松香酸通過誘導(dǎo)自噬減輕AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)*

劉 芳， 劉 紀(jì)， 張 穎

(天津市環(huán)湖醫(yī)院內(nèi)科， 天津 300381)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)是碳水化合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)形成的聚合物[1]。大量研究表明，AGEs會導(dǎo)致心肌細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的增強[2-4]，而心肌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病心肌病的重要環(huán)節(jié)[5-7]，AGEs在糖尿病心肌病中起著重要的作用[8]。因此，發(fā)現(xiàn)抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的藥物對糖尿病心肌病的治療具有重要意義。松香酸(abietic acid，AA)是一種廣泛存在于樹木中的樹脂酸，是藥用植物西藏長葉松的主要生物活性物質(zhì)之一[9-10]。松香酸在過敏性哮喘治療、傷口愈合和皮膚保護方面都發(fā)揮著積極作用[11-13]。但松香酸在心肌損傷方面的作用還未見報道。本研究通過AGEs處理大鼠心肌細胞H9c2模擬心肌損傷，觀察松香酸對AGEs誘導(dǎo)的心肌損傷、細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面的影響，并探討松香酸影響心肌損傷的內(nèi)在機制。

材 料 和 方 法

1 細胞系與主要試劑

大鼠心肌細胞系H9c2購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。AA購自Sigma;AGEs購自Calbiochem；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司；MTT購自上海生工；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V Apoptosis Detection Kit)購自BD；抗肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、cleaved caspase-12、GADD34、BiP、LC3、P62和beclin 1抗體購自Abcam。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及細胞活力檢測 H9c2細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用MTT法檢測細胞存活率，首先將H9c2細胞制成1×107/L的細胞懸液接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后分別加入不同濃度(0、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100、200和400 μmol/L)的松香酸培養(yǎng)48 h;然后向孔板中加入MTT溶液孵育4 h，棄上清后加入DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶物;最后于570 nm處檢測吸光度(A)值。后續(xù)實驗分為5組：對照組加入生理鹽水處理24 h；AGEs處理組加入100 mg/L AGEs處理24 h;AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)組同時加入AGEs (100 mg/L)和AA (10、25、50 μmol/L)處理24 h。為了抑制自噬，向細胞中同時加入5 mmol/L的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)與AGEs和AA共處理24 h。

2.2Western blot檢測蛋白水平 首先用PBS將待測細胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解提取總蛋白，100 ℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h，加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃過夜孵育，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

2.3ELISA檢測乳酸脫氫酶含量 收集各組細胞培養(yǎng)物上清，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，樣品加入反應(yīng)孔后37 ℃孵育45 min后用洗滌液洗滌4次，然后加入生物素標(biāo)記的抗IgG抗體37 ℃反應(yīng)30 min，洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素混勻37 ℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min后加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測A值。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集待測細胞，PBS漂洗后用1× Binding Buffer制成1×109/L的細胞懸液，300×g離心10 min，棄上清，再用1 mL 1×Binding Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×109/L,再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色15 min，室溫、避光，輕輕混勻，最后利用流式細胞術(shù)對染色的細胞進行檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運用單因素方差分析比較各組間均數(shù)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 松香酸對H9c2細胞活力的影響

不同濃度的松香酸處理H9c2細胞48 h后，MTT法檢測細胞存活率,結(jié)果可見，低于50 μmol/L的松香酸對H9c2細胞存活率無明顯影響；高于50 μmol/L的松香酸會降低H9c2細胞活力，細胞存活率低于80%，且隨著松香酸濃度的增加細胞存活率逐漸降低,見圖1。上述結(jié)果表明低濃度(小于50 μmol/L)的松香酸對H9c2細胞活力無明顯影響，高濃度(大于50 μmol/L)的松香酸會降低H9c2細胞活力。

2 松香酸可減輕AGEs誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷

Western blot結(jié)果顯示，AGEs組的Mb、CK-MB和cTnI蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05);與AGEs組相比，AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)組的Mb、CK-MB和cTnI蛋白表達水平明顯降低，且松香酸濃度越高，Mb、CK-MB和cTnI的蛋白表達水平越低(P<0.05),見圖2。用ELISA試劑盒檢測心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH活性,結(jié)果如圖3所示,AGEs處理H9c2細胞后，LDH活性明顯升高(P<0.05);

Figure 1. The effect of abietic acid (AA) on the viability of H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1松香酸對H9c2細胞活力的影響

AGEs+AA (10 μmol/L)組與AGEs組LDH活性的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，AGEs+AA (25和50 μmol/L)組的LDH活性明顯低于AGEs組(P<0.05),由此可見，松香酸可減輕AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞損傷。

3 松香酸可抑制AGEs誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，對照組凋亡細胞數(shù)最少，AGEs組凋亡細胞數(shù)最多，細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)；AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)組細胞凋亡率均明顯低于AGEs組(P<0.05),見圖4。以上結(jié)果說明，松香酸可抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞凋亡。

