武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中總黃酮及莽草酸含量測定

柯昌虎　鄭芳　嚴(yán)慧

摘要：目的 建立武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中總黃酮及莽草酸含量測定方法。方法 采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，在波長500 nm處測定總黃酮的含量。采用HPLC測定莽草酸含量，色譜柱為Fortis Xi C8柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92，V/V），流速為0.9 mL/min，檢測波長為213 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L。結(jié)果 蘆丁在8.26～49.54 ?g范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 4），平均加樣回收率為99.2%，RSD=1.94%。莽草酸在10.26～61.56 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 4），平均加樣回收率為99.5%，RSD=1.93%。馬尾松松針中總黃酮含量為28.33 mg/g，莽草酸含量為15.25 mg/g。結(jié)論 本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中總黃酮及莽草酸的含量測定方法。

關(guān)鍵詞：馬尾松；松針；總黃酮；莽草酸；含量測定；紫外分光光度法；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.017

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0069-04

Content Determination of Total Flavonoids and Shikimic Acid in Pine Needles of

Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area

KE Chang-hu1， ZHENG Fang1， YAN Hui1， LIU Hui-min1， FU Pei-hu1， HU Ping2， ZHU Xue-song1

1. Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China；

2. College of Pharmacy， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China

Abstract： Objective To establish a method to determine the contents of total flavonoids and shikimic acid in pine needles of Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area. Methods Rutin was used as reference standard， and the content of total flavonoids in pine needles of Pinus massoniana Lamb. was determined by UV spectrometry at wavelength of 500 nm. The content of shikimic acid was determined by HPLC-DAD. The Fortis Xi C8 column （5 ?m， 250 mm × 4.6 mm） was adopted with acetonitrile - 0.4% phosphoric acid solution （8：92， V/V） as mobile phase at the flow rate of 0.9 mL/min. The detection wavelength was 213 nm； the column temperature was 30 ℃； the injection volume was 20 ?L. Results The linear range was 8.26–49.54 ?g for rutin （r=0.999 4） with an average recovery of 99.2%， RSD=1.94%. The linear range was 10.26–61.56 ?g for shikimic acid （r=0.999 4） with an average recovery of 99.5%， RSD=1.93%. The contents of total flavonoids in pine needles of Pinus massoniana Lamb. was 28.33 mg/g， and shikimic acid was 15.25 mg/g， respectively. Conclusion The method is simple， rapid， accurate and reproducible. It can be used for the content determination of total flavonoids and shikimic acid in pine needles of Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area.

Keywords： Pinus massoniana Lamb.； pine needles； total flavonoids； shikimic acid； content determination； UV spectrometry； HPLC

武當(dāng)馬尾松Pinus massoniana Lamb.為松科松屬植物，大面積分布于武當(dāng)山系海拔800 m以下亞熱帶落葉常綠闊葉混交林帶。松針為馬尾松的針狀葉，是馬尾松的藥用代表部位[1]。松針中含有黃酮、揮發(fā)油、莽草酸等活性成分[2-4]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗癌、降血脂等藥理作用[5-6]。莽草酸在松針中含量豐富，具有抗血小板聚集、抗菌、鎮(zhèn)痛、預(yù)防血栓等藥理作用[3，7]，同時(shí)作為藥物中間體用于合成抗流感及抗癌類藥物，使開發(fā)松針資源具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本課題組前期對松針及“武當(dāng)松針茶”進(jìn)行研究，初步分析了多種藥用成分[8-11]。本研究通過充分提取松針中主要活性成分總黃酮和莽草酸并測定其含量，為馬尾松松針資源利用及開發(fā)松針類藥品、食品、保健品、添加劑等提供參考。

1 儀器與試藥

SP-752紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，戴安（中國）有限公司；電子分析天平，德國METTLER TOLEDO公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG16G高速離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)，蘇州江東精密儀器有限公司。

蘆丁對照品（批號13051116，純度≥98%），成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；莽草酸對照品（批號100081-200907），中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；水為自制純化水；其他試劑為分析純。

馬尾松松針于2017年1月6日采自湖北省賽武當(dāng)風(fēng)景區(qū)，原植物標(biāo)本經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院陳吉炎教授鑒定為馬尾松Pinus massoniana Lamb.的針葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理

將新采的馬尾松松針（批號20170106）用清水洗凈后置于（41±1）℃干燥箱中約30 h，粉碎、過篩（60目），經(jīng)石油醚（30～60 ℃）脫脂后置陰涼通風(fēng)處至干，制得松針干燥粉末，密閉保存，備用。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品適量，用適量甲醇溶解并定容，使蘆丁對照品貯備液濃度為1.032 mg/mL。取上述貯備液適量，用水稀釋成濃度為0.206 4 mg/mL蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取“2.1”項(xiàng)下松針干燥粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率350 W，溫度60 ℃±2 ℃，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，10 000 r/min離心8 min，取上清液，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察

取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度[12-13]，以蘆丁含量（?g）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.012X-0.006 5（r=0.999 4），結(jié)果表明，蘆丁含量在8.26～49.54 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下蘆丁對照品溶液4.0 mL，共6份，分別置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，結(jié)果RSD=0.93%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下松針干燥粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，顯色后分別于0、10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行測定，結(jié)果RSD=1.12%，表明樣品穩(wěn)定可靠。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取松針干燥粉末，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD=1.58%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號松針干燥粉末（總黃酮含量28.33 mg/g）約0.15 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，各加入“2.2.1”項(xiàng)下蘆丁對照品貯備液4.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.8 樣品含量測定

