非馬沙坦對(duì)2型糖尿病大鼠早期心肌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的調(diào)節(jié)作用

韓冬梅， 劉方波， 萬(wàn)相全

(青島市第八人民醫(yī)院藥學(xué)部， 山東 青島 266100)

目前，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)已經(jīng)被證實(shí)為糖尿病(diabetes mellitus，DM)獨(dú)立的并發(fā)癥。近年來(lái)，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)理主要集中在血糖和血脂的代謝異常，而氨基酸和蛋白質(zhì)的有關(guān)研究資料相對(duì)匱乏[1]。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的酶，它可催化水解S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)生成腺苷和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)，其中SAH是由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)提供甲基參與機(jī)體DNA和組蛋白的甲基化而產(chǎn)生[2]。SAH作為代謝前體在SAHH的催化下生成同型半胱氨酸，而抑制SAHH將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SAH的蓄積，從而對(duì)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)產(chǎn)生反饋性抑制作用，并產(chǎn)生顯著的免疫抑制作用。近年來(lái)，對(duì)于SAHH的研究越來(lái)越多，而主要集中在SAHH的體外抑制劑研究上[3-4]，對(duì)于SAHH的內(nèi)源性抑制方面鮮有研究。Hcy是一種含硫氨基酸，為甲硫氨酸去甲基化中間產(chǎn)物。1969年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)并提出Hcy與動(dòng)脈硬化密切相關(guān)，之后與糖尿病和心血管疾病的關(guān)系日益受到重視；之后，人們發(fā)現(xiàn)血漿Hcy的升高同心血管病變是緊密聯(lián)系在一起的，因此糖尿病和心血管疾病之間的關(guān)系日益受到重視。隨著研究的深入，Tehlivets等[5]發(fā)現(xiàn)Hcy與甲硫氨酸另一中間代謝產(chǎn)物SAH共同參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Jacobs等[6]研究顯示，隨著糖尿病患者體內(nèi)胰島素水平的變化，Hcy的水平可以升高、降低及正常，這直接與糖尿病病情發(fā)展密切相關(guān)。Hcy不僅與糖尿病相關(guān)，還可能參與糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病等慢性并發(fā)癥的發(fā)生。Cho等[7]對(duì)大樣本的2型糖尿病患者進(jìn)行為期2～6年的流行病學(xué)研究顯示，患者血漿Hcy濃度與患者腎功能有密切的相關(guān)性，提示Hcy可能促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生。而近年研究[8]表明，SAH水平的升高導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)外等離子交換失調(diào)，參與多種慢性心血管疾病的發(fā)生；而更有研究[9]指出SAH與Hcy可以共同作為慢性心血管病的標(biāo)志物。

非馬沙坦(fimasartan，F(xiàn)IM)是一種新型的非肽類血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor，AT1-R)拮抗劑，具有選擇性阻滯AT1-R的作用，在多種類型高血壓的治療中表現(xiàn)出快速和有效的抗壓效果。新近臨床前研究[10]表明，與非馬沙坦同類的奧美沙坦酯在糖尿病狀態(tài)下，對(duì)心肌具有顯著的保護(hù)作用。另有研究顯示，血管緊張素II受體拮抗劑類對(duì)心肌的保護(hù)作用與Hcy表達(dá)水平的調(diào)控可能具有相關(guān)性[11]，但具體作用機(jī)制仍不清楚。因此，我們建立2型糖尿病大鼠模型，選取造模后動(dòng)物給予非馬沙坦進(jìn)行干預(yù)作用，探究非馬沙坦對(duì)SAHH及下游Hcy等因子表達(dá)調(diào)控的可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體重180～200 g，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(魯)2017-0014。

