養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠的作用*

蒙玉嬌， 李寧飛， 翟春艷， 劉正榮， 李 雪， 底婷婷2, ，趙京霞2, ， 王 燕2, ， 張 璐2, ， 王洪艷2, ， 李 萍, 2, △

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029；2銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)研究所，3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院， 北京 100010)

銀屑病是由免疫系統(tǒng)、銀屑病相關(guān)易感基因位點(diǎn)、自身抗原和環(huán)境等多種因素交互作用引起的，以表皮細(xì)胞過(guò)度增殖和角化不全為特征的慢性炎癥性皮膚疾病，包括角質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞參與其中[1-2]。其中，T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能異常對(duì)銀屑病的發(fā)生發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。銀屑病屬中醫(yī)“白疕”范疇，中醫(yī)藥治療銀屑病療效顯著、毒副作用小，目前依據(jù)患者皮損特點(diǎn)、病程等臨床表現(xiàn)和體征，銀屑病的中醫(yī)證候分布包括血熱證、血燥證和血瘀證[3]。養(yǎng)血解毒方(Yangxue-Jiedu decoction,YXJD)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科治療血燥型銀屑病的常用方劑，臨床療效頗佳，并且通過(guò)前期研究，我們對(duì)其部分作用機(jī)制有了初步認(rèn)識(shí)[4-5]。為了深入探索和優(yōu)化養(yǎng)血解毒方，我們將其解毒類藥物去除，化裁為養(yǎng)血方(Yangxue decoction,YX)，采用咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型[6-7]，驗(yàn)證養(yǎng)血方及養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣皮損的干預(yù)作用，同時(shí)觀察2組方劑對(duì)此模型干預(yù)作用的異同點(diǎn)，為養(yǎng)血解毒方的深入研究和優(yōu)化奠定基礎(chǔ)，為臨床提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠50只，雄性，6～8周齡，體重18～22 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(京)2017-0001，IVC飼養(yǎng)，SPF級(jí)，濕度40%～60%，室溫25 ℃。

2 主要試劑

養(yǎng)血方(當(dāng)歸15 g、生地黃15 g、丹參15 g、雞血藤15 g、麥冬10 g、天花粉15 g、蒼術(shù)10 g、白蒺藜10 g)及養(yǎng)血解毒方(當(dāng)歸15 g、生地黃15 g、丹參15 g、雞血藤15 g、麥冬10 g、玄參15 g、天花粉15 g、土茯苓30 g、白花蛇舌草30 g、草河車9 g、蒼術(shù)10 g、白蒺藜10 g)由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制劑室負(fù)責(zé)質(zhì)量控制，按照小鼠劑量(20 g體重)=成人劑量(60 kg體重)×12.33換算得到小鼠服用劑量(mg/kg)，用蒸餾水將中藥混勻后浸泡1 h煎煮2次，每次1 h，合并2次濾液濃縮至10只小鼠所用6 d劑量。

咪喹莫特乳膏購(gòu)自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司；甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體、抗CD3抗體、血清封閉液、 II抗和DAB顯色液購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3 主要方法

3.1造模方法及分組 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，50只BALB/c小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉，背部退毛，面積約2 cm×2 cm，單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為空白(control)組、模型(model)組、MTX組、YX組和YXJD組，每組10只?？瞻捉M小鼠背部涂抹凡士林，其余各組每只小鼠背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，連續(xù)涂抹6 d；空白組和模型組小鼠蒸餾水灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤溶液灌胃(1 mg/kg)，養(yǎng)血方組與養(yǎng)血解毒方組給予相應(yīng)水煎劑灌胃，用量均為每次0.2 mL，每天1次。造模當(dāng)天開始給藥，連續(xù)給藥6 d，第7天取材。

3.2小鼠銀屑病樣皮損動(dòng)態(tài)觀察及銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分 采用數(shù)碼相機(jī)每日拍照的方式記錄小鼠背部皮膚變化，動(dòng)態(tài)觀察皮損進(jìn)展情況，并根據(jù)銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小鼠鱗屑、浸潤(rùn)和紅斑情況進(jìn)行評(píng)分，并將三者總和作為總積分，分別繪制PASI評(píng)分趨勢(shì)線。

