2015-2016年無(wú)錫地區(qū)兒童肺炎支原體流行基因特征分析

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肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，MP流行具有周期性，每3-7年在不同地區(qū)出現(xiàn)發(fā)病率高峰，每次流行持續(xù)1-2年。2010年11月，丹麥學(xué)者通過(guò)其實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)判斷2010年冬季至2011年春季Mp感染在丹麥呈暴發(fā)流行趨勢(shì)[1]，其后在歐洲和亞洲許多國(guó)家都監(jiān)測(cè)到MP暴發(fā)流行[2]。近年來(lái)，北京地區(qū)監(jiān)測(cè)到北京地區(qū)MP感染率也有所增高，2007年及2012年出現(xiàn)暴發(fā)流行[3]。無(wú)錫地區(qū)兒童肺炎支原體感染感染率相對(duì)較高[8]，但目前針對(duì)無(wú)錫地區(qū)兒童肺炎支原體基因分型及大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢測(cè)相關(guān)的報(bào)道較少。本研究對(duì)2015-2016年無(wú)錫地區(qū)呼吸道感染中肺炎支原體的感染率、基因分子特征等進(jìn)行綜合分析，了解無(wú)錫地區(qū)MP流行特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取本院呼吸科收治呼吸道感染患兒1 129例，標(biāo)本類型為咽拭子。肺炎支原體參考菌株：本研究所用肺炎支原體陽(yáng)性參考菌株為首都兒科研究所細(xì)菌研究室保存國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株FH(ATCCl5531)。

1.2肺炎支原體檢測(cè) 采用TIANcombi DNALyse&Amp PCR Kit試劑盒對(duì)上述呼吸道標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)分布進(jìn)行。Real-time PCR法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，引物及探針參照Dumke[4]等研究方法。

1.3P1-RELP基因分型 Real-time PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本采用PCR-RFLP分析方法進(jìn)行分型[5]。

1.4MLVA基因分型 MLVA分型參照Derange等研究方法，引物參考文獻(xiàn)[6]。采用巢式PCR對(duì)肺炎支原體基因組中的5個(gè)VNTR位點(diǎn)(Mpnl、Mpnl3、Mpnl4、Mpnl5及Mpnl6)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，根據(jù)這5個(gè)VNTR中重復(fù)片段數(shù)目的組合不同，將其進(jìn)行MLVA分型。

1.5大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因突變檢測(cè) 針對(duì)肺炎支原體23S rRNA，采用首都兒科研究所細(xì)菌研究室nPCR法擴(kuò)增包含位點(diǎn)2063，2064，2067，2611及2617的片段，引物序列見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blast比對(duì)，分析點(diǎn)突變情況。

1.6數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用方差分析、計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺炎支原體感染陽(yáng)性檢出率 2015—2016年，共收集患兒呼吸道咽拭子標(biāo)本1 129例，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本98例，總陽(yáng)性率為8.68%。其中男性48例，女性50例，患兒平均年齡(4.55±2.44)歲，分為≤2歲，2～5歲，5～10歲和>10歲4組，具體分布見(jiàn)表1 ，陽(yáng)性標(biāo)本在性別、年齡上分布上差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.26，P=0.52)。

根據(jù)采集標(biāo)本的時(shí)間不同，2015年、2016年分別是44例(44/545)、54例(54/584)，陽(yáng)性感染率分別為8.07%、9.25%。2015年6-8月份共18例占陽(yáng)性標(biāo)本總數(shù)的40.9%，分別為15.2%(5/33)，11.4%(4/35)，21.9%(9/41)；2016年6-9月份共23例占總陽(yáng)性標(biāo)本總數(shù)的42.5%，分別為15.4%(8/52)，16.9%(10/59)，19.2%(5/26)，8%(4/50)。

表1 MP陽(yáng)性標(biāo)本性別、年齡分布
Tab.1 Distribution of MP positive specimens in sex and age

年齡組性別統(tǒng)計(jì)量男女χ2P值≤2982～516242.260.525～102217>1011

2.2P1基因分型 通過(guò)對(duì)P1基因的檢測(cè)，34例成功進(jìn)行了P1分型，其中P1-1型25例(73.5%)，P1-2型9例(26.5%)。根據(jù)采樣年份不同，2015年P(guān)1-1型占總數(shù)的80.95%，2016年P(guān)1-1型占總數(shù)的61.54%。圖1可見(jiàn)，P1-1型中M3-5-5-2、M4-5-6-2型各1例，M4-5-7-2型23例；P1-2型中M3-5-6-2型8例，M3-6-6-2型1例。

