硝酸甘油聯(lián)合β-巰基乙醇對冠心病患者外周血內皮祖細胞的影響

曾彩雨， 賀 紅， 楊發(fā)林， 潘 建， 寧建文， 劉 鑫

(1浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院急診科， 浙江 杭州 310003； 山東大學齊魯醫(yī)院2心內科,3檢驗科， 山東 濟南 250012)

血管內皮功能障礙尤其是內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能障礙參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生發(fā)展，并在缺血性疾病中起重要作用，外周血和骨髓來源的EPCs在特定條件下能夠定向遷移到內皮損傷部位，通過一系列內皮修復機制改善內皮功能障礙[1]。既往研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)調節(jié)的信號途徑參與了EPCs的動員、增殖、遷移、分化和黏附的各個過程[2]。硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)作為治療心血管疾病的基礎藥物已有百年歷史，然而實驗證實給大鼠48 h不間斷滴注硝酸甘油能制作硝酸甘油耐藥模型，并發(fā)現硝酸甘油耐藥可誘導EPCs凋亡并抑制其增殖；臨床經驗也顯示長期持續(xù)或一次大量靜脈應用硝酸甘油會產生過量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，細胞實驗證明這些ROS來自線粒體、NADPH氧化酶和脫耦聯(lián)的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)等，其中損傷作用極強的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO-)會降低NO的生物利用度，從而引起血管內皮功能障礙，臨床上誘發(fā)硝酸甘油耐藥[3-4]。前期實驗已經證明低濃度(7.5 mg/L)的硝酸甘油通過提供適宜濃度的外源性一氧化氮，可上調血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)的表達，促進EPCs的增殖；而高濃度(20.0 mg/L)的硝酸甘油通過過量外源性NO使ONOO-和ROS水平明顯增加，損傷細胞酶系統(tǒng)，從而降低NO的生物利用度，使EPCs增殖能力下降[5]。但是硝酸甘油影響EPCs增殖的分子機制尚未清楚，而β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)能否通過提供胞內酶所需的巰基來減輕高濃度的硝酸甘油引起的耐藥也未可知。本研究以硝酸甘油作為研究對象，研究其對EPCs體外增殖影響的分子機制，并將β-巰基乙醇與中毒濃度的硝酸甘油聯(lián)用，探討硝酸甘油耐藥的干預措施及潛在機制，為硝酸甘油在冠心病(coronary heart disease, CHD)治療中的使用提供新的基礎理論依據，并為解決硝酸甘油耐藥問題提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 患者來源

本實驗所選的冠心病患者為山東大學齊魯醫(yī)院2013年1月～2015年1月于心內科住院患者，共75例，這些患者均因冠脈疾病行選擇性冠脈造影，經相關檢查排除6個月內曾患心肌梗死、主動脈狹窄、肥厚性心肌病及惡性高血壓，且住院期間未服用維生素E及維生素C等抗氧化的藥物。實驗分2組，其中對照(control)組40人，34例女性，6例男性，平均年齡(55.7±7.1)歲，住院期間未常規(guī)應用硝酸酯類藥物或用藥小于24 h；硝酸甘油(NTG)組35人，31例女性，4例男性，平均年齡(58.9±8.0)歲，住院期間曾連續(xù)使用硝酸甘油(>0.5 μg·kg-1·min-1)超過48 h。本研究經山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會通過(KYLL-2013-115)，所有患者及志愿者簽署知情同意書后獲取實驗材料。

2 實驗材料

胎牛血清、M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS(Hyclone)；MTT (Sigma)；6孔、24孔及96孔細胞培養(yǎng)板(Corning)；VEGF及ONOO-酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(R&D system)；抗β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠 II 抗(中杉金橋)；鼠抗人p-Akt、Akt(Ser473)、p-eNOS和eNOS(Ser1177)抗體(CST)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(HERAcell 2401)；酶標儀(Infinite M200)；離心機(Beckman L-100XP)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX70-142)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM710)。

3 實驗方法

3.1臨床試驗 留取上述患者及健康志愿者外周血各1 mL，用流式細胞儀測定CD34和KDR雙標陽性的循環(huán)內皮祖細胞水平，并用ELISA法檢測血漿中ONOO-和VEGF-A的表達水平。

