Apelin改善RUPP大鼠模型的妊娠結(jié)局*

王成書， 劉曉莉， 李艷青， 黃向華△， 常瑞晶

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050000；2河北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科， 河北 石家莊 050011)

近年來(lái)，妊娠期高血壓疾病已成為孕產(chǎn)婦與圍產(chǎn)兒發(fā)病率及近遠(yuǎn)期死亡率增高的主要原因，至今尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的預(yù)防和治療子癇前期(preeclampsia，PE)的藥物。RUPP(reduced uterine perfusion pressure)大鼠模型在模擬子癇前期的高血壓、氧化應(yīng)激及胎兒生長(zhǎng)受限方面最貼近[1-2]，在其它物種也能成功地被復(fù)制。該模型已被用作藥物干預(yù)治療子癇前期的研究，如枸櫞酸西地那非、血紅素加氧酶和普伐他汀等[3-5]。Apelin (APLN)是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有多種生物學(xué)功能的血管活性肽，參與調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)水鹽代謝及介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)[6-8]。Apelin存在多種亞型，其中短肽比長(zhǎng)肽活性更強(qiáng)，在心血管系統(tǒng)中以apelin-13和apelin-36活性最強(qiáng)[9]。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)apelin在RUPP大鼠模型中的研究報(bào)道。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

清潔級(jí)SD大鼠(體重180～200 g)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18～28 ℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)，不控制水和食物。夜間將雌雄鼠按(3～4)∶1同籠喂養(yǎng)，每日晨取鼠陰道分泌物涂片，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)到精子當(dāng)天定義為大鼠孕0天。

異氟烷購(gòu)于上海雅培公司；apelin-13購(gòu)于Cayman；大鼠可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)ELISA試劑盒購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司；大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的建立 參考Granger等[10]的描述建立RUPP大鼠模型。銀質(zhì)血管收縮夾的制作：在銀夾的V型區(qū)，放入一個(gè)直徑0.203 mm/0.1 mm的針灸針，打開(kāi)銀夾鉗，將銀夾對(duì)準(zhǔn)置于銀夾鉗頭部的槽內(nèi)，夾持并閉合銀夾，然后抽取出針灸針，這就在銀夾的V型區(qū)制造出直徑0.203 mm/0.10 mm的銀質(zhì)血管收縮夾，分別作為腹主動(dòng)脈和子宮血管卵巢支的血管夾。RUPP手術(shù)方法：孕鼠14 d(體重200～250 g)用1.5%～2%異氟烷麻醉，碘伏消毒后開(kāi)腹，距髂總動(dòng)脈分叉處上方0.5～1 cm游離腹主動(dòng)脈約1 cm，將分離出的腹主動(dòng)脈(距離髂總分叉處至少0.5 cm)滑入銀夾直徑0.203 mm區(qū)域，暴露并分離兩側(cè)子宮血管卵巢支，分別滑入銀夾直徑0.1 mm的區(qū)域，關(guān)腹后置孕鼠側(cè)臥位，予保暖直至清醒。

2.2動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)流程 將14 d 孕鼠(體重200～250 g)隨機(jī)分為4組，分別為正常孕鼠(normal pregnant,N)組(分離腹主動(dòng)脈后將銀夾放在腹部脂肪中，n=6)、RUPP孕鼠(PE)組(行腹主動(dòng)脈及雙側(cè)子宮動(dòng)脈縮窄術(shù)，n=7)、APLN組(同N組，n=7)和PE+APLN組(同PE組，n=8)。記錄孕14 d 孕鼠胚胎數(shù)目；從孕14 d 起，給APLN組及PE+APLN組皮下注射apelin-13，劑量100 μg/kg，每天2次，共5 d，PE組及N組連續(xù)5 d皮下注射相當(dāng)劑量的生理鹽水；孕18 d 收集24 h 尿量；孕19 d 用2%異氟烷麻醉后行頸總動(dòng)脈血壓測(cè)量及心臟功能檢測(cè)，再行剖宮產(chǎn)術(shù)、腹主動(dòng)脈采血及胎盤組織標(biāo)本采集。

2.3尿液收集方法 大鼠孕18 d 將其放于標(biāo)準(zhǔn)代謝籠中，24 h 后收集孕鼠尿液量，將尿液2 000 r/min離心10 min，取出上清液，置于-40 ℃冰箱保存待檢。測(cè)定尿液中尿蛋白的濃度，根據(jù)尿量及尿蛋白的濃度計(jì)算出24 h 尿蛋白總量。