3.3小鼠皮膚油脂和水分檢測(cè) 造模前，采用皮膚水分油分測(cè)試筆，選取小鼠背部相同位置皮膚，測(cè)量3次，取平均值；第7天，取材前再次對(duì)小鼠皮膚油脂和水分進(jìn)行檢測(cè)，分析銀屑病小鼠皮膚水分/油分丟失情況。

3.4小鼠皮膚HE染色及皮膚厚度檢測(cè) 造模第7天，取小鼠背部皮膚，固定脫水后石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化并采用IPP 6.0軟件測(cè)量表皮厚度。

3.5免疫組化法檢測(cè)小鼠皮損表皮異常PCNA的表達(dá) 小鼠皮膚石蠟包埋切片后，免疫組化法檢測(cè)皮損表皮中PCNA的表達(dá)。計(jì)數(shù)PCNA陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。

3.6免疫組化法檢測(cè)小鼠皮損處真皮CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn) 小鼠皮膚石蠟包埋切片后，免疫組化法檢測(cè)皮損真皮中CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

3.7Real-time PCR法檢測(cè)小鼠皮損中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17、IL-23和IL-1β的mRNA表達(dá)水平 Real-time PCR法檢測(cè)小鼠皮損中IL-17、IL-23 和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量?？瞻讓?duì)照組小鼠取與模型組相同部位同等大小的皮膚，采用TRIzol總RNA提取試劑盒進(jìn)行皮膚RNA提取，cDNA反轉(zhuǎn)錄通過(guò)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進(jìn)行，ABI7500型熒光定量PCR儀用于擴(kuò)增，2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，引物序列詳見(jiàn)表1。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Real-time PCR 引物序列

F: forward; R: reverse.

結(jié) 果

1 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠背部皮損作用的動(dòng)態(tài)觀察

小鼠背部皮膚變化動(dòng)態(tài)觀察顯示，空白組小鼠皮膚光滑、柔軟，無(wú)鱗屑和紅斑；背部涂抹咪喹莫特后，小鼠皮膚逐漸變紅并形成紅斑，并有白色鱗屑長(zhǎng)出，鱗屑黏著不易脫落，隨著涂抹天數(shù)的增加，鱗屑增多，紅斑變大顏色加深，且皮膚不斷增厚，浸潤(rùn)嚴(yán)重，小鼠出現(xiàn)搔抓行為，與臨床銀屑病患者皮損表現(xiàn)類似；與模型組相比，用藥組小鼠鱗屑明顯變薄、減少，鱗屑厚度減輕，紅斑色淺面積小，皮膚增厚程度輕，浸潤(rùn)不明顯，皮損癥狀均有所緩解；與養(yǎng)血組相比，養(yǎng)血解毒組和甲氨蝶呤組皮損處白色鱗屑稀少，皮膚較光滑、柔軟，浸潤(rùn)輕，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Skin lesions of the psoriasis-like mice in each group on the 7th day.

對(duì)小鼠背部皮損情況進(jìn)行PASI評(píng)分，與空白組相比，背部涂抹咪喹莫特的小鼠第2天即有鱗屑、浸潤(rùn)和紅斑表現(xiàn)，隨著涂抹天數(shù)的增加，鱗屑、浸潤(rùn)、紅斑及總分都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，提示皮損不斷加重，其中第3～4天鱗屑增加程度最大，浸潤(rùn)在第3～5天增加程度明顯，紅斑在第2～3天和第4～5天增加明顯；與模型組相比，用藥組皮損鱗屑、浸潤(rùn)、紅斑評(píng)分及總分均明顯減少，上升趨勢(shì)緩慢；與養(yǎng)血方組相比，養(yǎng)血解毒方組和甲氨蝶呤組皮損處鱗屑增加緩慢，紅斑出現(xiàn)時(shí)間晚，面積小，顏色淺，見(jiàn)圖2。

Figure 2. PASI scores of the mice with psoriasis in each group.

2 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠皮膚水分/油分含量的影響

造模前皮膚水分/油分檢測(cè)結(jié)果示，造模前各組小鼠背部皮膚水分/油分含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；造模第7天，與空白組相比，模型組背部皮膚干燥，水分丟失嚴(yán)重(P<0.01)，油分含量明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，養(yǎng)血解毒方組小鼠皮膚干燥程度低，水分/油分含量高(P<0.05)，養(yǎng)血方組、甲氨蝶呤組與模型組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The changes of Water-oil content of the back skin of the mice with psoriasis in each group. Mean±SD.n=10.** P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsYX group.

