不同來(lái)源白念珠菌感染小鼠前后胞外水解酶活力差異

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白念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病真菌，自然界廣泛分布，為人、動(dòng)物機(jī)體正常菌群的一部分[1-2]。白念珠菌作為共生菌定植在口腔、胃腸道和泌尿生殖道等，因機(jī)體免疫力下降致侵襲性白念珠菌感染[3]，是血液、腫瘤和ICU病房患者死亡原因之一[4-5]。分泌水解酶作為致病因素之一[6-7]，可促使白念珠菌感染宿主并滲透宿主組織[8]。

白念珠菌分泌的水解酶中，分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinase，SAP)、磷脂酶(phospholipase，PL)、脂肪酶(lipase，Lip)與白念珠菌致病性關(guān)系密切，在逃避宿主免疫系統(tǒng)和藥物作用中起關(guān)鍵作用[9-10]。分泌型天冬氨酸蛋白酶具有較高的蛋白水解活性，能水解多種宿主底物，導(dǎo)致宿主細(xì)胞損傷[11]；磷脂酶能夠分別作用于甘油磷脂分子中不同的酯鍵，使甘油磷脂水解形成溶血磷脂，是血源性感染的重要毒力因子[10]；脂肪酶夠催化甘油單酯，還能與其他酶協(xié)同作用，使白念珠菌逃匿宿主免疫系統(tǒng)[12]。研究表明，上述3種酶在宿主不同解剖部位及不同感染階段呈差異性表達(dá)[13]。目前該3種酶在不同來(lái)源菌株間的體外表達(dá)差異與致病性的關(guān)系已經(jīng)有了較為詳細(xì)的研究，但此3種酶在感染宿主前、后表達(dá)的研究卻較少。

白念珠菌的致病能力與宿主的相互作用密切相關(guān)[14]，前期研究中，我們收集了臨床艾滋病、外陰陰道念珠病等患者的白念珠菌臨床分離株與健康人來(lái)源的菌株，比較受感染小鼠致死率和不同來(lái)源菌株分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶3 種致病相關(guān)分泌型水解酶體外表達(dá)水平差異。研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源菌株產(chǎn)生水解酶能力即使沒(méi)有差異，也能在感染小鼠后引起小鼠差異性死亡。有研究表明，白念珠菌水解酶在宿主不同解剖部位和不同感染階段會(huì)呈現(xiàn)差異性表達(dá)[2]。大量研究表明，腎臟是白念珠菌系統(tǒng)性感染小鼠過(guò)程中最主要的靶器官，同時(shí)小鼠腎臟因白念珠菌感染引起的炎癥，積水，膿腫等因素是引起小鼠死亡的決定性因素[15]。因此，我們進(jìn)一步收集死亡小鼠白念珠菌腎臟分離的白念珠菌菌株，比較菌株注入小鼠體內(nèi)前后這3種致病相關(guān)分泌型胞外水解酶的表達(dá)水平，探討白念珠菌的這3種胞外水解酶在宿主中的表達(dá)差異。

1 材 料

1.1儀器與試劑 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(上海，SW-CJ-IF)、紫外分光光度計(jì)(美國(guó)，DU640型)、三丁酸甘油酯平板瓊脂基礎(chǔ)、三丁酸甘油酯購(gòu)自青島日水生物公司；50%卵黃乳液購(gòu)自青島海博生物公司; 牛血清白蛋白、酵母碳源基礎(chǔ)(YCB)、購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2培養(yǎng)基配制 實(shí)驗(yàn)中用到的牛血清白蛋白培養(yǎng)基、卵黃瓊脂平板培養(yǎng)基、三丁酸甘油酯培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[16-18]的方法進(jìn)行配制。