2.4頸總動(dòng)脈血壓測(cè)量及心臟功能檢測(cè) 2%異氟烷麻醉大鼠后，將其仰臥位捆綁固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，1.5%～2%異氟烷維持，頸部備皮、碘伏消毒，切開(kāi)頸部皮膚，暴露右頸總動(dòng)脈，先游離出右頸總動(dòng)脈約1～1.5 cm，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾閉。將鑷子柄部放在夾閉的遠(yuǎn)心端與近心端之間的頸總動(dòng)脈下方，固定頸總動(dòng)脈，在臨近遠(yuǎn)心端結(jié)扎處的動(dòng)脈壁上用眼科小剪刀以30°傾斜角度朝向近心端剪斜口，注意不要剪斷。用平鑷輕柔夾起已經(jīng)剪開(kāi)的頸總動(dòng)脈斜口上緣，將充滿0.3%肝素生理鹽水的頸動(dòng)脈插管(內(nèi)徑0.8 mm)向近心端插入約1 cm，用絲線穿線結(jié)扎近心端動(dòng)脈血管和導(dǎo)管，連接壓力換能器和多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(將數(shù)據(jù)輸入到計(jì)算機(jī))；松開(kāi)動(dòng)脈夾將導(dǎo)管再送入約1 cm左右，即可看到動(dòng)脈的血壓波形；待孕鼠安靜穩(wěn)定5 min左右后，記錄頸動(dòng)脈收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)和舒張壓(diastolic arterial pressure，DAP)，據(jù)此可換算出平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)；然后慢慢插管至左心室，當(dāng)出現(xiàn)左室波形后停止推進(jìn)插管，穩(wěn)定約20 min后記錄描記的心率(heart rate，HR)、左心室收縮末期壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左心室壓力最大上升和最大下降速率(±dp/dtmax)。

2.5ELISA法檢測(cè)孕鼠血清VEGF-A和sFlt-1的水平 用抗大鼠VEGF-A和sFlt-1單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的大鼠VEGF-A和sFlt-1分別與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠VEGF-A和sFlt-1抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物工作液TMB，出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450 nm處測(cè)吸光度(A)值，大鼠VEGF-A和sFlt-1濃度與A值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中大鼠VEGF-A和sFlt-1水平。

2.6化學(xué)法測(cè)定孕鼠血清MDA和T-AOC的水平 MDA可與硫代巴比妥酸生成有色化合物，在530 nm處有最大吸收，測(cè)定其吸光度；T-AOC能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過(guò)比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，均行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析和Student-Newman-Keuls法進(jìn)行多組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血流動(dòng)力學(xué)的變化

由表1可見(jiàn)，PE組的頸動(dòng)脈收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓比N組升高(P<0.05)，LVESP和LV+dp/dtmax較N組均降低(P<0.05)，而LVEDP較N組明顯增高(P<0.05)。

PE+APLN組的收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓與PE組比較均降低(P<0.05)，LVESP和LV +dp/dtmax均比PE組高，而LVEDP明顯降低(P<0.05)；APLN組上述參數(shù)與N組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表1。

2 尿蛋白定量

由表1可見(jiàn)，PE組24 h 尿蛋白定量比N組明顯升高(P<0.05)，但N組尿蛋白并沒(méi)有呈陰性，這與人類不同；PE+APLN組24 h尿蛋白比PE組低(P<0.05);APLN組與N組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3 妊娠結(jié)局

3.1胚胎 PE組的胚胎存活率與N組比較明顯減低，而PE+APLN組比PE組高 (P<0.05)；PE組存活胚胎平均體重比N組減低，而PE+APLN組比PE組增加(P<0.05),見(jiàn)表1。

3.2胎盤 PE組胎盤重量比N組減低, PE+APLN組比PE組增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 妊娠大鼠及其胚胎的生物學(xué)參數(shù)的比較

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsPE group.