3 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠皮損病理改變及表皮厚度的影響

顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果，空白組表皮薄、細(xì)胞浸潤(rùn)稀少；模型組表皮規(guī)則增生明顯，棘層肥厚，表皮同時(shí)存在角化不全與角化過(guò)度，角質(zhì)層存在蓄積大量中性粒細(xì)胞和變性表皮細(xì)胞的Munro微膿腫，真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，皮損病理特點(diǎn)表現(xiàn)與銀屑病患者類似；應(yīng)用養(yǎng)血方、養(yǎng)血解毒方和甲氨蝶呤后，真皮層炎性細(xì)胞數(shù)目減少，表皮增生減輕，皮損組織的病理表現(xiàn)有所改善，且養(yǎng)血解毒方組和甲氨蝶呤組對(duì)表皮增生的改善作用更明顯，見(jiàn)圖4A。

使用IPP 6.0軟件測(cè)量HE染色后各組表皮垂直厚度，模型組明顯高于空白組(P<0.01)，養(yǎng)血方組與養(yǎng)血解毒方組低于模型組(P<0.05)，養(yǎng)血解毒方組與甲氨蝶呤組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4B。

Figure 4. The histopathological observation of skin lesions (A; HE staining,×400) and epidermal thickness of skin lesions (B) in each group. Mean±SD.n=10.** P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsYX group.

4 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠皮損表皮PCNA表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，空白組表皮PCNA正常表達(dá)，于基底層呈線性分布，棘層較少甚至無(wú)表達(dá)；模型組表達(dá)量明顯增多，廣布于表皮層，顯微鏡(×400視野)下PCNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)顯示，模型組表皮PCNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組(P<0.05),養(yǎng)血方組、養(yǎng)血解毒方組和甲氨蝶呤組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于模型組(P<0.05)，養(yǎng)血解毒方組與養(yǎng)血方組比較，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，養(yǎng)血解毒方組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于甲氨蝶呤組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

5 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠皮損真皮CD3表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，空白組皮損真皮層的CD3+T細(xì)胞水平低，零星分布；模型組分布較多，顯微鏡(×400)下CD3+T細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，模型組明顯高于空白組(P<0.05)；養(yǎng)血方組、養(yǎng)血解毒方組和甲氨蝶呤組CD3+T細(xì)胞數(shù)量均低于模型組(P<0.05)；養(yǎng)血解毒方組的CD3+T細(xì)胞數(shù)量明顯低于養(yǎng)血方組(P<0.05)；養(yǎng)血解毒方組優(yōu)于甲氨蝶呤組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖6。

6 養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)銀屑病樣小鼠皮損中IL-17、IL-23和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，模型組皮損中IL-17、IL-23 和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于空白組(P<0.01);應(yīng)用養(yǎng)血方、養(yǎng)血解毒方和甲氨蝶呤后，3種細(xì)胞因子的mRNA相對(duì)表達(dá)較模型組均明顯降低(P<0.05)，養(yǎng)血解毒方組3種細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量降低的程度高于養(yǎng)血方組(P<0.05)和甲氨蝶呤組(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 5. The PCNA expression in the skin lesions and the quantitative analysis of the PCNA staining positive cell numbers in the skin lesions of each group (IHC,×400). Mean±SD.n=10.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsYX group.

討 論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，特征性損害為銀白色鱗屑、紅斑等，是臨床常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚疾病，其病情反復(fù)遷延，皮損、鱗屑和瘙癢等癥狀使患者承受著巨大的心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)面臨體力活動(dòng)、認(rèn)知功能和生活質(zhì)量等方面的降低。銀屑病的發(fā)病原因復(fù)雜多樣，主要是由遺傳易感性和多種環(huán)境刺激下引起的皮膚中異常免疫應(yīng)答所驅(qū)動(dòng)，患者體內(nèi)以T細(xì)胞為代表的的免疫細(xì)胞常呈高度活化狀態(tài)，抑制細(xì)胞增殖及其下游細(xì)胞因子的分泌可以有效緩解銀屑病，在過(guò)去20年的研究也明確了IL-23/IL-17-T細(xì)胞軸在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的中心作用[8]。其中輔助T細(xì)胞17(Th17)作為與自身免疫性疾病發(fā)病相關(guān)性極強(qiáng)的T細(xì)胞亞群，在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。與其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17和IL-23水平與疾病的嚴(yán)重程度與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[9]。