2 方 法

2.1 構(gòu)建白念珠菌小鼠感染模型

2.1.1感染小鼠所用菌株 2009年6月至2010年9月從貴州5家省級(jí)及專科醫(yī)院收集獨(dú)立的深部感染及外陰陰道念珠病病患來(lái)源的臨床白念珠菌，按照文獻(xiàn)[19]中的方法鑒定，健康人來(lái)源白念珠菌為中科院微生物研究所白逢彥老師惠贈(zèng)。按照本文中方法2.2及2.3檢測(cè)3種水解酶活力差異，從中選取水解酶活力一致的4株臨床分離株，2株健康人來(lái)源的白念珠菌，具體情況見(jiàn)表1。第5 d為3種酶活力的最佳培養(yǎng)時(shí)間，胞外水解酶陽(yáng)性的菌株在達(dá)到最佳培養(yǎng)時(shí)間以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，圈層會(huì)逐漸增大，相互重疊而無(wú)法測(cè)量，而胞外水解酶陰性的菌株即使達(dá)到這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，也沒(méi)有水解圈產(chǎn)生，Pz值仍為1，文中以第10 d為過(guò)期時(shí)間，作為對(duì)照。

表1 感染小鼠所用菌株來(lái)源、三種水解酶活力及感染小鼠數(shù)量情況
Tab.1 Sources of C. albicans used to infect mice, three extracellular hydrolytic enzyme activities of these strains and the amount of the mice infected

Num. of strainsSources of isolatesSAP(Pz value)PL(Pz value)Lip (Pz value)5th day10th day5th day10th day5th day10th dayAmount of mice infectedGYWu27AIDS0.224±0.015/111116GYWu20AIDS0.220±0.012/111116GYF76VVC0.228±0.018/111116GYF006VVC0.225±0.015/111116N110Normal0.223±0.011/111116N36Normal0.218±0.014/111116Saline-------16

注：SAP:分泌型天冬氨酸蛋白酶； PL:磷脂酶； Lip:脂肪酶Pz值=菌落直徑 /(菌落直徑+圈層直徑)。Pz值=1，表示沒(méi)有水解環(huán)。

-表示陰性對(duì)照; 表示圈層過(guò)大相互重疊，無(wú)法測(cè)量

第5 d為三種酶活力的最佳培養(yǎng)時(shí)間，第10 d為過(guò)期培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2感染小鼠 各菌株均使用原代保存菌種解凍后傳于PDA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取白念珠菌菌落于生理鹽水中稀釋成濃度為2×106CFU的菌液。尾靜脈注射建立系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型。將配制好的菌液及無(wú)菌生理鹽水通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，每只注射0.2 mL,實(shí)驗(yàn)小鼠正常飼養(yǎng)，飼料充足，飲水定時(shí)更換，對(duì)小鼠生存情況進(jìn)行記錄，采用Kaplan-Meier法估計(jì)各組各時(shí)點(diǎn)的生存率及其標(biāo)準(zhǔn)誤，繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線比較。

對(duì)發(fā)病死亡小鼠進(jìn)行解剖，無(wú)菌分離雙側(cè)腎臟，迅速取雙腎，去除腎包膜，用冷生理鹽水灌洗，加入1 mL含有0.05%氯霉素的PBS緩沖液用組織細(xì)胞破碎儀勻漿。組織勻漿后，按(1∶50-1∶500)的比例用含0.05%氯霉素的PBS緩沖液稀釋, 吸取100 mL稀釋液接種到含0.05%氯霉素SAB瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，并按照文獻(xiàn)[19]中的方法鑒定后保存于-80 ℃冰箱備用。

2.2 胞外水解酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

2.2.1菌懸液制備 挑選小鼠雙腎分離白念珠菌以及感染小鼠所用的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)48 h，用無(wú)菌生理鹽水配制為5×106CFU/mL菌懸液。

2.2.2胞外水解酶活力檢測(cè) 因分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶3種酶水解對(duì)象不同[2]，可利用不同底物培養(yǎng)基分別檢測(cè)酶活性，小鼠腎臟分離菌株均接種至牛血清白蛋白培養(yǎng)基(檢測(cè)分泌型天冬氨酸蛋白酶)、卵黃培養(yǎng)基(檢測(cè)磷脂酶)、三丁酸甘油酯培養(yǎng)基(檢測(cè)脂肪酶)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并設(shè)置3次生物重復(fù)。

2.3酶活力檢測(cè)指標(biāo) 3種培養(yǎng)基達(dá)到最佳培養(yǎng)時(shí)間，平板上菌落周圍會(huì)出現(xiàn)沉淀圈或透明圈，測(cè)量菌落直徑和菌落加圈層的總直徑[9]。以 Pz值表示水解酶的表達(dá)水平。Pz值=菌落直徑 /(菌落直徑+圈層直徑)。Pz值越大，水解酶產(chǎn)生越少。Pz值≤0.59，水解酶高表達(dá)(+++)；Pz值為 0.60～0.79，水解酶中等表達(dá)(++)；Pz值為 0.80～<1.00，水解酶低表達(dá)(+)；Pz值=1 表示不產(chǎn)此水解酶(-)。通過(guò)方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié) 果