胎盤形態(tài)學(xué)變化：HE染色光學(xué)顯微鏡示，與N組比較，PE組的絨毛水腫、細(xì)胞排列較亂、細(xì)胞核大小不一、深染； PE+APLN組胎盤絨毛的水腫減輕，細(xì)胞排列較齊整，深染區(qū)減少。電鏡下觀察，PE組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體嵴和膜融合消失、可見(jiàn)糖原；PE+APLN組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、部分線粒體嵴和膜融合消失、富含糖原，見(jiàn)圖1。

4 血清VEGF-A、sFlt-1、T-AOC及MDA水平的比較

由表2可見(jiàn)，PE組血清VEGF-A水平比N組減低，而PE+APLN組比PE組和N組均減低(P<0.05)；PE組血清sFlt-1水平比N組增高，而PE+APLN組與PE組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；PE組血清的T-AOC水平比N組降低，而PE+APLN組血清的T-AOC水平比PE組增加(P<0.05)；PE組血清的MDA水平比N組升高，而PE+APLN組比PE組降低(P<0.05)。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤apelin含量減少[11-12]，且正常妊娠和子癇前期患者胎盤組織apelin亞型主要為apelin-13[3]。Apelin在胎盤組織中的存在，提示它已參與到調(diào)節(jié)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、胚胎發(fā)育以及胎兒生長(zhǎng)控制。有研究表明apelin控制胎兒和新生兒葡萄糖穩(wěn)態(tài)、改變了孕產(chǎn)婦營(yíng)養(yǎng)不良引起的胎兒生長(zhǎng)受限[13]。同時(shí)，apelin還具有穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、舒張血管和促進(jìn)血管新生等方面的作用。因此，在大鼠子癇前期模型注射apelin-13治療是可行的。至今的研究尚未發(fā)現(xiàn)apelin對(duì)胎兒具有不良影響。

Figure 1. The effect of apelin on morphological structure of placenta. A: the placenta appearance; B: HE staining in placenta tissue with trophoblast cells in labyrinth layer (×400); C: electron microscopic images of glycogen in trophoblast cells of placenta tissue (×20 000).

表2 妊娠大鼠血清學(xué)標(biāo)志物的變化

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsPE group.

在本實(shí)驗(yàn)中，我們也成功地應(yīng)用RUPP大鼠模型模擬了子癇前期的主要臨床表現(xiàn)，胎盤形態(tài)學(xué)也表現(xiàn)出缺血缺氧。有趣的是，該動(dòng)物模型受apelin-13干預(yù)后，其臨床表現(xiàn)、妊娠結(jié)局及胎盤形態(tài)學(xué)均不同程度地有所改善，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。在動(dòng)物心梗心衰模型和肺動(dòng)脈高壓模型的研究中，也證實(shí)了apelin能改善心功能和擴(kuò)張血管的作用[14-15]。

在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的幾種類型中，VEGF-A具有高度的內(nèi)皮細(xì)胞特異性，在血管的發(fā)生和形成過(guò)程中起著主要的調(diào)控作用；而sFlt-1是一種選擇性剪接和截短的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，游離于血清， 與VEGF-A結(jié)合則減少促血管生成因子與其結(jié)合，最終導(dǎo)會(huì)致血管內(nèi)皮功能紊亂。本研究結(jié)果中PE+APLN組血清sFlt-1與PE組相比差異不顯著，但VEGF-A水平明顯下降，這種現(xiàn)象或許是受到apelin這一血管活性物質(zhì)的抑制。曾有研究顯示apelin能抑制VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的下調(diào)[16]。胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育必然涉及到血管的逐漸形成，apelin的促血管生成作用或許促進(jìn)了PE+APLN組胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育，從而改善其妊娠結(jié)局。

研究表明氧化應(yīng)激在子癇前期發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要作用，母血的氧化應(yīng)激狀態(tài)可預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)展[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，apelin-13使PE+APLN組的抗氧化能力得到不同程度恢復(fù)。Apelin在心臟疾病的動(dòng)物模型中同樣起著防御氧化應(yīng)激的作用。盡管許多研究表明在子癇前期患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前，其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平已經(jīng)升高，但是后來(lái)的研究數(shù)據(jù)并不支持單純應(yīng)用抗氧化劑(比如維生素E和維生素C)能有效預(yù)防子癇前期的發(fā)生[18]。Apelin雖然減輕了PE+APLN組的氧化應(yīng)激水平，但這種現(xiàn)象應(yīng)該不是改善子癇前期臨床表現(xiàn)的最終機(jī)制。

總之，本實(shí)驗(yàn)為預(yù)防和治療子癇前期提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及臨床治療探索路線，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。