取松針干燥粉末約0.5 g，共3份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，并計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果3批樣品中總黃酮的含量分別為28.34、28.25、28.40 mg/g，平均含量為28.33 mg/g。

2.3 莽草酸含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

取莽草酸對照品適量，用水溶解后定容，制成莽草酸對照品貯備液（濃度1.026 mg/mL）。取上述對照品貯備液適量，用水稀釋成莽草酸對照品溶液（濃度20.52 ?g/mL）。

2.3.2 供試品溶液的制備

取“2.1”項(xiàng)下松針干燥粉末約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL水，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，溫度40 ℃±2 ℃，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，10 000 r/min離心8 min，取上清液，用0.22 ?m濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得馬尾松松針供試品溶液。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Fortis Xi C8柱（250 mm×4.60 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-0.4 %磷酸水溶液（8∶92，V/V）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：213 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

在上述色譜條件下，分別取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。測得莽草酸的保留時(shí)間tR約為5.5 min，其理論塔板數(shù)不低于4000，供試品色譜峰的DAD匹配值不低于999.88，表明供試品溶液中莽草酸的色譜峰與相鄰雜質(zhì)的色譜峰達(dá)到了基線分離。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取莽草酸對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2.245 3X+0.986 7（r=0.999 4），結(jié)果表明莽草酸進(jìn)樣量在10.26～61.56 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果莽草酸峰面積的RSD=0.65%，表明精密度滿足要求。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下松針干燥粉末1份，按“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣7次，結(jié)果莽草酸峰面積的RSD=1.15%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下松針干燥粉末6份，制備成供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測得莽草酸平均含量為15.25 mg/g，RSD=1.53%，表明重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下已知含量的松針干燥粉末（莽草酸含量15.25 mg/g）約0.1 g，共6份，分別加入莽草酸對照品貯備液（濃度1.026 mg/mL）1.5 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.3.9 樣品含量測定

取松針干燥粉末各3份，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，并計(jì)算莽草酸含量。結(jié)果3份樣品中的莽草酸含量分別為15.25、15.18、15.32 mg/g，平均含量為15.25 mg/g。

3 討論

本研究采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化馬尾松松針中總黃酮和莽草酸的超聲提取條件，包括溶劑類型、料液比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間。在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化總黃酮和莽草酸的提取條件。結(jié)果總黃酮的優(yōu)化提取條件為：提取溶劑為70%乙醇，超聲功率350 W，時(shí)間45 min，溫度60 ℃，料液比為1∶200；莽草酸的優(yōu)化提取條件為：提取溶劑為水，超聲功率500 W，時(shí)間30 min，溫度40 ℃，料液比為1∶400。

本試驗(yàn)總黃酮的含量測定參考2015年版《中華人民共和國藥典》，以蘆丁為對照品，采用NaNO2- A1（NO3）3-NaOH比色法測定總黃酮的含量。據(jù)此原理，結(jié)構(gòu)中含有3'，4'-鄰二羥基的原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸等非黃酮類物質(zhì)也能發(fā)生顯色反應(yīng)，樣品中含有上述成分將會干擾測定結(jié)果。課題組前期采用HPLC-DAD對馬尾松不同部位有效成分進(jìn)行了分離試驗(yàn)，在分離出的色譜峰中未檢測到原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸色譜峰，初步說明馬尾松松針中不含這3種物質(zhì)或含量未達(dá)到儀器最低檢測限，從而排除原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸對試驗(yàn)的干擾，增強(qiáng)了該試驗(yàn)的可靠性。

莽草酸的含量測定中，在200～400 nm波長范圍內(nèi)，由Ultimate 3000高效液相色譜儀對莽草酸對照品溶液色譜峰紫外掃描圖譜確定檢測波長為213 nm，此處莽草酸有最大吸收。本試驗(yàn)比較了Phenomenex C18柱和Fortis Xi C8柱，結(jié)果后者分離效果高于前者，F(xiàn)ortis Xi C8柱更適合分離極性較大的莽草酸。

本課題組采用超聲法對馬尾松松針中總黃酮和莽草酸的提取條件進(jìn)行了考察，測得總黃酮的最高含量為2.84%，低于前期試驗(yàn)結(jié)果（3.76%）[9]，測得莽草酸的最高含量為1.53%，也明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的含量[14-15]。筆者認(rèn)為造成以上含量差異的原因，一是松針采集時(shí)期不同，本研究樣品采集時(shí)間是1月初，前期試驗(yàn)樣品采于4月底，所測結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16]；二是提取方式及條件不同，本研究采用常規(guī)超聲法進(jìn)行提??；三是松針產(chǎn)地不同。

馬尾松喜光、耐干旱瘠薄，在山脊地帶組成純林，而武當(dāng)?shù)貐^(qū)獨(dú)特的山岳自然條件使馬尾松天然更新良好，且松針一年四季均可采摘，資源豐富，藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，開發(fā)前景極其廣闊。本課題組的研究結(jié)果為馬尾松松針資源開發(fā)和利用提供了方法學(xué)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。后期試驗(yàn)將綜合考察不同采收季節(jié)的馬尾松松針中總黃酮和莽草酸的含量差異及變化趨勢，從而為武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松資源的合理持續(xù)利用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-11-24）

（修回日期：2017-12-11；編輯：陳靜）