圖1 MLVA基因分型在P1亞型中的分布Fig.1 Distribution of MLVA genotyping in P1 subtypes

按照P1基因分型將34例樣本分為兩組并進(jìn)行臨床資料分析，結(jié)果顯示P1-1基因型MP感染患兒在住院天數(shù)上大于P1-2基因型MP感染患兒，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.67，P=0.04)。而發(fā)熱持續(xù)時(shí)間、白細(xì)胞總數(shù)、C反應(yīng)蛋白和血沉等指標(biāo)兩個(gè)基因型間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3MLVA基因分型 對(duì)98例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行5個(gè)VNTR位點(diǎn)的MLVA基因分型，其中40例標(biāo)本可以分為12個(gè)不同的基因型，其中主要的基因型為M4-4-5-7-2(32.5%)和M3-4-5-7-2(17.5%)。本次研究中，采用改良方法只分析4個(gè)VNTR位點(diǎn)，可將44例標(biāo)本有效地分為5個(gè)基因型，分別為M3-5-5-2(1/44)，M3-5-6-2(8/44)，M3-6-6-2(1/44)，M4-5-6-2(1/44)及M4-5-7-2(33/44)，其中主要的基因型為M4-5-7-2(75%)和M3-5-6-2(18.2%)。

由于M3-5-5-2、M3-6-6-2、M4-5-6-2型例數(shù)較少，僅比較M3-5-6-2和M4-5-7-2型MP感染患兒的臨床表現(xiàn)。M4-5-7-2型患兒發(fā)熱天數(shù)和總住院天數(shù)較M3-5-6-2型多，兩組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、血沉等實(shí)驗(yàn)室檢查方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表3。

表2 不同P1基因型MP患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.2 Clinical manifestations of children in different P1 genotype

臨床指標(biāo)P1基因型統(tǒng)計(jì)量P1-1P1-2F值P值發(fā)熱持續(xù)時(shí)間(d)4.44±3.143.11±2.851.240.27白細(xì)胞總數(shù)(109/L)7.95±2.618.65±3.200.420.52C反應(yīng)蛋白(g/L)8.00±8.5914.00±17.771.700.20血沉(mm/h)25.46±18.6429.22±14.330.300.59住院天數(shù)(d)8.91±2.137.33±0.714.670.04

圖2 兩種MLVA基因分型分類統(tǒng)計(jì)對(duì)比圖Fig.2 Comparison diagram of different types of MLVA genotyping

2.4耐藥基因分析 對(duì)98例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行大環(huán)內(nèi)酯類耐藥位點(diǎn)的基因檢測(cè)，其中44例完成了23S rRNA基因區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的檢測(cè)，28例為A2063G點(diǎn)突變，1例為A2063T點(diǎn)突變，耐藥基因總突變率為65.9%，其余15例未發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變。44例標(biāo)本中，33例完成了基因分型檢測(cè)，其中23例發(fā)生耐藥基因突變的標(biāo)本中21例MLVA分型為M4-5-7-2，1例為M4-5-6-2，1例為M3-5-5-2；9例未發(fā)生耐藥基因突變標(biāo)本中8例為M3-5-6-2基因型，1例為M3-6-6-2。

表3 不同MLVA基因型MP患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.3 Comparison of children’s clinical manifestations in different MLVA genotypes

臨床指標(biāo)MLVA型別統(tǒng)計(jì)量M3-5-6-2M4-5-7-2F值P值發(fā)熱持續(xù)時(shí)間(d)3.00±3.023.61±3.090.250.62白細(xì)胞總數(shù)(109/L)8.64±3.428.15±2.550.200.65C反應(yīng)蛋白(g/L)14.14±18.988.86±9.621.280.26血沉(mm/h)29.75±15.2326.52±17.530.230.64住院天數(shù)(d)7.38±0.748.63±1.933.180.08

圖3 MLVA基因分型在耐藥基因亞型中的分布Fig.3 Distribution of MLVA genotyping in drug-resistant subtypes