非馬沙坦(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所提供，分析純：含量>99%)；醫(yī)用超聲耦合劑(上海申風(fēng)醫(yī)療保健有限公司)；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小鼠IgG的II抗試劑盒(北京中杉金橋生物)；ProSieve Color Protein Makers(Lonza Rockland)；鏈脲佐菌素、同型半胱氨酸、多聚-L-賴氨酸和L-谷氨酰胺(Sigma)；抗SAHH、AT1-R和β-actin單克隆抗體(Cell Signaling Technology)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物模型的構(gòu)建及分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠35只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組10只和糖尿病模型(DM)組25只:control組飼以普通飲食；DM組采用高脂飲食(豬油30%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1%，常規(guī)飼料66.5%)灌胃，并于5周末禁食12 h后，一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(30 mg/kg，溶于pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中)。Control組正常大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。造模后72 h尾靜脈采血，血糖試紙檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，選擇FBG≥11.1 mmol/L及尿量、飲食和體重變化綜合判斷糖尿病大鼠模型是否成功。造模成功大鼠隨機(jī)分為DM組和DM+FIM組：DM組以高脂飲食灌胃4周;DM+FIM組于2周末灌胃給予非馬沙坦，按照2.5 mg·kg-1·d-1劑量給藥，持續(xù)到4周末。Control組始終以普通飼料喂養(yǎng)8周。

2.2空腹血糖及胰島素的檢測(cè) DM組和DM+FIM組大鼠分別于4周末禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測(cè)FBG及空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

2.3血清學(xué)檢測(cè) 造模大鼠于4周末麻醉，仰位固定，開(kāi)胸，腹主動(dòng)脈取血，每只5 mL，3 000 r/min 離心10 min，取上清，分裝，-20 ℃保存待測(cè)。生化儀檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平。

2.4超聲心動(dòng)圖檢測(cè)動(dòng)物的心功能 造模大鼠于4 周末禁食12 h后，以30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠并固定，使用Vevo 2100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)[維勝(中國(guó))有限公司]檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastole，LVPWd)、左室收縮末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-systole，LVPWs)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)及左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LV mass)。

2.5標(biāo)本收集 大鼠麻醉，固定，開(kāi)胸，迅速取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，剔除血管、脂肪等非心肌組織，稱心臟重量(heart weight，HW)，分離左心室并稱左心室(含室間隔)重量(LV weight,LVW)，并計(jì)算心臟(左心)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)。分離的左心室置于EP管中，于液氮中保存待用。

2.6高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定Hcy、SAH及SAM的表達(dá) 每20 mg組織加入100～200 μL含1 mmol/L PMSF的裂解液研磨充分后，低溫離心10 min，取勻漿上清，并測(cè)定總蛋白濃度。取研磨后上清液20 μL注入HLPC，用線性梯度洗脫方式將樣品從色譜柱洗脫。線性梯度如下： 0～0.5 min， 100% A； 0.5～20 min， 75% A和25% B； 20～30 min， 75% B和25% A； 30～45 min，100% B。色譜圖采用惠普公司HP3394積分儀記錄，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次并進(jìn)行定量分析，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積及SAM和SAH的洗脫峰面積獲得心肌組織Hcy、SAM和SAH含量。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 每20 mg組織加入100～200 μL含1 mmol/LPMSF的裂解液研磨充分后，4℃、14 000×g離心10 min，取勻漿上清，并測(cè)定總蛋白濃度。40～70 μg總蛋白上樣量于SDS-PAGE進(jìn)行分離。濕法轉(zhuǎn)膜2 h，體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h后與相應(yīng)I抗4 ℃共孵育過(guò)夜,次日與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的II抗共孵育，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料的組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠DM模型建立情況

實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，飲食正常，身體健壯，自主活動(dòng)正常;而DM組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、身體消瘦、毛發(fā)不整、腥臊臭味加重、飲食量和飲水量均增加、排泄物顯著增多、臭味加重等癥狀。25只大鼠中造模成功21只，成功率為84%，基礎(chǔ)代謝情況見(jiàn)表1。

表1 造模后各組大鼠基礎(chǔ)代謝情況比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2 造模后各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化

與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血清FBG和FINS顯著升高(P<0.05)，ISI顯著下降(P<0.01)，表明2型糖尿病大鼠造模成功，見(jiàn)表2。

表2 造模后各組大鼠基本情況比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3 大鼠體重及心臟各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，DM模型組大鼠體重降低(P<0.05)，且體重增量明顯降低(P<0.01)，心臟及左心室重量明顯增加(P<0.01，P<0.05)，心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；非馬沙坦處理組大鼠的體重與模型組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但體重增量顯著提高(P<0.05)，心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均顯著低于DM模型組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 早期DM大鼠體重及心臟相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

BW: body weight; ΔBW=BWafter-BWbefore; HW: heart weight; LVW: left ventricular weight.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group.