3.2內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 留取經冠脈造影確診的冠心病患者及正常志愿者外周血各50 mL，用人淋巴細胞分離液經密度梯度離心法獲得單個核細胞，加入M199培養(yǎng)基調整細胞密度至(2～5)×109/L，接種至人纖維連接蛋白包被的24孔培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、濕度95%)中培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后去除未貼壁細胞，隔天換液。培養(yǎng)過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。培養(yǎng)至第7天，對貼壁細胞進行鑒定：加入DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein,DiI-ac-LDL,2.4 mg/L)，37 ℃孵育1 h，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定細胞，用PBS浸洗3次，晾干后將10 mg/L的FITC-UEA-I加入上述標本，37 ℃孵育1 h，再用PBS洗3次，吹干待檢；滴上緩沖甘油(甘油1份和0.01 mmol/L、pH 7.2的PBS 1份)1滴，于多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定。計數鑒定正常志愿者及冠心病患者貼壁細胞的數量，檢測其黏附能力、遷移能力(Boyden小室法)及成血管能力(采用體外血管生成試劑盒檢測體外EPCs的血管生成能力，細胞拉長變形，長度為寬度的4倍以上可被認為形成小管)，以上計數均于400倍倒置顯微鏡下選取8個視野計數后，計算每高倍視野平均數。

3.3冠心病患者內皮祖細胞活力的檢測 MTT法分別檢測硝酸甘油、LY294002及β-巰基乙醇對EPCs活力的影響，培養(yǎng)7 d后用胰蛋白酶消化貼壁的EPCs，并重新接種到96孔板中，分別用硝酸甘油(7.5和20 mg/L)、LY294002(50 μmol/L)及β-巰基乙醇(50 μmol/L)進行干預，72 h后用MTT法檢測EPCs活力，在培養(yǎng)第12天，在顯微鏡高倍視野下用人工計數法觀察不同濃度硝酸甘油對EPCs集落數及EPCs絕對計數的影響，在24孔板中培養(yǎng)可見集落時在400倍倒置顯微鏡下選取8個視野計數后，計算每高倍視野平均數，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后消化下貼壁細胞計數絕對數取平均值，計數由未參與處理細胞的兩人獨立完成。

3.4冠心病患者EPCs培養(yǎng)液中ROS、ONOO-和VEGF-A水平的檢測 硝酸甘油和β-巰基乙醇干預72 h后，用DCFH-DA探針檢測上清液中ROS水平，去除細胞培養(yǎng)的上清液，每孔各加入10 μmol/L的DCFH-DA，并以DMSO作為溶劑對照，37 ℃孵育細胞60 min后，用PBS洗滌細胞2次，每孔再加入適量培養(yǎng)基，分別采用熒光顯微鏡及熒光酶標儀對其熒光強度進行檢測；同時，根據ELISA試劑盒說明書用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中ONOO-及VEGF-A的水平。

3.5冠心病患者內皮祖細胞Akt、p-Akt、eNOS及p-eNOS水平的檢測 用冷PBS漂洗細胞3次，每孔加入200 μL細胞裂解液，刮下細胞，冰上裂解30 min后，15 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清蛋白溶液于-70 ℃保存?zhèn)溆?，各組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，然后轉移至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1 h，分別加入I抗,4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次10 min，再加入辣根過氧化物酶標記的II抗，37 ℃孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯影，用β-actin 蛋白的吸光度進行標準矯正，ImageJ計算目的蛋白磷酸化與β-actin的比值。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所有實驗至少重復4次，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。表1和表2中兩組間均數比較采用t檢驗，其余數據采用單因素方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 對照組與高濃度硝酸甘油組各項臨床資料及EPCs、VEGF-A和ONOO-水平

BMI: body mass index; SP: systolic pressure; DP: diastolic pressure; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; ACEI: angiotensin-converting enzyme inhibitor; CCB: calcium channel blocker; EPCs: endothelial progenitor cells; VEGF-A: vascular endothelial growth factor-A; ONOO-: peroxynitrite; CRP: C-reactive protein.