臨床資料分析顯示，23S rRNA基因區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因?yàn)橥蛔儯疵舾薪M在發(fā)熱持續(xù)時(shí)間、大環(huán)內(nèi)酯類藥物用時(shí)、白細(xì)胞總數(shù)、住院天數(shù)等指標(biāo)上小于耐藥組即A2063G/T點(diǎn)突變，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。敏感組C反應(yīng)蛋白和血沉兩個(gè)指標(biāo)高于耐藥組，但兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 MP肺炎耐藥基因敏感/耐藥組患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.4 Different clinical manifestations in resistant gene sensitive/resistant group

臨床指標(biāo)耐藥基因統(tǒng)計(jì)量A2063G/TSF值P值發(fā)熱持續(xù)時(shí)間(d)4.07±3.122.80±2.511.240.27大環(huán)內(nèi)酯類用時(shí)(d)3.11±3.52.33±2.790.550.47白細(xì)胞總數(shù)(109/L)8.19±2.328.05±2.910.030.87C反應(yīng)蛋白(g/L)6.89±7.1812.62±14.722.960.09血沉(mm/h)24.18±16.2927.67±14.850.480.49住院天數(shù)(d)8.70±2.018.00±1.251.500.23

3 討 論

肺炎支原體(MP)是引起兒童急性上、下呼吸道感染疾病常見(jiàn)的病原微生物。MP感染具有流行性，呈遞增趨勢(shì)其感染率約占肺炎的10%～20%。目前MP致炎機(jī)制尚不完全清楚，但國(guó)內(nèi)外針對(duì)MP基因組學(xué)研究表明MP基因型別鑒定有利于其感染流行趨勢(shì)的預(yù)測(cè)。本研究采用Real-time PCR法對(duì)呼吸道感染患兒進(jìn)行MP相關(guān)基因檢測(cè)，并分析了無(wú)錫地區(qū)MP感染情況及分子流行特點(diǎn)。

通過(guò)對(duì)無(wú)錫地區(qū)1 129例呼吸道感染患兒的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行MP-DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性標(biāo)本98例，陽(yáng)性率為8.68%，夏季好發(fā)，發(fā)病平均年齡在4～5歲，且2016年MP陽(yáng)性率(9.25%)較2015年(8.07%)上升，此趨勢(shì)與薛冠華等報(bào)道的北京地區(qū)2015—2016年MP流行趨勢(shì)一致[8]。近幾年陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道國(guó)內(nèi)各地區(qū)MP感染陽(yáng)性率，2011年大慶市[9]兒童MP檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到48.18%，2011在天津相關(guān)研究顯示[10]社區(qū)獲得性肺炎的MP陽(yáng)性率為41.8%，而孫紅妹等[11]人的數(shù)據(jù)顯示2010年北京地區(qū)MP感染率11.69%，2011年有所增加為15.56%。本次研究中MP陽(yáng)性率低于其他地區(qū)報(bào)道，一方面顯示的是MP感染的地域差異，另一方面研究中直接取樣呼吸道感染患兒的咽拭子標(biāo)本，其DNA含量較其他研究中痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等生物樣本要低，考慮檢出率低可能與DNA模板濃度低有關(guān)。

P1基因編碼的P1蛋白是MP的主要黏附素及毒力因子，也是MP黏附于呼吸道細(xì)胞表面的第一步[12]。根據(jù)不同菌株P(guān)1基因上RepMP重復(fù)序列的多態(tài)性，采用PCR-RFLP方法建立了P1基因的分型體系，可分為M129為代表的P1-1和以FH為代表的P1-2兩型。隨后研究者在日本、法國(guó)、丹麥、德國(guó)等地區(qū)發(fā)現(xiàn)MP流行周期內(nèi)均有MP P1-1和P1-2基因型別的轉(zhuǎn)換。國(guó)內(nèi)徐巧等人對(duì)西安地區(qū)還有天津地區(qū)[10]基因分型未發(fā)現(xiàn)P1-2型菌株。2010年1月至2012年5月北京地區(qū)[11]發(fā)現(xiàn)2例P1-2型(占2.90%)，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的研究[13]顯示2012-2013年期間蘇州地區(qū)發(fā)生的MP感染P1-2占總樣本數(shù)的2.88%。本次中34例標(biāo)本完成P1基因的成功分型，其中P1-1占73.5%，P1-2占26.5%，P1-2型菌株所占比例高于國(guó)內(nèi)其他區(qū)域，其中2015年19.05%，2016年38.46%，有增長(zhǎng)趨勢(shì)。有研究表明[14]日本地區(qū)8-10年發(fā)生型別轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，而型別轉(zhuǎn)換時(shí)間需要2-3年，結(jié)合本次研究，無(wú)錫地區(qū)MP感染可能出現(xiàn) P1-1型向P1-2型的型別轉(zhuǎn)換，進(jìn)而出現(xiàn)新的流行亞型。