IL-23主要由活化的樹突狀細(xì)胞分泌，是銀屑病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，小鼠真皮注射IL-23可誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖、皮膚炎癥反應(yīng)和銀屑病樣皮損。同時(shí)作為促Th17細(xì)胞因子，IL-23具有使記憶T細(xì)胞分泌IL-17，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、增殖的作用，銀屑病患者的外周血中存在著IL-23和Th17類細(xì)胞因子的升高，在銀屑病患者皮損處，IL-23mRNA和IL-17mRNA大量存在，明顯高于正常皮膚[10]。IL-1β由T細(xì)胞活化產(chǎn)生，在銀屑病發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，已有研究表明IL-1β表達(dá)程度與皮損嚴(yán)重程度有關(guān)[11]。

目前廣泛應(yīng)用的銀屑病研究模型為咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型，可快速誘導(dǎo)出與人類銀屑病相似的皮膚表現(xiàn)。咪喹莫特為治療尖銳濕疣的臨床藥物，作用在于促進(jìn)皮膚炎癥因子產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒功效。在模型建立過(guò)程中，咪喹莫特通過(guò)激活Toll樣受體，激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠皮膚出現(xiàn)銀屑病樣改變，在臨床特征、組織病理和發(fā)病分子學(xué)特征方面，與人類銀屑病發(fā)病機(jī)制極為相似，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，同時(shí)存在T細(xì)胞高度活化的狀態(tài)，可用于闡明銀屑病發(fā)病機(jī)制和驗(yàn)證藥物的療效[12]。

Figure 6. CD3+cells in the skin lesions and the quantitative analysis of CD3+positive cell numbers in the skin lesions in each group (IHC，×400). Mean±SD.n=10.** P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsYX group.

Figure 7. The relative mRNA expression of IL-1β, IL-17 and IL-23 in the skin lesions of each group. Mean±SD.n=10.** P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsYX group;▲P<0.05vsMTX group.

祖國(guó)醫(yī)學(xué)歷代醫(yī)家對(duì)銀屑病的病因病機(jī)多論述為血虛燥熱、皮膚失養(yǎng)，并總結(jié)出以血熱、血燥與血瘀為主的內(nèi)在病因，可知“血分”為銀屑病研究的切入點(diǎn)[13]。外邪或內(nèi)傷等致病因素入侵，蘊(yùn)久化熱，熱入營(yíng)血，熱邪蒸津灼血，血瘀血滯，瘀久成毒，毒損血絡(luò)，進(jìn)一步灼傷營(yíng)血，化燥生風(fēng)，導(dǎo)致肌膚失養(yǎng)，因此血分蘊(yùn)毒體現(xiàn)了銀屑病的實(shí)質(zhì)病機(jī)，而血燥與毒熱又貫穿了銀屑病的始終，臨床治療遵循從血論治，采用具有養(yǎng)血和解毒功效的中藥對(duì)血燥證銀屑病具有較好療效[14]。養(yǎng)血解毒方是北京中醫(yī)醫(yī)院臨床治療銀屑病的有效方劑，由當(dāng)歸、生地黃、丹參、雞血藤、麥冬、玄參、天花粉、土茯苓、白花蛇舌草等組成，其中土茯苓和雞血藤為君藥，土茯苓甘淡平，涼血解毒利濕，雞血藤溫苦甘，養(yǎng)血活血通絡(luò)；當(dāng)歸、生地、丹參養(yǎng)血活血，板藍(lán)根、白花蛇舌草清熱解毒，玄參、麥冬、天花粉清熱養(yǎng)陰，全方共奏養(yǎng)營(yíng)血、清毒熱之效[15]。為了進(jìn)一步研究養(yǎng)血解毒方的作用機(jī)制，對(duì)其組成進(jìn)行深入探索，以利于臨床用藥優(yōu)化，我們將養(yǎng)血解毒方篩選出養(yǎng)血類藥物組成養(yǎng)血方，由當(dāng)歸、生地黃、丹參、雞血藤、麥冬、天花粉等組成。