Figure 2. Abietic acid (AA) alleviated the enhanced expression of myocardial cell damage marker proteins in the H9c2 cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 3. Abietic acid (AA) reduced the elevated levels of LDH in the culture supernatants of the H9c2 cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

4 松香酸對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，AGEs組的CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平明顯高于對照組，GADD34和BiP的蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05);與AGEs組相比，AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)組的CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平明顯降低，GADD34和BiP的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖5。上述結(jié)果表明，松香酸可抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的上調(diào)及GADD34和BiP的下調(diào)。

5 松香酸對自噬相關(guān)蛋白表達的影響

用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、P62和beclin 1的表達，分析松香酸對心肌H9c2細胞自噬的影響。結(jié)果顯示，AGEs組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin 1表達明顯低于對照組，P62表達明顯高于對照組(P<0.05);與AGEs組相比，AGEs+AA(10、25和50 μmol/L)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin 1表達明顯升高，P62表達明顯減弱(P<0.05)，見圖6。由此可見，松香酸可抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞自噬相關(guān)蛋白表達的改變，增強心肌H9c2細胞的自噬。

Figure 4. The AGEs-induced apoptosis of H9c2 cells was inhibited by abietic acid (AA). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 5. The effects of abietic acid (AA) on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 6. The effects of abietic acid (AA) on the expression of autophagy-associated proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

6 細胞自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)松香酸對心肌H9c2細胞的保護作用

為探索松香酸減輕AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制，用自噬抑制劑3-MA，松香酸和AGEs同時處理H9c2細胞后檢測相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示，AGEs+AA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和BiP表達明顯高于AGEs組；Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明顯低于AGEs組;AGEs+3-MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和BiP表達明顯低于AGEs組,Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明顯高于AGEs組(P<0.05),3-MA 對心肌細胞相關(guān)蛋白的影響與松香酸相反；與AGEs+AA組相比，AGEs+AA+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和BiP表達明顯降低，Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖7。上述結(jié)果表明，松香酸可通過誘導(dǎo)自噬減輕AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

討 論

許多文獻報道松香酸在治療各類疾病中具有積極作用。有研究顯示松香酸可通過抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移性和侵襲性發(fā)揮抗黑色素瘤的作用[9]。有數(shù)據(jù)顯示，松香酸具有調(diào)控肝細胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)的功能，在治療2型糖尿病和胰島素抵抗方面有潛在的應(yīng)用價值[14]。據(jù)報道，松香酸具有促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞生成和加速皮膚傷口愈合的功效[12]。有研究表明松香酸還可減輕脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷[15]。本文結(jié)果表明，松香酸可抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌 H9c2細胞Mb、CK-MB和cTnI蛋白水平的升高，減弱心肌損傷。

Figure 7. The effects of abietic acid (AA; 50 μmol/L) on the expression of autophagy-, myocardial cell damage- and endoplasmic reticulum stress-related proteins (A) and apoptosis (B) were reversed by autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA; 5 mmol/L). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group;&P<0.05vsAGEs+AA group.

各類疾病中常常會出現(xiàn)細胞凋亡的異常及各種應(yīng)激反應(yīng)。大量研究表明松香酸具有調(diào)控細胞凋亡及減輕各種應(yīng)激反應(yīng)的功效。有研究顯示，松香酸可調(diào)控宮頸癌細胞凋亡[15]。有研究表明，松香酸可降低哮喘模型小鼠過敏性氣道炎癥[11]。本研究結(jié)果顯示，AGEs處理大鼠H9c2心肌細胞會導(dǎo)致細胞凋亡增加，CHOP和cleaved caspase-12表達增強，GADD34和BiP表達減弱，松香酸可減低AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的改變，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

自噬在糖尿病心肌病進程中發(fā)揮著重要作用[16]。Hu等[17]研究表明自噬在AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中起著重要的保護作用。有研究顯示，紅花提取物可抑制血管緊張素誘導(dǎo)的H9c2細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的降低，通過增強H9c2細胞自噬減輕細胞凋亡[18]。本文結(jié)果顯示，在AGEs處理的H9c2心肌細胞中，松香酸可誘導(dǎo)自噬，提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin1表達，降低P62表達；自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)松香酸對自噬相關(guān)蛋白LC3、心肌損傷相關(guān)蛋白Mb、促凋亡分子cleaved caspase-12及促存活分子BiP蛋白水平的影響。

本研究表明，在AGEs處理的心肌 H9c2細胞中，松香酸可降低心肌損傷標(biāo)志物Mb、CK-MB和cTnI的蛋白水平，抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率，CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的升高及GADD34和BiP表達的降低，上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin1的表達，下調(diào)P62的表達。自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)松香酸對心肌細胞LC3、Mb、cleaved caspase-12和BiP蛋白水平的影響。

綜上所述，松香酸通過誘導(dǎo)自噬減輕AGEs誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。下一步計劃進行松香酸影響心肌損傷的體內(nèi)研究，為開發(fā)糖尿病心肌病治療藥物奠定基礎(chǔ)。