4 大鼠血生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，DM模型組大鼠血清中FBG和LDL-C明顯升高(P<0.01)，TG和TC亦升高明顯(P<0.05)，HDL-C則降低顯著(P<0.05)；與DM模型組相比較，非馬沙坦處理組大鼠血清FBG降低顯著(P<0.05)，TC和TG含量均略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HDL-C變化不大，LDL-C降低顯著(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 早期DM大鼠血生化指標(biāo)的檢測(cè)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group.

5 心臟超聲檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，DM模型組大鼠的LVIDd及LVIDs顯著增大(P<0.01)，LVPWd及LVPWs不同程度增厚(P<0.05)，F(xiàn)S、LVEF及LVW顯著降低，LVW/BW增高顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM模型組相比較，DM+FIM組LVPWd降低顯著(P<0.05)，F(xiàn)S和LVEF升高顯著(P<0.05)，LVW/BW顯著降低(P<0.05),其它各指標(biāo)變化不大，見(jiàn)圖1、表5。

Figure 1. M-mode echocardiography of cardiac tissue from each group．

6 HPLC檢測(cè)相關(guān)氨基酸的表達(dá)

同型半胱氨酸在糖尿病模型組大鼠心肌組織中表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；與DM模型組相比較，DM+FIM組Hcy的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，SAH在糖尿病模型組大鼠心肌組織中表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而SAM在DM模型組和FIM干預(yù)組表達(dá)變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但SAM/SAH值升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與DM模型組相比較，DM+FIM組SAM水平同樣變化不大，但SAM/SAH值降低顯著(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表5 早期DM大鼠左室結(jié)構(gòu)參數(shù)及功能比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group.

表6 HPLC檢測(cè)大鼠心肌組織相關(guān)氨基酸的表達(dá)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group.

7 SAHH及AT1-R蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAHH在各處理組的表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著的差異。相對(duì)于正常對(duì)照組，DM模型組大鼠心肌SAHH蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與DM模型組相比較，DM+FIM組SAHH的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The expression of SAHH in the cardiac tissues in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

AT1-R蛋白在糖尿病模型組大鼠心肌組織中表達(dá)相對(duì)于正常對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與DM模型組相比較，DM+FIM組的AT1-R蛋白表達(dá)增加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The expression of AT1-R in cardiac tissues of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.##P<0.01vsDM group.