本次研究中，對(duì)銀屑病樣小鼠皮損發(fā)展動(dòng)態(tài)觀察顯示，模型組小鼠背部涂抹咪喹莫特后逐漸出現(xiàn)白色鱗屑、紅色斑點(diǎn)和皮膚增厚，并隨著涂抹天數(shù)的增加，鱗屑逐漸增大，紅斑面積增加、顏色變深，甚至有出血點(diǎn)，皮膚浸潤(rùn)肥厚嚴(yán)重，且皮損干燥程度嚴(yán)重，小鼠搔抓行為增多，符合臨床銀屑病患者的表現(xiàn)；同時(shí)，HE染色觀察皮損病理表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，模型組表皮細(xì)胞過(guò)度增殖與角化不全大量存在，表皮厚度增加。應(yīng)用養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方后，對(duì)小鼠皮損癥狀均有改善作用，從鱗屑表現(xiàn)，紅斑顏色、面積，皮膚增厚程度來(lái)看，養(yǎng)血解毒方效果優(yōu)于養(yǎng)血方，鱗屑薄且少，皮損表現(xiàn)較光滑、柔軟，紅斑色淺、面積小，浸潤(rùn)程度更輕。臨床常用PASI評(píng)分評(píng)估藥物對(duì)銀屑病的療效作用，根據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分的結(jié)果顯示，模型組皮損積分呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，且從第3天開始，疾病的發(fā)展速度加快，皮損加重的程度更大，開始出現(xiàn)銀屑病發(fā)展的高峰期。應(yīng)用養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方后，兩者都可以降低小鼠鱗屑、浸潤(rùn)和紅斑的積分，皮損發(fā)展趨勢(shì)均比模型組緩慢且癥狀輕；養(yǎng)血解毒方與養(yǎng)血方比較，其疾病嚴(yán)重程度更低，同時(shí)在降低疾病發(fā)展速度、減輕皮損加重程度上，養(yǎng)血解毒方優(yōu)于養(yǎng)血方。HE染色顯示，養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方均可以減少表皮厚度，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增殖和角化不全有抑制作用，其中，養(yǎng)血解毒方對(duì)減輕表皮厚度的程度明顯大于養(yǎng)血方。

皮膚是人體的第一道防線，對(duì)維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及抵御外界有害因素的損傷有著不可或缺的作用，完整的皮膚屏障是皮膚發(fā)揮物理和化學(xué)屏障功能的先決條件，它可為機(jī)體隔離外界有害因素，抵抗機(jī)體所受的侵襲和損傷，同時(shí)防止體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分的丟失[16]。對(duì)于炎癥性皮膚疾病，表皮屏障功能破壞會(huì)導(dǎo)致表皮的增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，局部炎癥反應(yīng)更加劇烈，銀屑病患者皮損長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)及物理搔抓會(huì)導(dǎo)致皮膚表皮屏障功能嚴(yán)重降低[17]。表皮水分、油脂含量是反映表皮屏障功能的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)中皮膚水分/油分含量檢測(cè)結(jié)果顯示，養(yǎng)血解毒方可以降低水分/油分散失的水平，對(duì)維護(hù)表皮屏障功能、減少經(jīng)皮水分丟失程度有作用，而養(yǎng)血方與模型組比較無(wú)差異。結(jié)合銀屑病由血分熱毒蘊(yùn)結(jié)引發(fā)血虛風(fēng)燥、肌膚失養(yǎng)的發(fā)病機(jī)制，以及患者表皮細(xì)胞消化不全、炎性細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)等表皮屏障功能下降的臨床表現(xiàn)，提示養(yǎng)血解毒方以養(yǎng)血類藥物配伍土茯苓、板藍(lán)根、白花蛇舌草為代表的解毒類藥物對(duì)皮膚屏障功能的恢復(fù)具有一定的作用。