表2 冠心病患者與健康志愿者循環(huán)血中內皮祖細胞數量及功能的比較

結 果

1 冠心病患者臨床資料的比較

與對照組相比，在年齡、血壓、血糖和血脂等基礎資料無明顯差異的情況下，高濃度硝酸甘油組內皮祖細胞數量明顯下降(P<0.01)，血清中ONOO-水平明顯升高(P<0.01)，VEGF-A水平顯著降低(P<0.01)，見表1。

2 冠心病患者EPCs功能變化及細胞形態(tài)觀察

與正常志愿者比較，顯微鏡高倍視野下觀察冠心病患者貼壁的EPCs數量減少(P<0.05)，黏附能力、遷移能力和成血管能力均減弱(P<0.05)，見表2；細胞形態(tài)的變化基本一致，培養(yǎng)7 d 的EPCs可見細胞集落周圍出現梭形細胞，見圖1A；培養(yǎng)14 d 的EPCs呈大的集落樣生長，四周梭形細胞放射狀排列，見圖1B；再培養(yǎng)1～2 d 呈鋪路石樣改變，見圖1C。2類人群來源的EPCs用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I鑒定，EPCs吸附FITC-UEA-I呈綠色，見圖1D，EPCs吸附DiI-ac-LDL呈紅色，見圖1E，合成后呈黃色，圖1F。

Figure 1. Morphology and characterization of EPCs from peripheral blood. A:colonies were reached a peak on the 7th d (×400); B: at day 14, the colony formation started with a central aggregate of round cells, surrounded by spindle-shaped cells radiating away from the central core that display endothelial features (×400); C: paving stone sample cells were formed (×400); D: the attached EPCs were evaluated for the uptake of lectin (FITC-UEA-I) (green,×100); E: binding of acetylated LDL labeled with 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine (red,×100); F: the merged image of D and E(×100).

3 硝酸甘油影響冠心病患者EPCs活力的機制

與對照組相比，適宜濃度的硝酸甘油通過顯著增強EPCs中p-eNOS(Ser1177)和p-Akt(Ser473)的蛋白水平，見圖3C，改善PI3K/Akt/eNOS信號通路，從而促進VEGF-A分泌，見圖3B，來促進EPCs的生長，見圖3A；而高濃度硝酸甘油抑制了Akt和eNOS的磷酸化水平及VEGF-A的分泌，見圖3C、4D，提高了上清液中ONOO-水平及貼壁細胞ROS水平，見圖4B、圖2，使EPCs的活力被抑制，見圖3A、4A。

4 β-巰基乙醇明顯改善高濃度硝酸甘油對冠心病患者EPCs活力的抑制作用

Figure 2. The effect of NTG and β-ME on the releasing of ROS in EPCs. Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsNTG (20 mg/L) group.

Figure 3. The effects of NTG and LY294002 on the cell viability of EPCs. A and B: the cell viability and VEGF-A production of EPCs were detected; C: the protein expression of p-Akt and p-eNOS was detected by Western blot. Mean±SD.n=5.# P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsNTG (7.5 mg/L) group;△P<0.05vsNTG (20.0 mg/L) group.

Figure 4. The effects of NTG and β-ME on EPCs.A: pre-incubation with β-ME enhanced the proliferation of EPCs as compared with single NTG treatment (20.0 mg/L); B and C: there was a significant decrease in ONOO-production, and a significant increase in VEGF-A production between NTG-treated group and the NTG (20.0 mg/L)+β-ME (50 μmol/L) group;D:β-ME reversed the effect of excess NTG (20.0 mg/L)-induced down-regulation of p-Akt and p-eNOS protein levels. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsNTG (20 mg/L) group.

與高濃度硝酸甘油(20.0 mg/L)組相比，聯(lián)用β-巰基乙醇明顯降低ONOO-的水平，見圖4B，和降低貼壁細胞ROS的生成，見圖2，改善磷酸化Akt和eNOS的水平，見圖4D，表明β-巰基乙醇可以通過減輕氧化應激并改善PI3K/Akt/eNOS信號通路來改善硝酸甘油耐藥。