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)，是一種基于染色體基因組中基因座上的短鏈重復(fù)區(qū)拷貝數(shù)的不同進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)的方法，2009年S.Degrange等首次將這種方法應(yīng)用于MP基因分型研究，選擇了5個(gè)TRs區(qū)域：Mpn1，Mpn13，Mpn14，Mpn15，Mpn16，將MP分為26個(gè)型別[15]。隨后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Mpn1存在不穩(wěn)定性，提出采用剩余的4個(gè)位點(diǎn)Mpn13，Mpn14，Mpn15及Mpn16可以快速、簡(jiǎn)單地檢測(cè)臨床標(biāo)本MP基因型[16-17]。本次研究中，成功分型40例臨床樣本，共分為12個(gè)不同基因型，其中M4-4-5-7-2和M3-4-5-7-2兩個(gè)基因型占總樣本數(shù)的50.0%。采用改良的4位點(diǎn)MLVA分型法成功分型44例臨床樣本，分別為M3-5-5-2(1/44)，M3-5-6-2(8/44)，M3-6-6-2(1/44)，M4-5-6-2(1/44)及M4-5-7-2(33/44)，改良MLVA分型可將MP菌株進(jìn)行更為優(yōu)化的分型。結(jié)合臨床資料分析結(jié)果顯示MLVA分型與文中所研究中患兒臨床特點(diǎn)之間并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。因此尋求更優(yōu)的基因分型仍是分析亞型的重要研究方向，這樣才能建立與臨床特征聯(lián)系，才能更好的指導(dǎo)臨床和流行病學(xué)監(jiān)控。

隨著研究不斷深入，MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)為基因突變，其中23S rRNA基因V區(qū)A2063G、A2064G、A2067G點(diǎn)突變分別與14、15、16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥相關(guān)。美國(guó)及西歐國(guó)家 MP耐藥率則普遍低于10.0%，但有增高的趨勢(shì)[18]。2002-2008年日本MP耐藥率從5.0%上升到>40.0%，2011年則高達(dá) 80.0%[19]。在亞洲多個(gè)國(guó)家Mp的耐藥率甚至超過(guò)了90%，首都兒科研究所對(duì)2009—2013年北京地區(qū)的肺炎支原體患兒感染標(biāo)本的耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)，紅霉素耐藥突變率達(dá)到90%[7]。本次研究中，發(fā)現(xiàn)28例臨床樣本23S rRNA基因2063位點(diǎn)發(fā)生A到G的耐藥突變，1例發(fā)生了A到T點(diǎn)突變，耐藥基因總突變率65.9%，低于其他各地的研究報(bào)道。臨床資料分析顯示，A2063G/T點(diǎn)突變組發(fā)熱持續(xù)時(shí)間、藥物用時(shí)、住院天數(shù)上均高于敏感組，而C反應(yīng)蛋白和血沉均低于敏感組，提示大環(huán)內(nèi)酯類相關(guān)基因突變與臨床上難治性肺炎之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步探索。

本次研究結(jié)果顯示2015—2016年無(wú)錫地區(qū)MP陽(yáng)性檢出率為8.68%，2016年MP陽(yáng)性率較2015年有上升趨勢(shì)，其中主要基因型為MP P1-1型，但P1-2基因型比例明顯高于其他各地的報(bào)道，近年有型別轉(zhuǎn)換的可能。但此次研究也發(fā)現(xiàn)MLVA分型與P1基因分型在很大程度上有重合，并未能將肺炎支原體基因型做出較大的區(qū)分度，尋求更優(yōu)的基因分型仍是分析亞型的重要研究方向，這樣才能建立與臨床特征聯(lián)系，才能更好的指導(dǎo)臨床和流行病學(xué)監(jiān)控。無(wú)錫地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因23S rRNA的2063位點(diǎn)突變率相對(duì)其他各地較低，仍需進(jìn)一步縱向監(jiān)測(cè)。