3.1小鼠發(fā)病情況 注射白念珠菌4 d后艾滋病、外陰陰道念珠病病患來(lái)源和健康人來(lái)源白念珠菌感染小鼠陸續(xù)開(kāi)始發(fā)病，初始表現(xiàn)為飲食減少，嗜睡，皮膚粘膜發(fā)紫，動(dòng)力下降，大小便不盡，接著出現(xiàn)呼吸急促，抽搐，最后死亡。

3.2繪制生存曲線 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(圖1)，并采用log-rank檢驗(yàn)顯示各組曲線間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.25，P<0.05)。各組間在7 d內(nèi)小鼠死亡率并無(wú)差異，之后各組間差異逐漸顯著，于感染后第21 d達(dá)到高峰，艾滋病病患來(lái)源組死亡小鼠20只(死亡率62.5%)，外陰陰道念珠病病患來(lái)源組死亡小鼠16只(死亡率50.0%)，外陰陰道念珠病病患來(lái)源組小鼠12只(死亡率37.5%)?？傮w而言，小鼠死亡速率最快的是艾滋病病患來(lái)源組,其他依次為外陰陰道念珠病病患來(lái)源組和健康人來(lái)源組。

圖1 不同來(lái)源白念珠菌感染的小鼠生存曲線Fig.1 Survival curves of mice infected by C. albicans from different sources

3.3不同來(lái)源白念珠菌感染的小鼠腎臟分離株 3種胞外水解酶體外表達(dá)水平 結(jié)果如圖2，感染小鼠前，體外培養(yǎng)第5 d，6株3種不同來(lái)源白念珠菌磷脂酶與脂肪酶活力均為陰性(Pz=1，-)，分泌型天冬氨酸蛋白酶活力均為陽(yáng)性且高表達(dá)(Pz<0.59，+++)，艾滋病、外陰陰道念珠病、健康人來(lái)源白念珠菌的3種酶活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.53,P>0.05)。

注：SAP:分泌型天冬氨酸蛋白酶； PL:磷脂酶； Lip:脂肪酶
圖2 不同來(lái)源白念珠菌感染小鼠前后3種胞外水解酶Pz值差異比較
Fig.2 Comparison of the activity of three extracellular hydrolytic enzymes produced by C. albicans in vitro and in mice

如圖2A，21株艾滋病病患來(lái)源、18株外陰陰道念珠病病患來(lái)源、18株健康人來(lái)源白念珠菌感染小鼠后，體外培養(yǎng)第5 d，小鼠腎臟分離株分泌型天冬氨酸蛋白酶活力皆為陽(yáng)性且高表達(dá)(Pz<0.59，+++)。分泌型天冬氨酸蛋白酶表達(dá)水平皆顯著高于感染小鼠前，分泌型天冬氨酸蛋白酶表達(dá)升高程度在不同來(lái)源菌株間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.96，P<0.05)，從高到低依次為艾滋病、外陰陰道念珠病、健康人來(lái)源白念珠菌。

如圖2B，體外培養(yǎng)第5 d，21株艾滋病病患來(lái)源白念珠菌小鼠腎臟分離株中，19株(95%)為磷脂酶活力陽(yáng)性；18株外陰陰道念珠病病患來(lái)源白念珠菌小鼠腎臟分離株中，14株(77.8%)為磷脂酶活力陽(yáng)性；18株健康人來(lái)源白念珠菌小鼠腎臟分離株未檢測(cè)到磷脂酶活力。艾滋病、外陰陰道念珠病病患來(lái)源菌株感染小鼠前后磷脂酶表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.89，P<0.05)，但艾滋病、外陰陰道念珠病病患來(lái)源菌株間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.54，P>0.05)，健康人來(lái)源菌株感染小鼠前后磷脂酶活力皆為陰性。

如圖2C，體外培養(yǎng)第5 d，21株艾滋病病患來(lái)源小鼠腎臟分離株、18株外陰陰道念珠病病患來(lái)源小鼠腎臟分離株、18株健康人來(lái)源小鼠腎臟分離株脂肪酶活力也皆為陰性，Pz值為1。