角質(zhì)細(xì)胞的異常增殖與活化作為銀屑病皮損主要病理表現(xiàn)，是引起表皮異常增厚的重要原因，PCNA是反映細(xì)胞增殖情況的指標(biāo)[18]，免疫組化法檢測(cè)皮損表皮層細(xì)胞活躍程度發(fā)現(xiàn)，模型組PCNA含量明顯高于空白組，皮損表皮層細(xì)胞活躍程度高，大量存在細(xì)胞的過(guò)度增殖，養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方應(yīng)用后可以抑制表皮細(xì)胞增殖，將表皮細(xì)胞增殖局限于基底層，而養(yǎng)血解毒方組與養(yǎng)血方組比較，養(yǎng)血解毒方組在調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞分化方面優(yōu)于養(yǎng)血方組。

T淋巴細(xì)胞異?；罨徒?rùn)導(dǎo)致的過(guò)度免疫反應(yīng)是銀屑病典型特征[19]，免疫組化法檢測(cè)真皮層T細(xì)胞浸潤(rùn)情況發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組皮損真皮層CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方應(yīng)用后可以減少真皮層CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而養(yǎng)血解毒方組與養(yǎng)血方組比較，養(yǎng)血解毒方組在抑制真皮層T細(xì)胞浸潤(rùn)方面均優(yōu)于養(yǎng)血方組，表明養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方均可以抑制T細(xì)胞增殖，減輕小鼠皮膚免疫反應(yīng)，達(dá)到緩解癥狀的目的，而養(yǎng)血解毒方效果優(yōu)于養(yǎng)血方。

基于文獻(xiàn)與前期研究基礎(chǔ)，我們明確皮損炎癥相關(guān)因子IL-23、IL-17和IL-1β處于免疫信號(hào)通路下游，可作用于角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等介導(dǎo)皮膚炎癥反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病樣皮損的形成[20]。采用real-time PCR法檢測(cè)銀屑病樣小鼠皮損中IL-17、IL-23和IL-1β的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，模型組IL-17、IL-23和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯上升，這與我們前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道一致。養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方能夠降低IL-17、IL-23和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中養(yǎng)血解毒方組IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于養(yǎng)血方組，這表明養(yǎng)血解毒方與養(yǎng)血方對(duì)Th17細(xì)胞通路具有明顯的抑制作用，而養(yǎng)血解毒方的作用更明顯。

本次研究中，我們通過(guò)建立咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型，觀察到養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方對(duì)小鼠皮損的緩解作用，并對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行探討后發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血方與養(yǎng)血解毒方可通過(guò)減少T細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制Th17通路，減輕免疫反應(yīng)，降低皮損內(nèi)相關(guān)炎癥細(xì)胞與炎癥因子水平達(dá)到治療目的。養(yǎng)血解毒方在治療銀屑病小鼠方面效果更佳，作用更全面，在阻斷IL-17/IL-23-T細(xì)胞軸炎癥反應(yīng)時(shí)，養(yǎng)血解毒方中養(yǎng)血類藥物與解毒類藥物起到了協(xié)同作用；同時(shí)，養(yǎng)血解毒方可改善銀屑病表皮屏障功能，而養(yǎng)血方不具備此作用，這是由解毒類藥物單獨(dú)發(fā)揮此作用，或養(yǎng)血藥物與解毒藥物配伍發(fā)揮作用，仍待進(jìn)一步探索。甲氨蝶呤是臨床治療銀屑病常用的免疫抑制劑，該藥可改善患者癥狀，但安全性較差，易引起諸多不良反應(yīng)而導(dǎo)致患者依從性差、治療中斷等，出現(xiàn)病情反復(fù)甚至加重現(xiàn)象，難以達(dá)到預(yù)期療效。本次研究顯示，養(yǎng)血解毒方與甲氨蝶呤相比，對(duì)于改善皮損表現(xiàn)差異不明顯，但在提高皮膚屏障功能、降低炎癥因子表達(dá)水平方面，養(yǎng)血解毒方優(yōu)于甲氨蝶呤。針對(duì)銀屑病病因未完全明確、無(wú)特效藥物的現(xiàn)狀，復(fù)方中藥因臨床療效確切且不良反應(yīng)少成為研究熱點(diǎn)，具體作用機(jī)制亟待我們深入探索。以上研究為中醫(yī)藥臨床治療提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，并為方劑的優(yōu)化提供方向。