討 論

有研究表明，SAHH及下游Hcy等因子的表達(dá)可能是心血管病發(fā)生發(fā)展的重要作用機(jī)制，而SAHH的表達(dá)調(diào)控作用可能是該機(jī)制作用中的重要環(huán)節(jié)[12]。SAHH催化水解SAH生成腺苷和同型半胱氨酸。研究顯示，Hcy參與介導(dǎo)多種原因引起的血管損害，同時(shí)對(duì)包括心臟大血管在內(nèi)的血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮功能、血脂蛋白和血液凝集系統(tǒng)均有損害作用[13]。進(jìn)一步研究顯示，當(dāng)Hcy水平升高超過(guò)與一氧化氮(nitric oxide，NO)反應(yīng)的飽和極限時(shí)，多余的Hcy就可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致NO生成減少，從而進(jìn)一步促進(jìn)心血管系統(tǒng)的損傷[14]。而SAHH介導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性腺苷是心血管急性期代償預(yù)適應(yīng)的觸發(fā)因子之一，一過(guò)性心肌缺血或長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)缺血刺激時(shí)阻斷腺苷受體進(jìn)而減弱其心肌保護(hù)作用。由此我們可以推斷，SAHH對(duì)早期缺血預(yù)適應(yīng)起到了觸發(fā)和介導(dǎo)的作用。血管緊張素II受體拮抗劑在心血管疾病的治療方面表現(xiàn)出越來(lái)越多的作用。Song等[15]研究顯示，替米沙坦可以通過(guò)激活主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)的表達(dá)起到緩解高血糖狀態(tài)下心血管病變的作用。Rhee等[16]研究顯示，非馬沙坦聯(lián)合他汀類藥物更能降低血液的Hcy等成分，產(chǎn)生更好的心臟保護(hù)作用，而相應(yīng)的機(jī)制仍不清楚。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)所建立大鼠2型糖尿病模型進(jìn)行多種形式的驗(yàn)證，以非馬沙坦對(duì)糖尿病模型大鼠心臟病變進(jìn)行干預(yù)，探究非馬沙坦對(duì)SAHH表達(dá)水平變化的影響，用以推斷非馬沙坦與SAHH表達(dá)狀態(tài)的調(diào)節(jié)關(guān)系。2型糖尿病大鼠模型研究顯示，在干預(yù)處理的4周時(shí)間里，模型組與正常對(duì)照組以及FIM處理組之間已經(jīng)表現(xiàn)出心肌功能的差異。超聲心動(dòng)圖的研究顯示，F(xiàn)IM干預(yù)組在心肌收縮率、左室舒張末期內(nèi)徑、短軸縮短率、左室射血分?jǐn)?shù)及左室質(zhì)量等指標(biāo)表現(xiàn)出心肌功能代償性的恢復(fù)。Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于正常對(duì)照組，糖尿病心肌病早期DM模型組心肌組織SAHH的表達(dá)顯著升高，而FIM處理組則下降；DM模型組AT1-R表達(dá)降低，而FIM處理組則升高顯著。HPLC技術(shù)對(duì)相關(guān)氨基酸檢測(cè)結(jié)果顯示，Hcy在DM模型組表達(dá)升高，F(xiàn)IM處理組表達(dá)則相對(duì)于DM組降低顯著，SAH的表達(dá)變化趨勢(shì)與Hcy相反；而SAM在各組間變化不顯著。我們推測(cè)，在糖尿病狀態(tài)下，能量代謝紊亂，反饋性引起SAHH表達(dá)升高，高表達(dá)的SAHH作用下，大量的SAH水解產(chǎn)生Hcy和腺苷，體內(nèi)Hcy表達(dá)處于高水平。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM模型組大鼠心肌組織Ang II顯著升高，直接作用于心肌成纖維細(xì)胞，與細(xì)胞表面的AT1-R結(jié)合刺激心肌成纖維細(xì)胞增生及膠原代謝的改變，引起心肌間質(zhì)及血管周圍纖維化，導(dǎo)致心臟重構(gòu)，心室順應(yīng)性下降，最終引起舒張和收縮功能障礙，心肌局部RAS異常激活，AT1-R的表達(dá)顯著降低，而在給予FIM干預(yù)后，AngⅡ水平顯著降低，而AT1-R表達(dá)出現(xiàn)反饋性升高，高表達(dá)的血管緊張素抑制了SAHH的活性，同時(shí)Hcy處在甲硫氨酸循環(huán)中SAH的下游，高水平的Hcy同時(shí)也引起SAHH表達(dá)下調(diào)，SAHH不足促進(jìn)了SAH降解受阻、濃度升高。而SAH又恰處于SAM向DNA轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的下游，SAHH降低，SAH升高，轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)受阻，甲硫氨酸循環(huán)紊亂，從而促進(jìn)DNA低甲基化的發(fā)生。體內(nèi)DNA低甲基化狀態(tài)同時(shí)又影響Hcy代謝，而SAM的表達(dá)變化不大。本研究提示，非馬沙坦在體內(nèi)可能是起到SAHH內(nèi)源性抑制劑的作用來(lái)調(diào)節(jié)SAHH的表達(dá)，進(jìn)而能夠緩解高糖尿病狀態(tài)下Hcy相關(guān)的心肌病變及SAH誘導(dǎo)的心臟大血管病變，其機(jī)制可能與血管緊張素動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)SAHH的酶活來(lái)影響Hcy的代謝水平有關(guān)。

糖尿病心肌病是糖尿病心血管嚴(yán)重并發(fā)癥的重要組成部分，氨基酸代謝酶系在該病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中研究越來(lái)越受到重視。本研究初步探知了非馬沙坦可能通過(guò)對(duì)血管緊張素的表達(dá)調(diào)節(jié)，干預(yù)糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，也提示我們血管緊張素調(diào)節(jié)作用在糖尿病心肌病的治療中可能會(huì)是一個(gè)有益的研究方向。