討 論

本研究證明了：(1)與對照組相比，連續(xù)應用高濃度硝酸甘油48 h可使冠心病患者會產生耐藥，具體表現為抑制外周血中EPCs活力，使其分泌ONOO-水平升高血循環(huán)血中VEGF-A的分泌減少；(2)不同濃度硝酸甘油通過影響EPCs中p-Akt和p-eNOS的蛋白水平影響ONOO-和VEGF-A生成來改變EPCs的細胞活力；(3)β-巰基乙醇從蛋白水平改善了耐藥情況下EPCs中Akt和eNOS的磷酸化水平，恢復了eNOS的活性，改善了硝酸甘油耐藥，說明除了已證明的NO可通過環(huán)磷酸鳥苷通路介導影響細胞生長和分化，外源性NO也通過PI3K/Akt/eNOS信號通路介導影響細胞的生長和分化。

通過新生血管供給營養(yǎng)來恢復組織和器官的功能被認為是機體發(fā)生缺血性疾病后自我修復的一種重要途徑，EPCs在缺血組織血管新生中起到關鍵作用[6]。以往研究證明PI3K/Akt/eNOS信號通路在細胞的生長、增殖及功能發(fā)揮等多方面具有重要作用[7]。該信號途徑的多種上游細胞因子(如PI3K及PKB/Akt)和下游因子(如eNOS、mTOR、p70S6K和FOXO)等調節(jié)EPCs的增殖[8-9]。在PI3K及eNOS敲除的小鼠中由缺血和VEGF引起的EPCs的增殖和動員能力均下降[10]。我們的研究也證明了適宜濃度的硝酸甘油可以通過提供的外源性NO來調節(jié)PI3K/Akt/eNOS信號通路，促進EPCs生長。

以往的研究大多認為硝酸甘油只能迅速改善心臟病癥狀，不能改善預后，且長期連續(xù)或一次大劑量應用后會產生耐藥，限制了其在臨床上的應用，目前的治療指南中硝酸甘油未成為像β-受體阻滯劑及鈣通道阻滯劑治療心臟病的一線藥物。引起硝酸甘油耐藥的機制有多種，近來對硝酸甘油體外耐藥機制的研究如下：(1)巰基耗竭學說認為硝酸甘油向NO的生物轉化過程中需要多種巰基酶的參與，持續(xù)應用硝酸甘油會引起細胞內巰基的逐漸消耗，導致NO生成逐漸減少，生物利用度下降[3]；(2)氧化應激學說認為長期持續(xù)應用硝酸甘油在代謝過程中產生過氧化亞硝酸蓄積，對細胞DNA損傷作用強[11]。研究證實持續(xù)硝酸甘油治療時超氧陰離子的生成主要來源有黃嘌呤氧化酶、NADH/NADPH氧化酶[12]、線粒體及內源性NOS(主要是eNOS脫耦聯(lián)引起)，大量的超氧化物可以使硝酸甘油向NO的轉化發(fā)生障礙，生物利用度下降。

為了防止耐藥的發(fā)生，最常應用的策略是小劑量間斷應用硝酸甘油，但會增加心臟缺血事件的發(fā)生率。本研究聯(lián)用β-巰基乙醇，表明：(1)由于硝酸甘油耐藥機制之一是巰基的耗竭，多種細胞在增殖、分化及發(fā)揮功能方面都有許多酶的參與，而這些酶中大多都含有巰基，既往研究表明β-巰基乙醇可通過提供巰基來改善細胞內酶活力來促進其增殖，本實驗發(fā)現聯(lián)用β-巰基乙醇可改善硝酸甘油耐藥；(2)高強度的氧化應激在硝酸甘油耐藥中作用明顯，本實驗證明β-巰基乙醇可以作為抗氧化劑，顯著減少高濃度硝酸甘油刺激時貼壁細胞的ROS產生量，ONOO-分泌量減少，顯著改善耐藥；(3)β-巰基乙醇從蛋白水平上改善了耐藥情況下EPCs中p-Akt和p-eNOS的蛋白水平，恢復了eNOS的活性。

總之，本研究從EPCs水平證明了適量濃度的硝酸甘油提供的外源性NO可以通過上調PI3K/Akt-eNOS信號通路使VEGF-A的含量增加，從而促進冠心病患者EPCs的細胞活力，聯(lián)用β-巰基乙醇可以改善硝酸甘油耐藥，從細胞水平上推測長期小劑量應用硝酸酯類藥物或可以改善心臟病患者預后，從而擴大硝酸酯類的臨床適應癥，為臨床上改善硝酸酯類耐藥提供了一種新思路。