體外培養(yǎng)第10 d時(shí)，在第5 d檢測(cè)為胞外水解酶陽(yáng)性的菌株，因圈層相互重疊，無(wú)法測(cè)量；而第5 d檢測(cè)為胞外水解酶陰性的菌株仍為陰性。

4 討 論

白念珠菌是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病真菌，但當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)，可導(dǎo)致嚴(yán)重感染。分泌型水解酶是其重要的毒力因子，其中分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶等能夠介導(dǎo)白念珠菌入侵宿主組織以及逃避宿主抗真菌感染免疫，在白念珠菌致病中起了關(guān)鍵作用[2]，這3種酶活力的檢測(cè)方法早已有學(xué)者報(bào)道[16-18]，并為其他學(xué)者廣泛認(rèn)同并采用，在本研究中也采用此類方法檢測(cè)白念珠菌的水解酶活力。

本研究對(duì)艾滋病、外陰陰道念珠病病患來(lái)源和健康人來(lái)源的白念珠菌株感染小鼠前后，3種胞外水解酶活力差異進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌進(jìn)入小鼠宿主后其分泌分泌型天冬氨酸蛋白酶的量較其在體外培養(yǎng)時(shí)有明顯增多，提示在宿主體內(nèi)時(shí)其分泌型天冬氨酸蛋白酶表達(dá)能力會(huì)隨之增強(qiáng)。Staib[20]通過(guò)在系統(tǒng)性感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同的分泌型天冬氨酸蛋白酶等位基因會(huì)先后被激活，Kretschmar[21]通過(guò)建立小鼠的白念珠菌胃腸感染模型發(fā)現(xiàn)SAP4和SAP6 mRNA能在小鼠的胃中發(fā)現(xiàn)，且隨著感染進(jìn)程SAP4～6表達(dá)增加，說(shuō)明分泌型天冬氨酸蛋白酶的表達(dá)取決于感染進(jìn)程。實(shí)際上，白念珠菌感染小鼠的進(jìn)程也是白念珠菌與小鼠相互作用的過(guò)程。本研究通過(guò)分離小鼠腎臟白念珠菌檢測(cè)胞外水解酶活力的方法也證實(shí)了在小鼠腎臟中白念珠菌表達(dá)分泌型天冬氨酸蛋白酶的能力同樣與小鼠宿主的作用有關(guān)，同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)艾滋病和外陰陰道念珠病病患來(lái)源的白念珠菌進(jìn)入小鼠宿主后分泌磷脂酶的量較其在體外培養(yǎng)時(shí)也有明顯增多，不難推測(cè)艾滋病和外陰陰道念珠病病患來(lái)源的白念珠菌磷脂酶在宿主體內(nèi)時(shí)其表達(dá)能力也有所增強(qiáng)。綜合本研究?jī)?nèi)容以及其他國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果，我們推測(cè)可能是宿主相關(guān)環(huán)境因子和白念珠菌內(nèi)源基因的相互作用對(duì)白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶的表達(dá)起了重要作用，而具體的宿主相關(guān)環(huán)境因子尚需后續(xù)的研究進(jìn)一步探討。

分泌型天冬氨酸蛋白酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，3種不同來(lái)源的白念珠菌在感染小鼠后，其分泌型天冬氨酸蛋白酶的活力是有差異的，艾滋病來(lái)源的最強(qiáng)，然后依次為外陰陰道念珠病和健康人來(lái)源。同時(shí)在磷脂酶檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)未能表達(dá)磷脂酶的3種不同來(lái)源的菌株在感染小鼠宿主后，艾滋病和外陰陰道念珠病病患來(lái)源菌株能夠表達(dá)磷脂酶，而健康人來(lái)源的菌株仍為磷脂酶活力陰性。推測(cè)白念珠菌在不同的宿主環(huán)境狀態(tài)下，其分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的潛在表達(dá)能力是有差異的，即宿主的免疫狀態(tài)越弱或者菌群失調(diào)時(shí)，白念珠菌對(duì)分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的潛在表達(dá)能力越強(qiáng)。事實(shí)上，這與白念珠菌的條件致病性是一致的，在健康人體內(nèi)白念珠菌作為正常菌群與宿主共生，而在宿主免疫狀態(tài)減弱或菌群失調(diào)時(shí)，白念珠菌則會(huì)大量表達(dá)胞外水解酶作為其致病因子之一，轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒哉婢?/p>

