AKT1負(fù)性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移的機(jī)制研究*

張國(guó)燕， 李志凌， 曹 珅， 彭 嬋， 盧 玥， 牛 杰， 席卓青， 張怡丹， 方 東， 謝松強(qiáng)

(河南大學(xué)藥學(xué)院， 河南 開(kāi)封 475004)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移則是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。在抗腫瘤新藥研發(fā)中蛋白激酶B(protein kinase B, PKB; 又稱(chēng)AKT)小分子抑制劑已受到關(guān)注，然而有研究發(fā)現(xiàn)抑制AKT1的功能反而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[2-3]。但目前為止，AKT1負(fù)性調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還不清楚。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種分子量約92 kD 的多功能蛋白質(zhì)。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)僅存在極少量的β-catenin，在細(xì)胞連接處作為一種細(xì)胞骨架蛋白參與細(xì)胞間的黏附，維持上皮的極性及完整性[4-5]。在異常情況下，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白的表達(dá)則會(huì)明顯上調(diào)，過(guò)多的β-catenin 則可進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)基質(zhì)金屬蛋白酶等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[6-7]。但β-catenin核轉(zhuǎn)位是否參與AKT1 負(fù)性調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移還不清楚，本研究擬探究β-catenin的核轉(zhuǎn)位是否參與了AKT1負(fù)性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和MDA-MB-231均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自四季青公司；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Hoechst 33342染料和XAV-939購(gòu)自Sigma；免抗人β-catenin多克隆抗體、鼠抗人AKT1和β-actin單克隆抗體、鼠抗人lamin B1多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自Santa Cruz； Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光 II 抗購(gòu)自Invitrogen；AKT1小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)購(gòu)自Dharmacon，2條siRNA序列分別為5’-ACAAGGACGGGCACATTAA-3’(1#siAKT1)和5’-CAAGGGCACTTTCGGCAAG-3’(2#siAKT1)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與RNA干擾 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染AKT1 siRNA, 轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin總蛋白和核蛋白的表達(dá) 用RIPA(碧云天)裂解液提取腫瘤細(xì)胞的總蛋白，使用細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(碧云天)分離出核蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的濃度是由BCA測(cè)定試劑盒(Pierce)測(cè)定。樣品在95 ℃、 5×SDS-PAGE緩沖液中變性5 min。等量的蛋白使用10%的SDS-PAGE分離。然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶在室溫下封閉1 h。封閉之后，使用抗β-catenin和β-actin抗體在4 ℃下孵化過(guò)夜。用TBST洗過(guò)3次后，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗孵育1 h，采用ECL試劑盒顯色檢測(cè)。

2.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá)及定位 在小室玻片中以低密度接種的細(xì)胞用AKT1 siRNA處理24 h。在室溫下，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，然后用PBS洗5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，4 ℃孵育抗β-catenin抗體 (1∶1 000) 過(guò)夜，然后用PBS 洗滌3 次，室溫孵育Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光 II 抗1 h，采用Hoechst 33342在室溫下標(biāo)記細(xì)胞核5 min，再用PBS 洗滌3 次，激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力 遷移實(shí)驗(yàn)是在以碳酸酯膜(Corning)為材料，孔徑為8 μm的24孔板里進(jìn)行的。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系經(jīng)胰酶消化后用不含血清的培養(yǎng)基制成1×108/L 的單細(xì)胞懸液，接種200 μL 至Transwell小室上室，在Transwell小室的下室中加入600 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)基，然后在上室轉(zhuǎn)染AKT1 siRNA，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后拿出小室，用棉簽擦去上室細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定小室膜下的細(xì)胞10 min，用含0.1%的結(jié)晶紫甲醇溶液染色20 min 后，PBS 洗3次，風(fēng)干，然后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間使用單因素方差分析；對(duì)于多組間多重比較，進(jìn)行方差分析后各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲減AKT1表達(dá)對(duì)β-catenin總蛋白表達(dá)的影響

MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染2條AKT1 siRNA (20 nmol/L) 24 h后，AKT1蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01),見(jiàn)圖1，并且β-catenin總蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2 敲減AKT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞中β-catenin核蛋白的影響

當(dāng)敲減MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中AKT1的表達(dá)后，細(xì)胞核中β-catenin蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也顯示，當(dāng)敲減AKT1表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中的β-catenin熒光染色明顯增強(qiáng)，β-catenin蛋白會(huì)在細(xì)胞核中集聚，見(jiàn)圖4。

3 β-catenin蛋白的核積聚對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

當(dāng)敲減AKT1表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，而端錨聚合酶抑制劑XAV-939可以明顯逆轉(zhuǎn)敲減AKT1表達(dá)誘導(dǎo)的乳腺癌遷移能力的增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

討 論

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其家族成員主要有3個(gè)，分別是AKT1、AKT2和AKT3，其基因分別定位于人染色體的14q32、19q13和1q44區(qū)域[8]。這3個(gè)成員結(jié)構(gòu)相似，在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有80%以上的同源性。大量文獻(xiàn)顯示AKT在肝癌、乳腺癌以及甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中以異?；罨问酱嬖?，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，因而AKT已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)，例如一些廣譜的AKT抑制劑AZD5363、Afuresertib和MK2206等已經(jīng)作為抗乳腺癌、胃癌、骨髓瘤和前列腺癌的藥物進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段[8-9]。然而，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)AKT家族的成員AKT1在乳腺癌及前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著不同的作用[10-11]，如AKT1的激活可以促進(jìn)乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的增殖，但抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；相反，當(dāng)AKT1功能受到抑制后，乳腺癌和前列腺癌的生長(zhǎng)雖然會(huì)受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)移能力則明顯增強(qiáng)。這將帶來(lái)臨床合理用藥問(wèn)題，即廣譜的AKT 抑制劑在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的同時(shí)很可能會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

Figure 1. The protein expression of AKT1 in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 2. The total protein expression of β-catenin in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 3. The expression of nuclear β-catenin protein in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 4. Immunohistochemical staining of β-catenin (green) in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA (×120). The cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue).

Figure 5. The effects of XAV-939 (XAV) on the enhanced migration ability of MCF-7 cells (A and B) and MDA-MB-231 cells (A and C) induced by AKT1 inhibition (×20). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs1#siAKT1 group;△△P<0.01vs2#siAKT1 group.

最近，Li等[12]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中使用MK-2206抑制AKT1，可通過(guò)降解磷酸化依賴(lài)的Twist1誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，AKT1功能抑制導(dǎo)致的乳腺癌轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的機(jī)制仍然不清楚。本研究證明β-catenin蛋白的核聚集介導(dǎo)了抑制AKT1誘導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。β-catenin蛋白是細(xì)胞間黏附結(jié)構(gòu)的主要組成部分，可通過(guò)核移位進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[13-14]。有文獻(xiàn)顯示廣譜的PI3K抑制劑GDC-0941可通過(guò)刺激Wnt的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中β-catenin的核移位[15]。AKT1作為PI3K下游的信號(hào)分子，AKT1抑制劑很可能也是通過(guò)刺激Wnt的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致β-catenin核移位的。然而這種推論是否正確，尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)然在肝癌、胃癌以及甲狀腺癌中，我們認(rèn)為這種推論是不存在的，因?yàn)樵谶@些腫瘤細(xì)胞中抑制AKT功能會(huì)導(dǎo)致β-catenin蛋白的水解，究其原因很可能是因?yàn)锳KT1在不同的腫瘤中的作用是不同的。