定。

基于原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《中藥制劑質(zhì)量及穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定以檢測(cè)方中君臣藥、貴重藥和毒劇藥為主的原則，試驗(yàn)初期設(shè)計(jì)將方中君藥姜黃的主要活性成分姜黃素作為含量測(cè)定項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)[2]，并對(duì)其HPLC含量測(cè)定條件進(jìn)行摸索，結(jié)果供試品在與姜黃素對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)，表明該成分在制劑中含量較低，故未采用姜黃素作為定量指標(biāo)，而選用含量較高的臣藥黃連主要活性成分鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀作為含量測(cè)定指標(biāo)[3]。制劑中君藥主要有效成分含量較低的原因及對(duì)整體藥效是否有影響，還需進(jìn)一步探究。

HPLC測(cè)定鹽酸小檗堿的流動(dòng)相體系較多。本試驗(yàn)考察了3種流動(dòng)相體系的色譜分離情況[1，4-7]：①乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；②乙腈-三乙胺-冰醋酸-水；③乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL中加十二烷基磺酸鈉0.1 g）。結(jié)果供試品溶液以①為流動(dòng)相，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與其他成分均能很好地分離，供試品色譜圖中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

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（收稿日期：2017-09-25）

（修回日期：2018-01-02；編輯：陳靜）