有研究表明白念珠菌對(duì)環(huán)境具有高度的適應(yīng)能力[22]，白念珠菌所處的環(huán)境會(huì)影響其代謝，與此同時(shí)，白念珠菌可以通過(guò)調(diào)整代謝過(guò)程來(lái)適應(yīng)多變的環(huán)境。在不同的宿主環(huán)境下，白念珠菌體現(xiàn)出不同的適應(yīng)性，例如，在共生狀態(tài)下白念珠菌的適應(yīng)性表現(xiàn)為病原相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPSs)與宿主細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)的相互作用，免疫防護(hù)機(jī)制，宿主體內(nèi)的菌群平衡，以及微環(huán)境中代謝物的影響等[22]。而在致病狀態(tài)下，白念珠菌為適應(yīng)致病環(huán)境侵襲宿主則體現(xiàn)在對(duì)宿主細(xì)胞黏附性的改變、形態(tài)轉(zhuǎn)換和分泌水解酶等[23]。結(jié)合本研究分析，正因?yàn)樵诠采鸂顟B(tài)與致病狀態(tài)下，白念珠菌的適應(yīng)性有區(qū)別，所以不同來(lái)源的白念珠菌在感染小鼠后，表達(dá)胞外水解酶的能力會(huì)有所不同,病患來(lái)源的白念珠菌在小鼠宿主體內(nèi)表達(dá)分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶的能力更強(qiáng)，而健康人來(lái)源的白念珠菌則相對(duì)較弱。同時(shí)，白念珠菌對(duì)于不同胞外水解酶的表達(dá)能力也有差異，事實(shí)上，白念珠菌進(jìn)入小鼠血液后，為適應(yīng)新的宿主環(huán)境，需要分泌具有較高蛋白水解活力的分泌型天冬氨酸蛋白酶[24], 降解黏膜表面的多種保護(hù)分子為白念珠菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，并增加其黏附和侵入能力,以便其到達(dá)最適宜生長(zhǎng)的環(huán)境中，分泌型天冬氨酸蛋白酶還可裂解宿主固有免疫應(yīng)答的多種因子 (如補(bǔ)體、上皮防御蛋白、唾液乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、組織蛋白酶等)，便于白念珠菌免疫逃避[25]。同時(shí)白念珠菌分泌的磷脂酶能分別作用于甘油磷脂分子中不同的酯鍵，使甘油磷脂水解形成溶血磷脂，引起細(xì)胞損傷從而促進(jìn)白念珠菌在體內(nèi)的入侵、存活和致病，還可逃避宿主免疫防御機(jī)制[26]。脂肪酶的主要用為獲取營(yíng)養(yǎng)消化脂類[27]，有研究顯示，脂肪酶的表達(dá)譜取決于感染的組織類型[28]。Lip4～8幾乎在所有感染的盲腸組織和黏膜組織(胃、上顎、食道和舌頭)中表達(dá)；而Lip 1、Lip 3和Lip9僅在感染的胃組織中表達(dá)，在口腔組織不表達(dá)；Lip 2在感染盲腸組織中表達(dá)，但在口腔組織不表達(dá)。不難發(fā)現(xiàn)，脂肪酶所能表達(dá)的組織類型主要為脂質(zhì)豐富的組織，而白念珠菌最終所處的靶器官小鼠腎環(huán)境中脂類相對(duì)缺乏[29]，因此，在實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到脂肪酶活力也是可以理解的。

本實(shí)驗(yàn)為該類白念珠菌胞外水解酶檢測(cè)的研究提供了補(bǔ)充，同時(shí)也豐富了白念珠菌宿主環(huán)境適應(yīng)性的認(rèn)識(shí)，將為進(jìn)一步揭示致病菌與宿主相互作用的機(jī)理提供一定的依據(jù)。隨著白念珠菌其他毒力因子以及其與細(xì)菌、細(xì)胞等相互作用研究的深入，本研究的發(fā)現(xiàn)將對(duì)白念珠菌相關(guān)的臨床疾病的防治等研究提供一些有意義的線索。